ELISA知識簡介

1、ELISA ELISA 知識簡知識簡介介1.ELISA的原理的原理2.ELISA的類型的類型3.試劑準備試劑準備：免疫吸附劑免疫吸附劑 結合物結合物 酶底物的準備酶底物的準備 4.對照設定對照設定5.標本的采取和保存標本的采取和保存6.結果判斷結果判斷 ELISA ELISA是一種免疫測定（是一種免疫測定（immunoassayimmunoassay，IAIA） 。基。基礎礎: :抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。加入抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關，由

2、此進行定性的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關，由此進行定性或定量分析。或定量分析。1.ELISA的原理的原理酶免疫測定類型酶免疫測定類型 這種固相酶免疫測定方法在這種固相酶免疫測定方法在19711971年最初建立時稱為酶聯(lián)年最初建立時稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測定（免疫吸附劑測定（Enzyme Linked ImmunoSorbentEnzyme Linked ImmunoSorbent AssayAssay），簡稱），簡稱ELISAELISA。酶免疫技術酶免疫技術酶免疫組化酶免疫組化酶免疫測定酶免疫測定均相酶免疫測定均相酶免疫測定非均相酶免疫測定非均相酶免疫測定固相酶免疫測定固相酶免疫測定液相酶免疫測

3、定液相酶免疫測定1.11.1抗原抗體反應抗原抗體反應 1.1.11.1.1可逆性可逆性 抗原與抗體結合形成抗原抗體復合物的過程是一種抗原與抗體結合形成抗原抗體復合物的過程是一種動態(tài)平衡，其反應式為：動態(tài)平衡，其反應式為：Ag+AbAgAg+AbAgAbAb 抗體的親和力（抗體的親和力（affinityaffinity），可以用平衡常數(shù)），可以用平衡常數(shù)K K表表示：示：K=AgK=AgAbAbAgAbAgAb ,Ag ,AgAbAb的解離程度與的解離程度與K K值有值有關。關。高親和力抗體的抗原結合點與抗原的決定簇在空高親和力抗體的抗原結合點與抗原的決定簇在空間構型上非常適合，兩者結合牢固，不

4、易解離。間構型上非常適合，兩者結合牢固，不易解離。解離解離后的抗原或抗體均能保持原有的結構和活性。后的抗原或抗體均能保持原有的結構和活性。1.1.21.1.2特異性特異性 抗原抗體的結合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結合抗原抗體的結合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結合位點之間。化學結構和空間構型互補關系，具有高度的位點之間。化學結構和空間構型互補關系，具有高度的特異性。特異性。 測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。1.1.31.1.3最適比例最適比例 1.1.41.1.4敏感性敏感性化學比色法的敏感度為化學比色法的敏感度為mg/mlmg/ml水平水平酶反應測

5、定法的敏感度約為酶反應測定法的敏感度約為5-10g/ml5-10g/ml免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應法免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應法相仿相仿標記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達標記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達ngng/ml/ml水平水平例如，例如，HBsAgHBsAg，其敏感度可達，其敏感度可達0.1ng/ml0.1ng/ml。1.41.4免疫測定在臨床檢驗中的應用免疫測定在臨床檢驗中的應用由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗

6、體作為試劑就可檢測標本中相應的抗原，因此免疫測定的應試劑就可檢測標本中相應的抗原，因此免疫測定的應用范圍極廣。用范圍極廣。2 2ELISAELISA的類型的類型 ELISA ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：測定方法中有三個必要的試劑：（1 1）固相的抗原或抗體，即）固相的抗原或抗體，即 免疫吸附劑免疫吸附劑 （immunosorbentimmunosorbent）；（2 2）酶標記的抗原或抗體，稱為）酶標記的抗原或抗體，稱為 結合物結合物 （conjugateconjugate）；（3 3）酶反應的底物。）酶

7、反應的底物。 可設計出各種不同類型的檢測方法?？稍O計出各種不同類型的檢測方法。 2.2.12.2.1雙抗體夾心法測抗原雙抗體夾心法測抗原此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAgHBsAg、HBeAgHBeAg、AFPAFP等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于，就可用于包被固相載體包被固相載體和制備和制備酶結合物酶結合物而建立此法而建立此法。2.2.2 2.2.2 雙抗原夾心法測抗體雙抗原夾心法測抗體 用特異性抗原進行包被和制備酶結合物。此法中用特異性抗原進行包被和制備酶結合物。此法中受檢標本不需稀釋

