重組干擾素教材

1、重組干擾素Alick和Jean發(fā)現(xiàn)干擾素病毒感染的細(xì)胞能產(chǎn)生一種因子作用于其他細(xì)胞并干擾病毒的復(fù)制。1957什么是干擾素什么是干擾素/wiki/Interferon (retrieved on January 3, 2016 )Passage Downloaded from / on December 29, 2015Friedman發(fā)現(xiàn)干擾素抗病毒的作用機(jī)制抑制病毒的信使RNA功能1966-1971干擾素的作用機(jī)制干擾素的作用機(jī)制Finlay McNab, Katrin M

2、ayerBarber, Alan Sher, Andreas Wack and Anne OGarra“Type I interferons in infectious disease”. Nature reviews. Immunology : 87103. 2015,2脊椎動物感染病毒體細(xì)胞脊椎動物感染病毒體細(xì)胞干擾素細(xì)胞因子干擾素細(xì)胞因子IFN激活激活I(lǐng)SGs(interferon stimulated genes)相鄰細(xì)胞及受感染細(xì)胞相鄰細(xì)胞及受感染細(xì)胞抗病毒蛋白抗病毒蛋白免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞使細(xì)胞裂解使細(xì)胞裂解抗病毒抗體抗病毒抗體干擾素用于臨床用純化的人白細(xì)胞干擾素成功治療2例慢性乙肝患

3、者，但是由于人白細(xì)胞干擾素原材料來源有限，未能大量應(yīng)用于臨床。1976關(guān)于乙肝關(guān)于乙肝張焜和,乙肝病毒感染的基礎(chǔ)與臨床,江西科學(xué)技術(shù)出版社,1999年07月第1版,第34頁高翔.乙肝病毒攜帶者健康歧視的法律規(guī)制研究D.福建:華僑大學(xué), 2007.嗜肝DNA病毒：HBV本身無毒害：慢性發(fā)作：我國1.2億乙肝病毒攜帶者頑強(qiáng)生命力引起免疫反應(yīng)損壞肝臟干擾素治療乙肝：抗病毒作用免疫調(diào)節(jié)作用抗纖維化作用干擾素的分類及應(yīng)用干擾素的分類及應(yīng)用干擾素I型干擾素IFN-IFN-IFN-IFN-II型干擾素IFN-III型干擾素IL10R2IFNLR1/wiki/In

4、terferon (retrieved on January 3, 2016 )主要適應(yīng)癥： 幾乎能夠抵抗所有病毒引起的感染 目前主要用于乙肝、丙肝的治療獲得重組干擾素科學(xué)家們用基因工程技術(shù)在大腸桿菌及酵母菌細(xì)胞內(nèi)獲得了重組人干擾素。1980資金來源多樣化1999199919861986 2002200219961996 200220022003200319891989體外誘生制備: Sendai誘導(dǎo)人白細(xì)胞人源轉(zhuǎn)化細(xì)胞系培養(yǎng):多亞型混合干擾素基因工程E.Coli 發(fā)酵:重組人干擾素工程CHO細(xì)胞系構(gòu)建動物無限細(xì)胞系培養(yǎng)假單胞桿菌工程菌發(fā)酵 IFN-n3批準(zhǔn)上市工藝復(fù)雜 產(chǎn)量低: 1g=3億m

5、l 來源困難價(jià)格昂貴 潛在血源性病毒污染 IFN -n1/Wellferon 首次實(shí)現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn) 活性低 退出臨床應(yīng)用無糖基化 無N-met 無活性包涵體166aa糖基化蛋白22.5 ku分泌表達(dá)產(chǎn)量低成本高過程嚴(yán)格IFN -2b/Alferon安福隆 無糖基化可溶性蛋白具有天然分子結(jié)構(gòu)具有生物活性生產(chǎn)工藝的發(fā)展生產(chǎn)工藝的發(fā)展甘樂能上市世界上第一個(gè)重組人干擾素 IFN-2bIntron A由美國Schering Plough公司上市，被FDA批準(zhǔn)于治療慢性乙肝。1986甘樂能適應(yīng)癥: 本品用于慢性乙型肝炎，慢性丙型肝炎，腎細(xì)胞癌，惡性黑色素瘤等疾病的治療。用法用量：皮下注射。不良反應(yīng)：常

