生物畢業(yè)論文doc3

1、 學術論文題 目：抗體酶的研究與應用進展 類 別：綜述型學 院：生物科學與工程學院專業(yè)班級：生物工程1102班學生姓名：閆超杰 （1112024045）劉青（1112024049） 陳建 （1112024053）周游（1112024050） 楊柚柳椰（1112024047）牛犇（1112024048） 2012年4月28號抗體酶的制備與應用研究進展閆超杰，劉青，陳建，周游，楊柚柳椰，牛犇 （陜西理工學院 生物科學與工程學院 生物工程專業(yè) 陜西 漢中 723000） 指導老師 陳琛內容摘要：抗體酶是具有催化性質的抗體，它同時具備抗體和酶的特征，可催化多種化學反應，如?；D移、酯水解、酰胺水解、重

2、排反應、光誘導反應、氧化還原分應、金屬螯合反應等。用人工方法合成的抗體酶，可作為研究酶作用機理的有力工具，用于催化大量天然酶不能催化的立體專一性反應，更為開發(fā)具有高度選擇性的藥物提供了新途徑。本文對抗體酶的設計策略、制備方法、催化反應類型、及應用前景作了綜述。關 鍵 詞：抗體酶,過渡態(tài)類似物,應用 抗體酶（Abzyme）是一種新型人工酶制劑，它是依據對酶分子催化反應機制的理解，結合免疫球蛋白的分子識別特性，應用免疫學、細胞生物學、化學、分子生物學等技術制備的具有高度底物專一性及特殊催化活力的新型催化抗體并且具有典型的酶反應特性：與配體（底物）結合的專一性，包括立體專一性并且其催化反應的專一性可

3、以達到甚至超過天然酶的專一性；具有高效催化性，一般抗體酶催化反應速率比非催化反應快104108倍，有的反應速度已接近于天然酶促反應速度；抗體酶還具有與天然酶相近的米氏方程動力學及pH依賴性等。如今由于抗體酶的多樣性、特異性和穩(wěn)定性，已經形成了生物界中一個嶄新的超分子體系，它把免疫學、酶學理論的發(fā)展和抗體在醫(yī)藥、工業(yè)等領域的應用推向一個新水平。近些年來，其研究的技術日益先進，應用范圍不斷拓寬，越來越受科學家們的關注。1 抗體酶的制備1.1 抗體酶的設計策略 目前大多數(shù)抗體酶是通過以設計合理的，將反應過渡態(tài)類似的小分子作為半抗原，繼而讓動物免疫系統(tǒng)產生針對半抗原的抗體來獲得的。最早的設計策略涉及運

4、用過渡態(tài)類似物制備抗體酶，隨后，酶催化的化學本質如鄰近反應、酸堿催化、共價催化等也用于抗體酶的設計。目前，抗體酶的設計策略有：穩(wěn)定帶電過渡態(tài)、誘導和轉換設計、抗體作為熵阱效應、反應免疫、引入催化基因團。1.1.1穩(wěn)定帶電過渡態(tài) 以過渡態(tài)類似物作為半抗原，利用免疫系統(tǒng)的分子多樣性，則有可能誘導產生對過渡態(tài)類似物特異性結合的抗體。這種抗體含有同底物反應過渡態(tài)互補的結合空腔，因而和酶一樣，也能發(fā)生催化反應。1.1.2誘導和轉換設計 誘導和轉換設計的原理是利用半抗原和抗體間的電荷互補性，即以帶電基團為“誘餌”，在抗體結合部位誘導帶相反電荷的功能團，當?shù)孜锊淮嬖凇罢T餌”的電荷時，被誘導的功能團將以一般酸

5、堿或親核催化對底物其它基團發(fā)生作用。1.1.3抗體作為熵阱效應 除穩(wěn)定帶電過渡態(tài)外，熵阱效應對催化反應也有決定性作用。熵阱是指催化劑以有利的定位方向結合底物的能力，因此限制了底物平動和旋轉自由度，結果導致活性部位中底物的有效濃度增加。1.1.4反應免疫 通過使用一個能和抗體發(fā)生反應的化合物作為免疫原，促使抗體結合部位在免疫過程中發(fā)生特定的化學反應，誘導過程中抗體和抗原發(fā)生共價相互作用，產生的抗體同樣也可能催化類似的反應。1.1.5引入催化基團 在抗體酶的結合部位引入催化基團，如果引入的催化基團與底物結合部位取向正確，空間排布恰到好處，則應產生高活力抗體酶。引入催化基團的方法有：利用部位選擇性試