8、，可直接用于測定，因此其敏感度受檢標本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標志物中抗相對高于間接法。乙肝標志物中抗HBsAgHBsAg的檢測常采用的檢測常采用本法。本法關鍵在于酶標抗原的制備，應根據(jù)抗原結本法。本法關鍵在于酶標抗原的制備，應根據(jù)抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。構的不同，尋找合適的標記方法。2.2.3 2.2.3 間接法測抗體間接法測抗體 傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用利用同一酶標抗抗體同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。建立檢測相應抗體的方法。2.2.4 2.2.4 競爭法測抗體競

9、爭法測抗體 當抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的當抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。 2.2.5 2.2.5 競爭法測抗原競爭法測抗原 小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個以上的小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個以上的位點位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合。標本中抗原量含量愈多，抗原競爭與固相抗體結合。標本中抗原量含量愈多，結合

10、在固相上的酶標抗原愈少，最后的顯色也愈淺。結合在固相上的酶標抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等小分子激素、藥物等ELISAELISA測定多用此法。測定多用此法。2.2.6 2.2.6 捕獲包被法測抗體捕獲包被法測抗體IgMIgM的檢測常用于傳染病的診斷。用抗人的檢測常用于傳染病的診斷。用抗人IgMIgM抗體包被抗體包被固相，以捕獲血清標本中的固相，以捕獲血清標本中的IgMIgM（其中包括針對抗原的（其中包括針對抗原的特異性特異性IgMIgM抗體和非特異性的抗體和非特異性的IgMIgM）。）。此法常用于病毒此法常用于病毒性感染的早期診斷。性感染的早期診斷。2.2.7 ABS-ELIS

11、A2.2.7 ABS-ELISA法法 ：固相支持物固相支持物；：樣品；：樣品；：特異性：特異性IgGIgG；：生物素化抗小鼠：生物素化抗小鼠IgG IgG （BiotinBiotin）；）；：辣根過氧化物酶：辣根過氧化物酶HRP-HRP-酶標鏈親和素（酶標鏈親和素（AvidinAvidin）；）；：DABDAB顯色液；顯色液；：顯色；：顯色；3. ELISA3. ELISA的試劑的試劑(A(A、B B、C C三部分三部分) )ELISAELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結合物和中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結合物和酶的底物。酶的底物。（1 1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）

12、已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2 2）酶標記的抗原或抗體（結合物）；）酶標記的抗原或抗體（結合物）；（3 3）酶的底物；）酶的底物；（4 4）陰性對照品和陽性對照品，參考標準品；）陰性對照品和陽性對照品，參考標準品；（5 5）結合物及標本的稀釋液；）結合物及標本的稀釋液；（6 6）洗滌液；）洗滌液；（7 7）酶反應終止液）酶反應終止液ELISAELISA的試劑準備的試劑準備A A 固相載體固相載體 聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學活性?；虻鞍踪|(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學活性。 聚氯乙烯。

13、聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯聚氯乙烯。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。高，但空白值也略高。 良好的良好的ELISAELISA板應該是板應該是吸附性能好吸附性能好，空白值低空白值低，孔底孔底透明度高透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間間性能相近性能相近。3.1.2 3.1.2 包被的方式包被的方式 將抗原或抗體固定在過程稱為包被將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)(coating)。 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結合的與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結構上的疏

14、水基團與固相載體表面，靠的是蛋白質(zhì)分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受的疏水基團間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點、濃度等的影響。大分子蛋白蛋白質(zhì)的分子量、等電點、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團疏水基團，故更易吸，故更易吸附到固相載體表面。附到固相載體表面。不易吸附不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)

15、較多的抗原也可采用捕獲包被法。此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法。親和素生物素親和素生物素 即用親和素先包被載體，加入生物素化的即用親和素先包被載體，加入生物素化的DNADNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用于各種抗原，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。物質(zhì)的定量測定。脂類物質(zhì)脂類物質(zhì)無法與固相載體結合，可將其在有機溶劑（例如無法與固相載體結合，可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解后加入乙醇）中溶解后加入ELISAELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。風吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相