6、見為發(fā)熱、疲乏、頭痛和肌痛。禁忌：對重組干擾素-2b及其所含組分有過敏史的患者禁用。禁止使用本品和利巴韋林聯(lián)合治療。注意事項(xiàng)：本品含穩(wěn)定劑間-苯甲酚，某些患者可對此發(fā)生過敏反應(yīng)。詳見說明書。一個(gè)重組干擾素的典型事例A specific example of recombinant IFN生產(chǎn)工藝制劑研究給藥方式市場分析研究進(jìn)展1重組人干擾素生產(chǎn)工藝基因工程假單胞桿菌的構(gòu)建與保藏干擾素的發(fā)酵工藝過程干擾素的分離純化工藝過程產(chǎn)工藝構(gòu)建與保藏發(fā)酵分離純化菌種建立菌種特性菌種庫工作菌種庫干擾素-2b基因的克隆表達(dá)載體的構(gòu)建工程菌的構(gòu)建 制備白細(xì)胞病毒誘導(dǎo)分離mRNA反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA、PCRATGT

7、GTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGGTTGCCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCACACGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTCGAAGCCTGTGTGATACAGGG

8、GGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTCAGGAAATACTTCCAAAGAATCACCTCTACTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAATGA參考文獻(xiàn)：孔曉清，張憶疆.假單孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn) -2b 干擾素工藝,2010 構(gòu)建與保藏發(fā)酵分離純化菌種建立菌種特性菌種庫工作菌種庫干擾素-2b基因的克隆表達(dá)載體的構(gòu)建工程菌的構(gòu)建IFN基因連接質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli篩選鑒

9、定陽性克隆測序：人人IFN-2b基因序列，基因序列，501bp，165aapVG3參考文獻(xiàn)：元英進(jìn)， 制藥工藝學(xué) ，2007，P223 構(gòu)建與保藏發(fā)酵分離純化菌種建立菌種特性菌種庫工作菌種庫干擾素-2b基因的克隆表達(dá)載體的構(gòu)建工程菌的構(gòu)建 轉(zhuǎn)化腐生型假單胞桿菌 篩選高表達(dá)、穩(wěn)定遺傳的工程菌 獲得原始菌種參考文獻(xiàn)：元英進(jìn)， 制藥工藝學(xué) ，2007，P223 構(gòu)建與保藏發(fā)酵分離純化菌種建立菌種特性菌種庫工作菌種庫 具有宿主菌的特征：細(xì)菌：革蘭氏陰性菌，有莢膜，無芽孢，桿狀。菌落：直徑2.5-3.0 mm，灰綠色半透明狀，粘稠。生化特性：Ser，L-Val、D/L-Arg和L-Thr為碳源。 工程菌

10、的特征：SmR、TcR、ApR 具有生產(chǎn)干擾素能力構(gòu)建與保藏發(fā)酵分離純化菌種建立菌種特性菌種庫工作菌種庫加入甘油 原始菌種 傳代擴(kuò)增 凍干保藏 QC：菌種特性、生產(chǎn)能力、質(zhì)粒穩(wěn)定性 菌種檢查合格后，方可投產(chǎn)。構(gòu)建與保藏發(fā)酵分離純化菌種建立菌種特性菌種庫工作菌種庫主菌種庫或上一代工作菌種庫 OD值 8.0 種子 罐 培養(yǎng)搖瓶種子培養(yǎng)培養(yǎng) 基 Ependorf 管 OD值 5.5 離 心 構(gòu)建與保藏發(fā)酵分離純化發(fā)酵過程發(fā)酵控制生產(chǎn)菌種搖瓶培養(yǎng)活化種子罐培養(yǎng)放大發(fā)酵罐培養(yǎng)菌體收集發(fā)酵液降溫發(fā)酵液離心菌體冷凍保存配制培養(yǎng)基蒸汽滅菌原料構(gòu)建與保藏發(fā)酵分離純化發(fā)酵過程發(fā)酵控制發(fā)酵條件控制菌體生長與干擾素合