6、劑，以類似親和標記的方式定向的將催化基團引入抗體；用蛋白質工程技術引入帶催化基團的氨基酸殘基。1.2 抗體酶的制備方法 制備抗體酶的方法有很多，如誘導法、拷貝法、化學修飾法、引入輔助分子法、天然來源抗體酶、基因工程法等。酶的基本概念如張力 、鄰近效應、酸堿催化和共價催化等被用于抗體酶的設計。1.2.1誘導法 即單克隆技術也稱為雜交瘤技術或體內免疫法來制備。因為過渡態(tài)極不穩(wěn)定，是一種稍縱即逝的結構，其壽命約為 s,因此不可能用它對動物進行免疫。用一個或其它幾個原子或原子團取代過渡態(tài)的特定原子或原子團獲得在形狀、電性、酸堿性等諸方面與過渡態(tài)相似的穩(wěn)定物質，即過渡態(tài)相似物，然后用它作為半抗原和載體蛋

7、白一起對動物進行免疫，最后取免疫動物的脾細胞與骨髓腫瘤細胞進行雜交，其雜交細胞就會源源不斷地分泌單克隆抗體，進過篩選和純化，可得抗體酶。在抗體酶的制備中，由于大多數(shù)反應過渡態(tài)類似物的分子質量都較低，即所謂的半抗原，它們本身的免疫原性很弱，必須與某種載體偶聯(lián)才能表現(xiàn)免疫原性，最常見的載體蛋白包括牛血清蛋白（bovine serum albumin, BSA）和鑰孔血藍蛋白（keyhole limpet hemocyanin, KLH）。而抗體酶單克隆的方法也不斷發(fā)展?，F(xiàn)有酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)、競爭性酶聯(lián)免疫吸附法（competivc ELISA)、催化酶聯(lián)免疫吸附法（catELISA）以

8、及用短過渡態(tài)類似物片段進行篩選等多種方法。國內鄧超用meso四（a，a，a，a0苯乙酰苯）卟啉為抗原，通過動物免疫、細胞融合等技術篩選細胞株3E4。該細胞株產生的抗體具有結合鐵卟啉的能力，且表現(xiàn)出過氧化物酶活力。 1.2.2拷貝法 用已知的酶作為抗原免疫動物，通過單克隆技術，制得抗該種酶的抗體，再以此種抗體免疫動物，再次采用單克隆技術，經篩選與純化，就可獲得具有原來酶活性的抗體。因為抗原與該抗原產生的抗體具有互補性，經過上述兩次拷貝，就把酶的活性部位的信息翻錄到抗體酶上，使該抗體酶能高選擇性地催化原酶所催化的反應。這種方法雖然不能產生新的催化反應，但對自然界來源稀少的緊缺酶，不失為一種有效的方

9、法。1.2.3化學修飾法 抗體酶和酶一樣也可以用化學修飾法的方法加以改造。對抗體酶進行結構修飾的關鍵是找到一種溫和的方法，在抗體結合位置或附近引入具有催化功能的基團。游離巰基就是適合的基團之一，具有高親和性、易于氧化及能通過二硫化物進行交換反應或親電反應而選擇性修飾的特點。1.2.4引入輔助因子法 很多天然酶活性中心都含有金屬離子。將引入某輔助因子的半抗原通過共價鍵連接在載體蛋上免疫后產生的抗體，在金屬離子復合物作為輔助因子的參與下，這些抗體酶能選擇性地對肽鍵進行水解。1.2.5天然來源抗體酶 在全身紅斑狼瘡病人的血清中已分離出抗體酶，它具有催化水解DNA的活性。表明在有免疫性缺陷的病人體內存

10、在著抗體酶。1.2.6基因工程法-噬菌體展示技術 通過基因工程、蛋白質工程將編碼的人工合成的基因轉入細菌或酵母菌的表達系統(tǒng)，采用突變等手段隨機產生抗體，經篩選和純化可得抗體酶。隨著DNA重組技術的進展和人們對抗體分子認識的深化，抗體技術由細胞工程抗體（雜交瘤單克隆抗體）發(fā)展到基因工程抗體，尤其是噬菌體抗體庫技術的出現(xiàn)，將抗體工程推進到了一個新的發(fā)展階段。隨后在噬菌體抗體庫技術的基礎上，人們又發(fā)展了噬菌體演示技術。這種技術將組建億萬種不同特異性抗體可變區(qū)基因庫和抗體在大腸埃希菌功能性表達與高效快速的篩選手段結合起來，徹底改變了抗體酶制備的傳統(tǒng)途徑，使抗體酶的制備和性能改良進入了新的階段。噬菌體演