16、表面。 優(yōu)點：試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重復優(yōu)點：試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重復性亦佳。抗原用量少，僅為直接包被的性亦佳?？乖昧可?，僅為直接包被的1/101/10乃至于乃至于/100/100。包被用抗原：包被用抗原：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。合成多肽抗原合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高片段。一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助，但由于分子量太小，往往難于直接

17、吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結合到固相載體表面于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結合到固相載體表面。3.1.4 3.1.4 包被用抗體包被用抗體IgGIgG對聚苯乙烯有強吸附力，其聯(lián)結發(fā)生在對聚苯乙烯有強吸附力，其聯(lián)結發(fā)生在FcFc段上，抗體段上，抗體結合點暴露于外。結合點暴露于外。取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液. .須除去雜抗體后須除去雜抗體后才能用于才能用于ELISAELISA，以保證試驗的特異性。，以保證試驗的特異性。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強，因此不需要作腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強，因此不需要作吸收層析處理，直接

18、包被。在某些情況下，用多種單抗吸收層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果?；旌习?，可取得更好的效果。3.1.5 3.1.5 包被的條件包被的條件pH9.6pH9.6碳酸鹽緩沖液碳酸鹽緩沖液pH7.2pH7.2的磷酸鹽緩沖液的磷酸鹽緩沖液pH7-8pH7-8的的TrisTris-HCL-HCL緩沖液。緩沖液。 加入包被液后，在加入包被液后，在4-84-8冰箱中放置過夜，冰箱中放置過夜，3737中中保溫保溫2 2小時。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大小時。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結合物的濃度協(xié)調(diào)的變化，每批材料需通過實

19、驗與酶結合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml10ng/ml-20ug/ml。3.1.6 3.1.6 封閉封閉封閉封閉(blocking)(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質(zhì)是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關的蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥充填這些空隙，從而排斥ELISAELISA后的步驟中干擾物質(zhì)后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。的再吸附。常用封閉劑：常用封閉劑：0.05%-0.5%0.05%-0.5%的的BSA; 10%BSA; 10%的小

20、牛血清或的小牛血清或1%1%明膠明膠; ;脫脂奶粉脫脂奶粉, ,比較價廉，可以高濃度使用（比較價廉，可以高濃度使用（5%5%）。）。 所有的所有的ELISAELISA固相均需封閉？固相均需封閉？3.4 3.4 洗滌液洗滌液在板式在板式ELISAELISA中，常用的稀釋液為含中，常用的稀釋液為含0.05%0.05%吐溫吐溫2020磷酸鹽緩沖液。磷酸鹽緩沖液。ELISA的試劑準備的試劑準備B 3.2 3.2 結合物結合物 即酶標記的抗體（或抗原）是即酶標記的抗體（或抗原）是ELISAELISA中關鍵的試中關鍵的試劑劑 1 1 酶的催化活性酶的催化活性 2 2抗體（或抗原）的免疫活性抗體（或抗原）的

21、免疫活性 3 3含有或少含有游離的抗體（或抗原）含有或少含有游離的抗體（或抗原） 4 4結合物尚要有良好的穩(wěn)定性。結合物尚要有良好的穩(wěn)定性。3.2.1 3.2.1 結合物用的抗原和抗體結合物用的抗原和抗體 制備結合物時所用純度較高的制備結合物時所用純度較高的IgGIgG，以免在與酶聯(lián)結，以免在與酶聯(lián)結時其他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣時其他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋全部酶結合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進行反應，實驗結果本底淺淡。在度進行反應，實驗結果本底淺淡。在ELISAELISA中用酶標抗中用酶標抗原的模式不

22、多，總的要求是抗原必須是高純度的。原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。3.2.23.2.2酶酶純度高，催化反應的轉(zhuǎn)化率高，專一性強，性質(zhì)穩(wěn)定，純度高，催化反應的轉(zhuǎn)化率高，專一性強，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，受檢標本中不存在相同的酶。來源豐富，價格不貴，受檢標本中不存在相同的酶。酶結合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保酶結合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等。存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等。在在ELISAELISA中，中，HRPHRP，APAP，葡萄糖氧化酶，葡萄糖氧化酶，-D-D-半乳糖苷半乳糖苷酶和脲酶等。酶和脲酶等。HRPHRP