11、成關(guān)系1.5-3h生長最快，干擾素合成在3.5h后，4h最大培養(yǎng)基組成種子培養(yǎng)基：C/N低 發(fā)酵培養(yǎng)基：C/N高 pH控制：加入緩沖體系DO控制 高時(shí)，產(chǎn)物明顯提高；質(zhì)粒的穩(wěn)定性提高策略：加大轉(zhuǎn)速，增加通氣量，必要時(shí)用純氧溫 度前期控制在30，保證菌體快速生長后期控制在20積累產(chǎn)物，同時(shí)防止產(chǎn)物降解PH值菌體生長：pH 6.8產(chǎn)物積累：pH 6.0 策略：兩段培養(yǎng)泡沫控制 機(jī)械除泡和消泡劑共同使用構(gòu)建與保藏發(fā)酵分離純化分離工藝純化工藝溶解粗干擾溶解粗干擾素素 沉淀與疏水沉淀與疏水層析層析陰離子交換陰離子交換層析與濃縮層析與濃縮陽離子交換陽離子交換層析與濃縮層析與濃縮凝膠過濾層凝膠過濾層析析無菌

12、過濾分無菌過濾分裝裝檢測菌體裂解菌體裂解預(yù)處理預(yù)處理初級分離初級分離構(gòu)建與保藏發(fā)酵分離純化分離工藝純化工藝溶解粗干擾溶解粗干擾素素 沉淀與疏水沉淀與疏水層析層析陰離子交換陰離子交換層析與濃縮層析與濃縮陽離子交換陽離子交換層析與濃縮層析與濃縮凝膠過濾層凝膠過濾層析析無菌過濾分無菌過濾分裝裝檢測菌體裂解菌體裂解預(yù)處理預(yù)處理初級分離初級分離2 2制劑研究和給藥方式干擾素注射制劑鼻腔內(nèi)給藥系統(tǒng)長效干擾素制劑 產(chǎn)工藝產(chǎn)工藝024487296120144168192半衰期平均4小時(shí)1 血清干擾素濃度為零1 病毒重新出現(xiàn)2降低腎臟排泄 避免酶水解避免免疫細(xì)胞清除普通干擾素聚乙二醇化干擾素WHY PEGXu

13、ZX, et al. Hepatology. 1998; 28(suppl): 702A. Lam N, et al. Hepatology. 1997; 26: 22631.PEG分子量 半衰期 抗病毒活性高(長) 低(短)30KD30KD5KD5KD12KD延長半衰期與保留活性之間的最佳平衡WHY 12KD佩樂能u 1989-1999年，多亞型人天然干擾素混合物IFN-N3 和IFN-N1 獲批上市。由于人天然干擾素因其產(chǎn)量低、活性低且具有潛在的血源性病毒污染等特點(diǎn)而逐漸退出市場。u 1987年，Amgen公司生產(chǎn)的復(fù)合干擾素產(chǎn)品Infergen（重組集成干擾素注射液）獲批上市，主要用于成

14、年患者的慢性丙型肝炎治療，不過其市場表現(xiàn)平平。u 1990年，InterMune公司上市了第一個(gè)rh IFN-產(chǎn)品Actimmune，用于慢性肉芽腫病，重度惡性骨骼石化癥等疾病的治療。u 1993年，Bayer公司上市第一個(gè)rh IFN-1b產(chǎn)品Betaseron，用于多發(fā)性硬化癥（MS）的治療。u 2001年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)Schering Plough公司的長效干擾素聚乙二醇IFN- 2b，使得給藥頻率減少為1周1次。u 2014年7月和8月，Biogen Idec公司的長效IFN- 1a產(chǎn)品Plegridy（聚乙二醇干擾素-1a）獲歐盟和FDA批準(zhǔn)上市，用于治療成人多發(fā)性硬化癥（MS），其劑