11、示技術不需要進行細胞融合以獲得雜交瘤細胞，并且可篩選具有特定功能的未知結構，具有生產簡單、價格低、降低抗體的免疫原性、易獲得稀有抗體的優(yōu)點，因而顯示出有取代雜交瘤技術的趨勢。2 抗體酶的催化反應類型 抗體酶具有典型的酶反應特征：與配體結合的專一性（包括立體專一性），可以達到甚至超過天然酶的專一性；具有高效性，比非催化反應快倍，有些已經接近天然酶反應速度；具有與天然酶相近的米氏動力學及pH依賴性等。由于抗體酶是人工設計的酶，理論上其催化范圍可以十分廣泛，隨著半抗原設計和抗體酶篩選技術的不斷發(fā)展，其品種還在不斷增加。催化的反應類型也在擴大，其中有些反應沒有天然的酶可以催化，抗體酶甚至可以使熱力學上

12、無法進行的反應得以進行。抗體酶催化的反應類型包括酯水解、酰胺水解、?；D移、光誘導反應、氧化還原反應、Claisen重排反應、金屬螯合反應等。2.1 磷酸酯水解反應 磷酸二酯鍵是自然界最穩(wěn)定的鍵之一，因此它的水解對抗體酶來說是個主要的挑戰(zhàn)。Janda等利用穩(wěn)定的五配位氧代錸（V）配合物A模擬RNA水解時形成的環(huán)形氧代正膦中間物，產生單抗2G12，可以催化水解磷酸二酯。催化速率常數(shù)=1.53×，米氏常數(shù)=240 umol/L ；/=312。2.2 磺酸酯閉環(huán)反應 Lerner小組用脒基離子化合物（一種陽離子過渡態(tài)類似物）作為半抗原，產生的抗體（17G8）可以催化芳基磺酸酯B的閉合反應，

13、使B轉化為C(1,6- 二甲基環(huán)己烯）和D（2-甲烯-1-甲基環(huán)己烷）的混合物。2.3 ?；D移反應生物體內蛋白質合成是一個復雜的過程。氨基酸在摻入肽鏈之前 必須進行活化以獲得額外能量，活化過程即?；D移反應，又稱?；磻?。1986年，Tramonatano 等成功研制首列?；D移抗體酶。Jacolson等設計了一個中性磷酸二酯作為反應過渡態(tài)的穩(wěn)定類似物，得到的單克隆抗體可以催化帶丙氨酸的胸腺嘧啶的氨?；磻磻俾时葻o催化反應的速度提高了倍。2.4 重排反應Claisen重排反應是有機化合物異構化的一種重要形式，分枝酸鹽轉化為預苯酸鹽的反應是細菌、真菌、植物體內芳香氨基酸生物合成的關鍵一步

14、。Hilvert等設計了一個椅式構象的氧雜雙環(huán)化合物作為反應的過渡態(tài)類似物，制備出了可催化分枝酸生成預苯酸這樣一個Clasien重排反應的酶，誘導的抗體酶比原反應速度加快倍。而且還觀察到新抗體酶表現(xiàn)出了高度的立體專一性，它只催化（-）分枝酸為底物的反應，對（+)公枝酸無作用。2.5 氧化-還原反應氧化還原反應在生物體內十分廣泛，如呼吸鏈上的系列反應。Shokat制得了對氧化態(tài)=8 mmol/L，對還原態(tài)=300 nmol/L的抗體，使標準電位變?yōu)?40 mV。由于黃素還原態(tài)的還原范圍擴大，使一些原來無法按其還原的物質（標準還原電位差大于無抗體酶催化的黃素標準還原電位差）得以還原。這意味著抗體酶