23、是一種糖蛋白，含糖量約為是一種糖蛋白，含糖量約為18%18%，分子量為，分子量為4400044000，是一種復合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素是一種復合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。）結合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。3.2.3 3.2.3 結合物的制備結合物的制備酶標記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過酶標記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。碘酸鹽氧化法。（1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團試劑，可使戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團試劑，可使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過它而聯(lián)結。有效（結合率達酶與蛋白質(zhì)的氨基通過它而聯(lián)結

24、。有效（結合率達60%-60%-70%70%）和重復性好。）和重復性好。 交聯(lián)反應是隨機的，結合物的大小也不均一，酶與交聯(lián)反應是隨機的，結合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。（2 2）過碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過碘酸鈉將）過碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過碘酸鈉將HRPHRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成氨基形成chiffchiff氏堿而結合。簡便有效氏堿而結合。簡便有效. . 結合物中混有的游離酶一般不影響結合物中混有的游離酶一般不影響ELI

25、SAELISA中最后的酶活中最后的酶活性測定。但游離的抗體則會與酶標抗體競爭相應的固相性測定。但游離的抗體則會與酶標抗體競爭相應的固相抗原，因此制備的酶結合物應予純化，去除游離的酶和抗原，因此制備的酶結合物應予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測，效果更好?？贵w后用于檢測，效果更好。 制得結合物，最適的工作濃度就是指結合物稀釋至這制得結合物，最適的工作濃度就是指結合物稀釋至這一濃度時，能維護一個低的本底，并獲得測定的最佳靈一濃度時，能維護一個低的本底，并獲得測定的最佳靈敏度，達到最合適的測定條件和測定費用的節(jié)省。敏度，達到最合適的測定條件和測定費用的節(jié)省。3.2.43.2.4結合物的保存結合物的

26、保存 酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度較酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度較為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結合為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結合物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護劑。另外物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRPHRP結合結合物加硫柳泵，物加硫柳泵，APAP結合物可加疊氮鈉）。結合物可加疊氮鈉）。3.2.5 3.2.5 結合物的稀釋液結合物的稀釋液 用于稀釋高濃度的結合物以配成工作液。為避免結合用于稀釋高濃度的結合物以配成工作液。為避免結合物在反應中直

27、接吸附在固相載體上：物在反應中直接吸附在固相載體上：0.1%0.1%牛血清白蛋牛血清白蛋白，白， 0.05%0.05%吐溫吐溫20 20 。試劑盒均已用合適的緩沖液配。試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時不需再行稀釋，在成工作液，使用時不需再行稀釋，在4-84-8保存期可達保存期可達6 6個月。個月。試劑準備試劑準備 C 酶的底物酶的底物3.3 3.3 酶的底物酶的底物3.3.1 3.3.1 HRPHRP的底物的底物OPDOPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在492nm492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是處有最高吸收峰，靈敏

28、度高，比色方便，是HRPHRP結結合物最常用的底物。合物最常用的底物。 DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中，上式中， DH2為供氧體，為供氧體， H2O2為受氫體。為受氫體。DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。DH2如：鄰苯二胺如：鄰苯二胺(OPD)(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(TMB)和和ABTS ABTS 。ETMBTMB經(jīng)經(jīng)HRPHRP作用后共產(chǎn)物顯藍色。作用后共產(chǎn)物顯藍色。TMBTMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與溶液試劑，只需與H H2 2O O2 2溶液混和即成應用液。酶反應終

29、止溶液混和即成應用液。酶反應終止后，后，TMBTMB產(chǎn)物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸產(chǎn)物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為收波長為450nm450nm。ABTSABTS雖不如雖不如OPDOPD和和TMBTMB敏感，但空白值極低，也為一些試敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。劑盒所采用。HRPHRP對氫受體的專一性很高，僅作用于對氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2H2O2、小分醇的過、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物氧化物和尿素過氧化物(urea peroxide)(urea peroxide)。 APAP的底物為磷酸酯酶，一般采用對的底物為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯

