G試驗(yàn)-侵襲性真菌病的輔助診斷方法

1、1唐麗娟容目錄 一、真菌感染概一、真菌感染概 湛江安度斯生物有限公司是查爾斯河公司設(shè)在中國的子公司，是中國細(xì)菌內(nèi)毒素檢測試劑的最大供應(yīng)商，也是中國細(xì)菌內(nèi)毒素檢測領(lǐng)域的技術(shù)領(lǐng)導(dǎo)者和創(chuàng)新先鋒； 世界著名的美洲鱟試劑（LAL）生產(chǎn)企業(yè)美國CR恩度斯弗公司（Charles River Endosafe, Inc.），也是查爾斯河實(shí)驗(yàn)室公司的子公司湛江安度斯的簡介Charles River Laboratories 作為全球最大的實(shí)驗(yàn)動物公司，Charles River Laboratories一直是全球?qū)嶒?yàn)動物商業(yè)化繁育和市場供應(yīng)的領(lǐng)導(dǎo)者，擁有分布在北美、歐洲和日本的15個(gè)分

2、設(shè)施和遍布全球的銷售網(wǎng)絡(luò)；已成為一個(gè)生物醫(yī)學(xué)前臨床產(chǎn)品和服務(wù)的主要供應(yīng)商。庫珀博士 C R Endosafe（恩度斯弗） 公司是美國著名三大鱟試劑企業(yè)之一,有國際知名權(quán)威學(xué)者詹母斯 弗.庫珀博士(Dr. Jammes F.Cooper)創(chuàng)建。庫珀博士是細(xì)菌內(nèi)毒素檢查研究領(lǐng)域的先驅(qū)。1971年他與Lein 及 Banger等人提出以鱟實(shí)驗(yàn)法檢查熱源，并率先證明了鱟實(shí)驗(yàn)法作為注射藥品熱源檢查的敏感方法的價(jià)值。1972年他協(xié)助美國(The parentral Drug Association) 的鱟試劑.他一直主持著美國非經(jīng)腸道藥物協(xié)會(The parenteral Drug Associatoin

3、)的鱟實(shí)驗(yàn)應(yīng)用促進(jìn)工作,以及每年一屆的美國南卡羅納州查爾頓的鱟實(shí)驗(yàn)學(xué)術(shù)會議。 庫珀博士創(chuàng)建的 Endosafe 公司現(xiàn)以成為美國鱟試劑(LAL)市場最大的供應(yīng)商.該公司的鱟試劑以其良好的穩(wěn)定性,廣泛的適用性以及優(yōu)越的抗干擾性能享譽(yù)國際醫(yī)藥工業(yè)界.一、真菌感染概述一、真菌感染概述真菌感染 ：真菌感染在通常情況下我們最常見的是表皮的感染，例如頭癬、體癬、甲癬等，由于侵犯的部位大都表淺，不會導(dǎo)致嚴(yán)重問題，因而叫淺部真菌感染；深部真菌感染則是真菌突破人體天然屏障導(dǎo)致組織臟器的感染。7美國死于感染性疾病的十大原因美國死于感染性疾病的十大原因820820圍產(chǎn)期圍產(chǎn)期828828真菌真菌1010105310

4、53胃腸道胃腸道13051305圍產(chǎn)期圍產(chǎn)期9 912591259結(jié)核結(jié)核12771277肝膽管肝膽管8 823702370真菌真菌13771377胃腸道胃腸道7 745964596肝膽管肝膽管14021402細(xì)菌性腦膜炎細(xì)菌性腦膜炎6 655775577心臟心臟23332333肺結(jié)核肺結(jié)核5 513, 41313, 413腎臟腎臟/ /泌尿道泌尿道24862486心臟心臟4 416, 52416, 524HIV/AIDSHIV/AIDS80068006腎臟腎臟/ /泌尿道泌尿道3 322, 39622, 396敗血癥敗血癥94389438敗血癥敗血癥2 287,18187,181呼吸道呼吸道