15、量為每兩周一次。3 3市場分析和研究進(jìn)展第二大重組蛋白五巨頭壟斷全球市場新型競爭藥物沖擊疾病譜差異國內(nèi)新藥進(jìn)展產(chǎn)工藝產(chǎn)工藝資料來源：FDA招商證券第二大重組蛋白干擾素長效rh-IFN短效rh-IFNBiogen Idec公司：Avonex（IFN-1a）Merck Serono公司：Rebif（IFN- 1a）Bayer公司：Betaferon/Betaseron（IFN-1b）Novartis公司：Extavia（IFN-1b）Roche公司：Pegasys（PEG IFN- 2a）美國MSD公司：Peg-Intron（PEG IFN- 2b）近期獲批：Plegridy（聚乙二醇干擾素-1a

16、）第二大重組蛋白2003-2013年重組干擾素在全球的銷售額由45.1億美元增加到91.5億美元僅次于重組人胰島素，為全球第二大重組蛋白藥物，年復(fù)合增長率為7.33%。五巨頭壟斷全球干擾素市場全球銷售額為91.5億美元:Biogen IdecMerck SeronoBayerRocheMSD2013年，前五大公司占據(jù)約98%市場份額，從產(chǎn)品的分類看：干擾素占據(jù)約79%份額，干擾素占據(jù)約21%。受新型競爭藥物沖擊兩支長效干擾素成為丙肝和乙肝的一線用藥。近年來，新的核苷類似物口服藥物已占據(jù)乙肝用藥主流，以Sovaldi為代表的突破性療法的口服新藥正在改變丙肝的治療習(xí)慣。干擾素在MS治療地位的產(chǎn)品。

17、普通干擾素的升級Plegridy（聚乙二醇干擾素-1a）獲批上市，有望成為干擾素市場重要推動力。疾病譜差異導(dǎo)致國外IFN-國內(nèi)IFN-全球干擾素市場中以復(fù)發(fā)型多發(fā)性硬化癥為主要適應(yīng)癥的IFN-的市場占比逐年提高，而作為抗肝炎病毒的IFN-的市場份額卻在逐年萎縮。如圖6所示，國內(nèi)基本以IFN-為主。疾病譜差異導(dǎo)致國外IFN-國內(nèi)IFN-全球大約有250萬人受MS的困擾。歐美發(fā)病率較高，中國發(fā)病率較低。歐美乙肝和丙肝感染人數(shù)較低，中國擁有全球數(shù)量最多的乙肝和丙肝患者，導(dǎo)致國內(nèi)外干擾素產(chǎn)品結(jié)構(gòu)差異較大。國內(nèi)干擾素新藥的研發(fā)情況u 在長效干擾素這一領(lǐng)域中，通化東寶的子公司廈門特寶公司的產(chǎn)品進(jìn)展速度最快

18、，已于14年1月向國家藥監(jiān)局申請生產(chǎn)；另外安科生物的長效干擾素新藥也于14年6月獲批臨床試驗(yàn)，雙鷺?biāo)帢I(yè)于14年4月申請臨床試驗(yàn)。u 在干擾素領(lǐng)域，目前還只有海正藥業(yè)一家企業(yè)在開展新藥研發(fā)工作，并于13年6月申請臨床試驗(yàn)。 取保存工作種子批菌種，室溫融化取保存工作種子批菌種，室溫融化 搖瓶活化培養(yǎng)：搖瓶活化培養(yǎng)：30，pH7.0，250 r/min，182h 檢測：檢測：OD值和發(fā)酵液雜菌檢查。值和發(fā)酵液雜菌檢查。1）搖瓶培養(yǎng)）搖瓶培養(yǎng) 干擾素生產(chǎn)工藝發(fā)酵工藝過程 接種：接入接種：接入30L種子罐，接種量種子罐，接種量10% 培養(yǎng)：培養(yǎng)：30，pH7.0 控制：級聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速控制：級聯(lián)

