基因打靶(精美)

1、基因打靶QQ:947645776目錄一、簡介 二、什么是基因打靶三、優(yōu)點四、基因打靶的原理五、基因打靶步驟六、基因打靶技術的應用 一、簡介： 在歷經(jīng)近20年的推廣和應用后, 基因打靶技術終于獲得諾貝爾獎評審委員會的關注和肯定。 2007年10月8日, 美國科學家卡佩奇和史密斯、英國科學家埃文斯因為在利用胚胎干細胞對小鼠基因進行定向修飾原理方面的系列發(fā)現(xiàn)分享了2007年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎?；虼虬屑夹g的發(fā)明和應用革命性地改變了現(xiàn)代生物醫(yī)學研究的面貌, 并導致了生物醫(yī)學研究各個領域中的許多突破性進展。 三巨人 卡佩奇在哈佛時就是一位成果豐富的研究者，他發(fā)現(xiàn)了導致蛋白合成的分子機制。當他于1973

2、年在猶他大學建立實驗室時，便試圖將分子基因學引入到對動物細胞的研究，以便獲悉如何掌控這些細胞里的基因。卡佩奇于1977年開始一系列實驗室研究，這些研究展現(xiàn)了對動物細胞進行基因打靶的技術，并在1989年成功對一只老鼠進行基因打靶。 Mario R. Capecchi 史密斯1925年出生在英國，后獲得美國國籍。史密斯1951年獲得牛津大學生物化學博史密斯和卡佩基幾乎同時對“基因靶向”技術做出了奠基性貢獻。他目前的研究方向主要集中在兩個方面：一是對異形基因進行修正，另外一個便是利用人類基因病變構造動物模型，以發(fā)現(xiàn)新的疾病治療方法。多年來，奧利弗-史密西斯教授及其助手深入研究了“基因打靶”的具體操作

3、方法，并借助這項技術治療地中海貧血癥。 Oliver Smithies 埃文斯1941年出生在英國，1963年從劍橋大學畢業(yè)后，進入倫敦大學學院學習，獲得解剖學和胚胎學博士學位。1978年，他返回劍橋大學工作。3年后，他和同事從小鼠胚胎中第一次成功分離出未分化的胚胎干細胞。這為“基因靶向”技術提供了施展本領的空間。如今，埃文斯在英國加的夫大學擔任哺乳動物遺傳學教授。 Sir Martin J. Evans基因打靶（gene targeting）是指外源DNA與受體細胞染色體DNA上的同源序列之間發(fā)生重組，并整合在預定位點，改變細胞遺傳特性的方法。建立在胚胎干細胞（embryonic stem

4、cell，ES細胞）與同源重組技術基礎之上的基因打靶技術是一種定向改變生物活體遺傳信息的實驗手段。 三、優(yōu)點： 基因打靶所適應的細胞既可以是原核細胞，也可以是真核細胞；基因打靶能把外源基因引入染色體DNA 的特定片段上；在設計合理的情況下基因打靶可對宿主細胞染色體基因進行精細的改造;基因打靶后被擊中的基因或新引入的基因隨染色體DNA 的復制而穩(wěn)定復制。 進行基因打靶，首先要設計和合成一個將要導人靶細胞的靶載體(targeting vector)。該載體不僅含有需要插入的DNA序列，其兩端還含有與靶基因座上的序列相同的核苷酸片段即同源重組指導序列。將此載體用基因轉移的方法導人靶細胞通過外源載體和

5、內源靶位點相同的核苷酸序列之間的同源重組(homologous recombination，HR)，使外源DNA定點整合到靶細胞的特定的基因座上。 生物界同源重組現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，為基因打靶奠定了堅實的理論基礎，而胚胎干細胞技術的發(fā)展，促進了基因打靶的廣泛應用。 同源重組(Homologous recombination)又稱一般性重組或非特異性重(General recombination)，是指相似的DNA交換遺傳信息的過程, 外源DNA片段可與宿主基因組的相應片段發(fā)生交換（即重組）。ES細胞是一類具有在體外培養(yǎng)條件下保持未分化狀態(tài)的增殖能力及分化為多種細胞類型的細胞。1.1. 重組基因載體的構