5、56, 96656, 966呼吸道呼吸道1 1死亡人數(shù)死亡人數(shù)感染類型感染類型死亡人數(shù)死亡人數(shù)感染類型感染類型1997199719801980真菌感染的死亡率上升了真菌感染的死亡率上升了3.43.4倍倍 （死亡率：（死亡率：0.72.4 /100,0000.72.4 /100,000）8 EORTC/MSG原稱侵襲性真菌感染（IFI），修訂后改稱IFD； 是指真菌侵入人體，在組織、器官或血液中生長、繁殖，并導(dǎo)致炎癥反應(yīng)及組織損傷的疾病。 是真菌感染致死的重要原因侵襲性真菌病侵襲性真菌病(Invasive Fungal (Invasive Fungal Disease ,IFD)Disease

6、,IFD)9侵襲性真菌病已變得越來越常見侵襲性真菌病已變得越來越常見10侵襲性真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)侵襲性真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)G試驗(yàn)可作為擬診病例的微生物學(xué)標(biāo)志11主要可引發(fā)侵襲性真菌病的疾病主要可引發(fā)侵襲性真菌病的疾病腫瘤類：腫瘤類：胃癌，肝癌，肝內(nèi)膽管癌，胃癌，肝癌，肝內(nèi)膽管癌，肺癌，多發(fā)性骨髓瘤，白肺癌，多發(fā)性骨髓瘤，白血病，惡性淋巴瘤血病，惡性淋巴瘤12二、真菌與葡聚糖2022-5-23131. 某些真菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)2. 細(xì)胞壁含有葡聚糖組分的真菌：（1）是導(dǎo)致侵襲性真菌病(IFD)的常見真菌。（2）細(xì)胞壁有葡聚糖組分2022-5-2314這類真菌有：念珠菌曲霉菌耶氏肺孢菌鐮刀酶隱球菌 接合

7、菌 .2022-5-2315隱球菌病、接合菌病占真菌病比例不高16 當(dāng)人體深部受這類真菌感染時(shí)，真菌在代謝過程會不斷釋放出葡聚糖。檢查患者的血液（血漿或血清），會發(fā)現(xiàn)葡聚糖含量明顯高于非感染者。因此，葡聚糖可作為具有這種細(xì)胞結(jié)構(gòu)的真菌感染標(biāo)識物。2022-5-2317三、鱟試驗(yàn)與G試驗(yàn)1. 鱟（Hu，后）試驗(yàn)2022-5-2318 鱟是地球上最古老的海洋生物之一，已有三億多年的歷史，人們稱它為“活化石”。雌雄2022-5-2319 研究發(fā)現(xiàn)，鱟的循環(huán)細(xì)胞（阿米巴細(xì)胞）中含有一種特殊的凝固酶原。這種凝固酶原可以被自然界廣泛存在的兩種物質(zhì)激活為凝固酶，從而導(dǎo)致一系列的生化反應(yīng)。這兩種物質(zhì)就是脂多糖

8、(Lipopolysaccharide, LPS)和(1-3)-D葡聚糖。2022-5-2320 人們利用鱟的阿米巴細(xì)胞溶胞物制人們利用鱟的阿米巴細(xì)胞溶胞物制備成了鱟試劑（備成了鱟試劑（LALLAL或或TALTAL）。通常稱）。通常稱使用鱟試劑檢測脂多糖（使用鱟試劑檢測脂多糖（LPSLPS）或）或 - -葡葡聚糖（聚糖（ -G-G）的試驗(yàn)為鱟試驗(yàn)（）的試驗(yàn)為鱟試驗(yàn)（LAL LAL Test or TALTest or TAL TestTest）。）。2022-5-23212. 2. 鱟試驗(yàn)反應(yīng)機(jī)理鱟試驗(yàn)反應(yīng)機(jī)理223. 鱟試驗(yàn)的應(yīng)用應(yīng)用I：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查(Bacterial Endotoxin

9、 Test, BET)2022-5-2323 研究發(fā)現(xiàn)，革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁都含有一種叫內(nèi)毒素(Endotoxin)的組分。2022-5-2324 內(nèi)毒素是能夠引起哺乳動物原反應(yīng)的主要熱原物質(zhì)。 革蘭氏陰性細(xì)菌在新陳代謝過程不斷地向環(huán)境釋放內(nèi)毒素，污染藥品和醫(yī)療器械。因此注射藥品和醫(yī)療器械都要求必須作細(xì)菌內(nèi)毒素檢查（BET）。2022-5-2325應(yīng)用應(yīng)用IIII：革蘭氏陰性菌脂多糖檢測革蘭氏陰性菌脂多糖檢測2022-5-2326 細(xì)菌內(nèi)毒素的化學(xué)成分是脂多糖。當(dāng)人體深部感染革蘭氏陰性菌時(shí)，細(xì)菌會在體內(nèi)不斷釋放內(nèi)毒素（脂多糖）。檢查患者的血液（血漿）、腹水、尿液及腦脊液，會發(fā)現(xiàn)脂多糖明顯高于