15、可以使熱力學上原來無法進行的氧化還原反應得以進行。2.6 金屬螯合反應金屬螯合反應對于輔酶、輔因子和酶的結合來說意義重大。P.G.Schultz等用G-甲基卟啉誘導產生的抗體可催化平面狀卟啉的金屬螯合反應，該抗體不僅可催化和卟啉的螯合，還可催化和卟啉的螯合。實驗表明，抗體酶對其中某些金屬卟啉具有很高的親合力，意味著可以研制抗體血紅素復合物為催化劑催化氧還反應，電子傳遞反應等。2.7 光誘導反應光誘導反應包括光聚合反應和光裂解反應。這兩類反應在植物體內顯得尤為重要。DNA的修復也涉及到光誘導反應，Cochran對胸腺嘧啶二聚體光解進行研究，發(fā)現(xiàn)天然光復活酶的活性中心是色氨酸，由此找到相應的抗體酶

16、IgG15F1-3B1，此抗體的轉換數(shù)（T.N.）和光復活酶相近。Balan研究了光聚合反應的抗體酶，通過誘導法，得到的抗體酶催化效率雖不高，但也使反應速度提高了2.5倍。3 抗體酶的利用價值 從抗體酶的實踐看出，抗體酶是研究酶作用機理的有力工具。酶抑制劑的研究支持了Pauling過渡態(tài)理論，但它只能提供作用過程中結合專一性的信息，不能給出結合后發(fā)生催化反應以及結合與催化之間的關系?？贵w酶實驗則彌補了這一缺陷。 除了基礎理論研究的價值，抗體酶的應用前景也令人鼓舞。Lerner指出，若將催化水解反應的抗體酶研究深入下去，極有可能得到一種新型蛋白酶，這種抗體酶在醫(yī)學上可用來專一破壞病毒蛋白質及清除

17、體內“垃圾”。Lerner還提到，將具有立體專一性的抗體酶應用 于制藥工業(yè)，將有助于解決對映體拆分的難題。隨著制備抗體酶新方法的不斷發(fā)展，抗體酶的催化反應的范圍將進一步拓寬特別是對那些天然酶不能催化的反應，則可研制抗體酶來進行催化。 其次，抗體酶的研究，為人們提供了一條合理途徑去設計適合于市場需要的蛋白質，即人為地設計制作酶。這是酶工程的一個全新領域。例如：利用動物免疫系統(tǒng)產生抗體的高度專一性，可以得到一系列高度專一性的抗體酶，成為針對性強、藥效高的藥物，于是生產高純度立體專一性的藥物成為現(xiàn)實。又如：以某個生化反應的過渡態(tài)類似物來誘導免疫反應，產生特定抗體酶，以治療某種酶先天性缺陷的遺傳病?？?/p>

18、體酶還可有選擇地使病毒外殼蛋白的肽鍵裂解，從而防止病毒與靶細胞結合。另外，抗體酶的固定化已獲得成功，將大大地推進工業(yè)化進程。4 存在的問題與展望 抗體酶的研究雖然已經取得了長足的發(fā)展，但是目前所得到的抗體酶的催化效率還較低，其根本原因是由于使用過渡態(tài)類似物制備抗體，過渡態(tài)類似物畢竟不是過渡態(tài)本身，其形狀、電性、鍵長、鍵角、極性等均有差異，其轉動和振動能級也不相同。因此，要得到高效率的抗體酶，選擇過渡態(tài)類似物是關鍵，過渡態(tài)類似物的選擇依賴于人們對反應過渡態(tài)的全面了解，而化學反應的過渡態(tài)極不穩(wěn)定，有些即使在攝氏零下幾十度，仍然難以將其俘獲。另外天然酶催化反應中有許多輔助因子參加，如何將輔助因子引入

19、到抗體酶中以拓寬抗體酶研究值得探索。同時，對多酶體系或是單酶體系通過多個基元完成的催化反應，中間要經過多個過渡態(tài)，如何用單一過渡態(tài)類似物誘導出高效率的抗體酶也是富有挑戰(zhàn)性的問題。雖然在抗體酶的研究上存在一些問題，但抗體酶的重要價值卻引起了化學家、生物學家、免疫學家及酶學研究者的格外關注?？贵w酶是當今科學前沿多學科的交叉領域，它突破了傳統(tǒng)的膠束、配位化合物、印跡分子等模擬酶的框架，開辟了嶄新的模擬酶研究方向和催化劑研究的新領域，無論是在理論探索方面或是實際應用方面都已顯示出潛在的應用價值。 參考文獻1 由德林. 酶工程原理M. 北京：科學出版社，2011.2 梅樂和，岑沛霖.現(xiàn)代酶工程M. 北京

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