6、建重組基因載體的構建2. 2. 轉化受體細胞轉化受體細胞3.3. 篩選篩選4.4. 鑒定鑒定1.1.重組基因載體的構建重組基因載體的構建把目的基因和同源重組指導序列重組到帶有標記基因的載體上?；蛲粗亟M的發(fā)生依賴于同源序列的長度，目前認為3O40bp的同源序列長度將是發(fā)生同源重組的保險線，重組率與同源序列長度呈正比，一般情況下同源重組指導序列為基因組DNA而不用cDNA，以免造成基因組缺失或其他改變?；虼虬休d體包括載體骨架、靶基因同源序列和突變序列及選擇性標記基因等。 基因打靶載體類型：基因插入型載體(Gene-insertion vector)：插入型載體中與靶基因同源的區(qū)段中含有特異的

7、酶切位點，線性化后，同源重組導致基因組序列的重復，從而干擾了目標基因的功能。基因置換型載體(Genereplacement vector)：置換型載體進行線性化的酶切位點在引導序列和篩選基因外側，線性化后，同源重組使染色體DNA序列為打靶載體序列替換。大多數(shù)基因敲除突變都采用置換型載體大多數(shù)基因敲除突變都采用置換型載體進行基因打靶。進行基因打靶。 2.2.轉化受體細胞轉化受體細胞外源DNA導人的方式主要有顯微注射法、電穿孔法、逆轉錄病毒法、DNA-磷酸鈣共沉淀法等。目前應用最廣的是顯微注射法。 顯微注射每次只能注射一個細胞； 電穿孔法可同時使許多細胞得到轉染。Mansour等研究發(fā)現(xiàn)電穿孔可使

8、1的ES細胞穩(wěn)定轉染； 逆轉錄病毒載體法利用某些病毒與組織細胞有特異的親合力，可用于時空特異性基因打靶，在人類疾病的基因治療方面具有較大的發(fā)展?jié)摿Α?正負雙向選擇系統(tǒng)(positive-negative-selection, PNS)。 構建載體時，在靶基因的同源區(qū)序列中插入正選擇標記，在同原序列的3和5兩個末端接上負選擇標記。同源重組時，只有載體的同源區(qū)以內以內部分發(fā)生重組，同源區(qū)以外部分將被切除隨機整合時，是在載體的兩端將整個載體連入染色體內。 正選擇基因多為新霉素抗性基因（neo）基因，位于同源區(qū)內，其在隨機整合和同源重組中均可正常表達 負選擇基因常用單純孢疹病毒的胸腺尿嘧啶激酶基因（H

9、SV-tk），在靶基因同源區(qū)之外在靶基因同源區(qū)之外，位于載體的3末端， 以藥物G148和GANG（丙氧鳥苷）作雙重選擇。neo 基因的產(chǎn)物使細胞具有G 418抗性而HSV一tk， 基因的產(chǎn)物則使內氧鳥苷變成毒性核苷酸從而致死。用G418篩選所有能表達neo 基因的細胞然后用GANG淘汰所有H5 一旗f 常表達的細胞剩下的細胞為命中的細胞。無毒的丙氧鳥苷（GANC） 毒性核苷酸 殺死細胞 腺苷激酶蛋白4.鑒定觀察被擊中細胞的生物學特性并進行分子生物學檢測?？梢杂锰禺怭CR方法鑒定，PCR 引物一端以基因組DNA 的特定基因座為模板，另一端以導人的外源基因為模板這樣保證擴增后的片段為同源重組產(chǎn)生的

10、特殊片段。對經(jīng)PCR鑒定的克隆用Southern雜交產(chǎn)生特殊帶譜的方法來進一步確定同源重組克隆。 六、基因打靶技術的應用基因打靶技術與小鼠胚胎干細胞技術結合，產(chǎn)生了近千種轉基因小鼠品系對于大動物的胚胎干細胞還沒有成功的報道，但已成功的用培養(yǎng)的體細胞進行基因打靶。PPI 公司的研究人員在原代綿羊和豬細胞中進行了基因打靶并通過體細胞核移植，獲得了帶有目的基因的克隆羊。基因打靶在植物上的應用研究才剛起步。Park JM等人對擬南芥ADL1基因進行了基因敲除。Ruf S等對煙草進行基因打靶發(fā)現(xiàn)了一個新的與光系統(tǒng)I相關的基 。 基因打靶技術在微生物領域有廣泛的應用。在80年代利用酵母35S rDNA 作為同源序列將外源基因捅入到酵母rDNA 區(qū)，使外源基因得到穩(wěn)定表達。在隨后的研究中人們利用酵母的rDNA作為同源序列構建了一系列高轉化效率、高拷貝插入及高度表達的打靶載體。在寄生蟲學的研究中也應用了基因打靶技術，利用此技術制備利什曼原蟲的減毒活蟲疫苗已進入臨床前期研究。 基因打靶技術是近十余年發(fā)展起來的分子生物學技術。它克服了隨機整合的