30、磷酸酯硝基苯磷酸酯作為底物。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在作為底物。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在405nm405nm波波長處有吸收峰。用長處有吸收峰。用NaOHNaOH終止酶反應后，黃色可穩(wěn)終止酶反應后，黃色可穩(wěn)定一時間。定一時間。APAP也有發(fā)熒光底物（磷酸也有發(fā)熒光底物（磷酸4-4-甲基傘酮甲基傘酮），可用于），可用于ELISAELISA作熒光測定，敏感度較高于用作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。顯色底物的比色法。3.5 3.5 酶反應終止液酶反應終止液常用的常用的HRPHRP反應終止液為硫酸，其濃反應終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板度按加量及比色液的最終體積而異，在

31、板式式ELISAELISA中一般采用中一般采用2mol/L2mol/L。4 4 對照設定對照設定 陽性對照品陽性對照品(positive control)(positive control)和陰性對照品和陰性對照品(negative control)(negative control)是檢驗試驗有效性的控制品，同時是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結果的對照。也作為判斷結果的對照。陽性對照品的基本組成應盡量與檢測標本的組成相一致，陽性對照品的基本組成應盡量與檢測標本的組成相一致，多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質(zhì)。多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質(zhì)。加入的量應與試劑的敏感度相稱；加入的量應與試劑

32、的敏感度相稱；在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較，可以估計在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較，可以估計標本物質(zhì)的量。標本物質(zhì)的量。參考標準品參考標準品 定量測定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測定等）應含有定量測定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測定等）應含有制作標準曲線用的參考標準品，應包括覆蓋可檢測范制作標準曲線用的參考標準品，應包括覆蓋可檢測范圍的圍的4-54-5個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中緩沖液中. .陰性對照品須先行檢測確定不含待測物質(zhì)。例如陰性對照品須先行檢測確定不含待測物質(zhì)。例如HBsAgHBsAg檢檢測的陰性對照品中不可含

33、測的陰性對照品中不可含HBsAgHBsAg，最好抗，最好抗HBsHBs也是陰性。也是陰性。5 5 標本的采取和保標本的采取和保存存 體液、分泌物和排泄物等均可作標本以測定其中某種抗體液、分泌物和排泄物等均可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份。體或抗原成份。以血清標本為例：血漿中除尚含有以血清標本為例：血漿中除尚含有纖維蛋白原纖維蛋白原和和抗凝劑抗凝劑外，其他成份同血清。血漿和血清可同等應用。外，其他成份同血清。血漿和血清可同等應用。血清標本應避免溶血：紅細胞溶解時會釋放出具有過氧血清標本應避免溶血：紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以化物酶活性的物質(zhì)，以HRPHRP為標記的為標記的

34、ELISAELISA測定中，可能測定中，可能會增加非特異性顯色。會增加非特異性顯色。加樣加樣: : 在在ELISAELISA中一般有中一般有3 3次加樣步聚，即加標本，加酶次加樣步聚，即加標本，加酶結合物，加底物。加樣時應將所加物加在結合物，加底物。加樣時應將所加物加在LEISALEISA板孔板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。產(chǎn)生氣泡?；静僮髯⒁馐马椈静僮髯⒁馐马棻乇乜乖贵w完成反應的保溫過程稱為溫育抗原抗體完成反應的保溫過程稱為溫育(incubation)(incubation)。ELISAELISA屬固相免疫測

35、定，抗原、抗體的結合只在固相表面屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發(fā)生。為什么上發(fā)生。為什么ELISAELISA反應總是需要一定時間的溫育？反應總是需要一定時間的溫育？溫育常采用的溫度有溫育常采用的溫度有4343、3737、室溫和、室溫和44（冰箱溫度（冰箱溫度）等。）等。3737是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結合的合適溫度。原抗體結合的合適溫度。保溫方式：保溫方式：ELISAELISA儀器附有特制的電熱塊，水浴。儀器附有特制的電熱塊，水浴。若用保溫箱：若用保溫箱：ELISAELISA板放在濕盒內(nèi)，在盒底墊濕的紗布板放在濕盒內(nèi)，在