19、調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速 DO為為30%，34h，OD4.0 檢測：顯微鏡和檢測：顯微鏡和LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌。培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌。2）種子罐培養(yǎng)）種子罐培養(yǎng) 干擾素生產(chǎn)工藝發(fā)酵工藝過程 接種：通入接種：通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，接種量培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，接種量 10%。 控制：級聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速?？刂疲杭壜?lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速。前前4h：30，pH7.0，DO為為30%4h后：后：20，pH6.0，DO為為60%，56.5h終點(diǎn)控制：終點(diǎn)控制：OD值達(dá)值達(dá)9.01.0，5冷卻水快冷卻水快 速降溫至速降溫至15以下以下 檢測：發(fā)酵液雜菌檢查檢測：發(fā)酵液雜菌檢查3）發(fā)酵罐培養(yǎng)）發(fā)酵

20、罐培養(yǎng) 干擾素生產(chǎn)工藝發(fā)酵工藝過程 連續(xù)流離心機(jī)：冷卻的發(fā)酵液，連續(xù)流離心機(jī)：冷卻的發(fā)酵液，16000 r/min離心收集。離心收集。 菌體保存：菌體保存：20冰柜，不超過冰柜，不超過12個(gè)月。個(gè)月。 檢測：干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、檢測：干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、 質(zhì)粒結(jié)構(gòu)一致性、質(zhì)粒穩(wěn)定性。質(zhì)粒結(jié)構(gòu)一致性、質(zhì)粒穩(wěn)定性。4）菌體收集）菌體收集 干擾素生產(chǎn)工藝發(fā)酵工藝過程 種子培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基：C/N比較低的培養(yǎng)基比較低的培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基：發(fā)酵培養(yǎng)基：C/N比較高的培養(yǎng)基比較高的培養(yǎng)基 pH控制：加入緩沖體系控制：加入緩沖體系2、培養(yǎng)基、培養(yǎng)基的配制的配制 干擾

21、素生產(chǎn)工藝發(fā)酵工藝過程 DO：高時(shí)，產(chǎn)物明顯提高；同時(shí)質(zhì)粒的穩(wěn)定性提高：高時(shí)，產(chǎn)物明顯提高；同時(shí)質(zhì)粒的穩(wěn)定性提高 策略：加大轉(zhuǎn)速，增加通氣量，必要時(shí)用純氧策略：加大轉(zhuǎn)速，增加通氣量，必要時(shí)用純氧3、DO控制控制 干擾素生產(chǎn)工藝發(fā)酵工藝過程 溫度：要考慮菌體生長和產(chǎn)物的積累溫度：要考慮菌體生長和產(chǎn)物的積累 策略：前期控制在策略：前期控制在30，保證菌體快速生長，后期控制在，保證菌體快速生長，后期控制在 20積累產(chǎn)物，同時(shí)防止產(chǎn)物降解積累產(chǎn)物，同時(shí)防止產(chǎn)物降解4、溫 度 干擾素生產(chǎn)工藝發(fā)酵工藝過程 菌體生長：菌體生長：pH 6.8 產(chǎn)物積累：產(chǎn)物積累：pH 6.0 策策略：兩段培養(yǎng)略：兩段培養(yǎng)5、

22、pH 值值 干擾素生產(chǎn)工藝發(fā)酵工藝過程 裂解緩沖液：裂解緩沖液：純化水，純化水，210（pH7.5） 使用保護(hù)劑：使用保護(hù)劑：EDTA、DTDE、PMSF 破碎破碎-20菌體：菌體：2厘米厘米 攪拌：加裂解緩沖液，攪拌：加裂解緩沖液，210，2hr 凍融凍融: 細(xì)胞完全破裂，釋放干擾素。細(xì)胞完全破裂，釋放干擾素。1、菌體裂解、菌體裂解 一定的pH條件下，細(xì)胞破裂，加入表面活性劑(SDS、Triton X-100 而獲得。而pH 環(huán)境則由加入的強(qiáng)堿(NaOH) 或緩沖液 提供。在一定的pH 環(huán)境下，表面活性劑或強(qiáng)離子劑可使細(xì)胞裂解將細(xì)胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和