10、非感染者。 脂多糖檢測對敗血癥、嚴(yán)重器官衰竭的快速輔助診斷有臨床價(jià)值。2022-5-2327應(yīng)用應(yīng)用IIIIII：真菌真菌(1-3)-(1-3)- -D-D葡聚糖葡聚糖檢測檢測2022-5-2328 醫(yī)學(xué)上通常把用于檢測真菌葡聚糖的鱟試驗(yàn)稱為G試驗(yàn)。這是取葡聚糖的英文名稱Glucan的首字母來命名該試驗(yàn)。2022-5-2329 需要指出的是，隱球菌的細(xì)胞壁雖然有葡聚糖組分，在隱球菌感染患者的血液中卻檢測不出葡聚糖異常。這可能與隱球菌具有特殊的細(xì)胞被膜有關(guān)。因此G試驗(yàn)不適合對隱球菌感染的檢測。2022-5-2330四、四、G G試驗(yàn)試驗(yàn)臨床意義臨床意義31G G試驗(yàn)的臨床意義試驗(yàn)的臨床意義32G

11、 G試驗(yàn)的臨床意義試驗(yàn)的臨床意義333435G G試驗(yàn)應(yīng)用科室試驗(yàn)應(yīng)用科室36373839404142434445464748495051侵襲性真菌感染的臨床檢測方法對比侵襲性真菌感染的臨床檢測方法對比方法特點(diǎn)傳統(tǒng)檢查直接培養(yǎng)真菌法敏感性低，耗時(shí)長, 培養(yǎng)陽性率低。培養(yǎng)結(jié)果是定性的，有些標(biāo)本采集困難輔助方法：臨床表現(xiàn)，免疫學(xué)，病理學(xué)，影像學(xué)檢查等。觀察期不確定，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，特征性不明顯并對醫(yī)師的專業(yè)水平要求高。非傳統(tǒng)檢查1.G實(shí)驗(yàn)：通過檢測(1-3)-D-葡聚糖的含量，判斷是否有真菌感染。耗時(shí)短，靈敏度高，特異性強(qiáng)，無創(chuàng)、定量檢測可判斷感染嚴(yán)重程度2.GM實(shí)驗(yàn)：曲霉屬半乳甘露聚糖抗原檢測。判斷是

12、否曲霉屬真菌感染。檢測曲霉菌感染。 3.PCR技術(shù)：真菌的抗原、抗體及代謝產(chǎn)物的血清學(xué)檢查和真菌核酸檢測。用于實(shí)驗(yàn)室檢測，已成為這一領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。52產(chǎn)品特點(diǎn)產(chǎn)品特點(diǎn)53七、七、“生物探針生物探針”的臨床比對的臨床比對 試劑試劑 標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品 -G試劑試劑 LPS試劑試劑安度斯安度斯 -G標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品500pg/ml/無反應(yīng)(4500秒)LPS標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品1.0EU/ml無反應(yīng)(4500秒)/試劑陰性試劑陰性 陰性(4500秒)/陰性(4500秒)/J廠家的-G試劑、LPS試劑均無特異性54最低檢測限最低濃度重復(fù)性廠商安度斯最低檢測限10pg/ml編號檢測結(jié)果(pg/ml)陰性(pg/ml)

13、 檢測日期110.3 1.3 3.6210.1 311.049.859.8610.8710.1810.099.61010.3 CV=6.85%1110.0129.81310.7149.81512.41610.3179.7189.6199.4209.9219.6測試次數(shù)測試次數(shù)樣本類型樣本類型12345678910CVCV陽性陽性（高值）（高值）858.8858.8870.870.1 1834.834.1 1856856826.826.1 1896.896.3 3902.902.3 3831.831.4 4826.826.1 1936.936.2 24.34%4.34%灰區(qū)灰區(qū)（中值）（中值）1

14、68.9168.9185.185.5 5153.153.8 8147.147.1 1153.153.8 8142.142.8 8145.145.3 3155.155.8 8145.145.7 7146.146.7 78.59%8.59%陰性陰性（低值）（低值）37.737.738.738.736.536.537.937.943.441.641.644.244.444.47.59%7.59%批內(nèi)精密度測試次數(shù)測試次數(shù)樣本類型樣本類型12345678910CVCV陽性陽性（高值）（高值）971.971.9 9836.836.8 8995.995.8

15、8800.800.1 1881.881.6 6887.887.5 5847.847.7 7911.911.4 4856856887.887.5 56.4%6.4%灰區(qū)灰區(qū)（中值）（中值）129129124.124.6 6114114109.109.8 8104.104.3 3125.125.2 2132.132.1 1142.142.1 1156.156.1 1166.166.9 914.514.5% %陰性陰性（低值）（低值）31.734.734.727.327.333.633.637.837.937.940.940.9

16、11.2% %批間精密度“生物探針生物探針”的臨床比對的臨床比對58八、八、G G試驗(yàn)的影響因素試驗(yàn)的影響因素2022-5-23591. 檢測試劑的靈敏度1.1 葡聚糖的量值與標(biāo)準(zhǔn)品2022-5-23602022-5-2361 目前G試驗(yàn)中葡聚糖采用的單位為重量單位“pg”。pg是一個(gè)非常非常微量的單位。因此G試驗(yàn)是一項(xiàng)非常靈敏的生物檢測。當(dāng)然，越是靈敏精確的檢測，越容易受到干擾。 目前葡聚糖沒有公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)！ 沒有國際標(biāo)準(zhǔn)品，沒有國家標(biāo)準(zhǔn)品，也沒有公認(rèn)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品，只有企業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)控品）2022-5-2362 各企業(yè)的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的來源不一。有的來自茯苓多糖，有的來自香菇多糖，有的來自

17、海藻多糖。不同來源的葡聚糖對鱟試劑的活性不同。 各企業(yè)的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)不一。你的1pg可能相當(dāng)我的10pg。相互之間無可比性。2022-5-2363 無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)品導(dǎo)致不同廠家試劑盒有不同的參考值。有的是10pg為陽性，有的是100pg為陽性。 對參考值的表示各廠家也有所不同。有的以全血含量來表示，有的以檢測濃度來表示。2022-5-23641.2 試驗(yàn)器具對G試驗(yàn)有重要的影響！ 葡聚糖是自然界廣泛存在的一種物質(zhì)，極容易污染到試驗(yàn)器具。 葡聚糖是一種非常穩(wěn)定的物質(zhì)，通常的蒸煮高壓、輻照等滅菌手段不能徹底破壞葡聚糖。很難找到真正意義的無葡聚糖的器具。2022-5-2365 G試驗(yàn)使用到的實(shí)驗(yàn)器

18、具： 采血針 采血管（瓶） 反應(yīng)試管 移液器具（吸頭）最主要的污染來自采血管！2022-5-2366重要建議 最好使用廠家供應(yīng)的專用采血管（瓶） 其次是用經(jīng)廠家檢測合格的采血管 不能使用未經(jīng)檢測的實(shí)驗(yàn)器具2022-5-2367 尊重科學(xué)，為患者負(fù)責(zé)！ 無效試驗(yàn)是對患者最大的危害！2022-5-23682.試劑的生物特異性 如前所述，G試驗(yàn)的檢測試驗(yàn)就是鱟試劑。鱟試劑可以對兩種物質(zhì)反應(yīng)，用于不同的用途。如下圖表示。 檢測內(nèi)毒素/脂多糖 用于革蘭氏陰性菌檢測鱟試劑 檢測葡聚糖（G試驗(yàn)） 用于真菌檢測 2022-5-2369 在檢測試劑制備上，應(yīng)根據(jù)試劑的用途制備生物特異性強(qiáng)的檢測試劑，如： 用于檢測細(xì)菌脂多糖的試劑，不能對葡聚糖產(chǎn)生反應(yīng)。 用于檢測真菌葡聚糖的試劑，不能對脂多糖產(chǎn)生反應(yīng)。2022-5-2370 遺憾的是，由于技術(shù)的原因，并不是所有遺憾的是，由于技術(shù)的原因，并不是所有廠家的試劑都具有生物特異性。廠家的試劑都具有生物特異性。 有的試劑盒對LPS和-G都反應(yīng)。 有的試劑盒對非檢測對象低濃度時(shí)可能不反應(yīng)，較高