23、剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。 分離純化工藝干擾素生產(chǎn)工藝 加絮凝劑加絮凝劑聚乙烯亞胺聚乙烯亞胺：210，攪拌，對菌體碎片，攪拌，對菌體碎片 進(jìn)行絮凝。進(jìn)行絮凝。 加凝聚劑醋酸鈣溶液：加凝聚劑醋酸鈣溶液：210,攪拌，對菌體碎攪拌，對菌體碎 片、片、DNA等進(jìn)行沉淀。等進(jìn)行沉淀。 離心：離心： 連續(xù)流離心機(jī)：連續(xù)流離心機(jī)：210，16000 r/min 收集上清液：含有重組干擾素蛋白質(zhì)收集上清液：含有重組干擾素蛋白質(zhì) 雜質(zhì)沉淀：雜質(zhì)沉淀：121、30min 蒸汽滅菌，焚燒處理。蒸汽滅菌，焚燒處理。2、預(yù)處理、預(yù)處理 菌體自溶、核酸、蛋白質(zhì)及其它有機(jī)粘性物質(zhì)造成的渾濁，如果不經(jīng)

24、過適當(dāng)?shù)念A(yù)處理就直接進(jìn)行過濾或離心沉降，不但速度極慢，甚至得不到澄清的蛋白質(zhì)分離純化工藝干擾素生產(chǎn)工藝 鹽析鹽析: 4M硫酸銨，硫酸銨，210，攪勻靜置過夜。，攪勻靜置過夜。 離心：連續(xù)流離心機(jī)，離心：連續(xù)流離心機(jī)，16000 r/min 保存：收集沉淀，粗干擾素，保存：收集沉淀，粗干擾素，4。3、初級分離、初級分離 分離純化工藝干擾素生產(chǎn)工藝1、溶解粗干擾素、溶解粗干擾素 配制純化緩沖液：超純水，配制純化緩沖液：超純水，pH7.5磷酸緩沖液，磷酸緩沖液，0.45 m濾器和濾器和10 ku超濾系統(tǒng)，百級層流下收集。冷卻至超濾系統(tǒng)，百級層流下收集。冷卻至210。 檢查：緩沖液的檢查：緩沖液的pH

25、值和電導(dǎo)值。值和電導(dǎo)值。 溶解：溶解：210，勻漿，完全溶解。，勻漿，完全溶解。分離純化工藝干擾素生產(chǎn)工藝2、沉淀與疏水層析、沉淀與疏水層析 等電點(diǎn)沉淀（等電點(diǎn)沉淀（1）：磷酸調(diào)節(jié)至）：磷酸調(diào)節(jié)至pH 5.0，沉淀雜蛋白，離，沉淀雜蛋白，離心收集上清液。心收集上清液。 疏水層析：干擾素吸附在疏水層析柱中，疏水層析：干擾素吸附在疏水層析柱中， 除去非疏水性除去非疏水性蛋白。蛋白。 洗脫與收集：洗脫與收集：0.01M磷酸緩沖液（磷酸緩沖液（pH8.0）。）。分離純化工藝干擾素生產(chǎn)工藝2、沉淀與疏水層析 等電點(diǎn)沉淀（等電點(diǎn)沉淀（2）：磷酸調(diào)節(jié)）：磷酸調(diào)節(jié)pH4.5，調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)電導(dǎo)值電導(dǎo)值40 mS/cm，210，靜置過夜，靜置過夜 超濾：超濾：1000 ku超濾膜過濾，除去大蛋白。超濾膜過濾，除去大蛋白。 透析除鹽：調(diào)整溶液透析除鹽：調(diào)整溶液pH 8.0，10 ku超濾膜，超濾膜，0.005 M緩沖液。緩沖液。分離純化工藝干擾素生產(chǎn)工藝3、陰離子交換層析與濃縮 0.01M磷酸緩沖液（磷酸緩沖液（pH8.0）平衡樹脂）平衡樹脂 鹽濃度線性梯度鹽濃度線性梯度550 mS/cm進(jìn)行洗脫進(jìn)行洗脫 配合配合SDS-PAGE收集干擾素峰收集干擾素峰 濃縮：調(diào)整溶液和電導(dǎo)，濃縮：調(diào)整溶液和電導(dǎo)