36、盒底墊濕的紗布，最后將，最后將ELISAELISA板放在濕紗布上。反應板均不宜疊放，板放在濕紗布上。反應板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應，操作時的室溫應嚴格限制在規(guī)定的范室溫溫育的反應，操作時的室溫應嚴格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標準室溫溫度是指圍內(nèi)，標準室溫溫度是指20-2520-25，但具體操作時可根，但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育。應注意溫育的溫度和時間應據(jù)說明書的要求控制溫育。應注意溫育的溫度和時間應按規(guī)定力求準確。為保證這一點，一個人操作時，一次按規(guī)定力求準確。為保證這一點，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。不宜多于兩

37、塊板同時測定。洗滌洗滌洗滌在洗滌在ELISAELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著實驗的成敗。實驗的成敗。ELSIAELSIA洗滌：達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。洗滌：達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)。干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來?？梢哉f在可以說在ELISAELISA操

38、作中，洗滌是最主要的關鍵技術。操作中，洗滌是最主要的關鍵技術。洗滌的方式除某些洗滌的方式除某些ELISAELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作有，手工操作有流水沖洗式和流水沖洗式和浸泡式兩種：浸泡式兩種：（1 1）流水沖洗式）流水沖洗式 流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液為蒸餾水，自來水。洗滌效果更為徹底，且也，洗滌液為蒸餾水，自來水。洗滌效果更為徹底，且也簡便、快速。已有實驗表明，流水沖洗式同樣適用于微簡便、快速。已有實驗表明，流水沖洗式同樣適用于微量滴定板的洗滌。讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳量滴定板的洗滌。讓水流沖

39、擊板孔表面，洗滌效果更佳。 （2 2）浸泡式）浸泡式 微量滴定板多采用。洗滌液為微量滴定板多采用。洗滌液為非離子型洗非離子型洗滌劑滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結合是的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結合是疏疏水性水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，使蛋白質(zhì)回復到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。，使蛋白質(zhì)回復到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。顯色顯色顯色是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應。反顯色是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi)，應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一

40、定時間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進行。強。適當提高溫度有助于加速顯色進行。TMBTMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應觀察結果。但為保證實驗結果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的應觀察結果。但為保證實驗結果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當時間閱讀結果。適當時間閱讀結果。TMBTMB經(jīng)經(jīng)HRPHRP作用后，約作用后，約4040分鐘顯色達分鐘顯色達頂峰，隨即逐漸減弱，至頂峰，隨即逐漸減弱，至2 2小時后即可完全消退至無色。小時后即可完全消退至無色。比色比色

41、拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀中拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀中。 以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應僅加以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標本底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行計算。白孔的吸光度，然后進行計算。結果以光密度（結果以光密度（oplicaloplical densi

42、ty density，ODOD），現(xiàn)按規(guī)定用），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（吸光度（absorbenceabsorbence，A A），兩者含義相同。通常的表），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于示方法是，將吸收波長寫于A A字母的右下角，如字母的右下角，如OPDOPD的吸的吸收波長為收波長為492nm492nm，表示方法為，表示方法為AA492492nmnm或或ODOD492492nmnm。酶標比色儀酶標比色儀酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指測讀酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指測讀ELISAELISA光度計。針光度計。針對固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小對固相載體形式的不同，各有特制

43、的適用于板、珠和小試管的設計。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀試管的設計。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數(shù)的準確性、重復性、精確度和可測范圍、線性等等。數(shù)的準確性、重復性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù)一般可精確到優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù)一般可精確到0.0010.001，準確性為，準確性為1%1%，重復性達，重復性達0.5%0.5%。操作時室溫宜在操作時室溫宜在15-3015-30，使用前先預熱儀器，使用前先預熱儀器15-3015-30分鐘分鐘，測讀結果更穩(wěn)定。測讀，測讀結果更穩(wěn)定。測讀A A值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如收峰，如OPDOPD用用492nm492nm波長。有的酶標儀可用雙波長式測波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀。讀。各種酶標儀性能有所不同，使用中應詳細閱讀說明書。各種酶標儀性能有所不同，使用中應詳細閱讀說明書。6 6 結果判結果判斷斷 6.1 6.1 定性測定定性測定定性測定的結果判斷作出定性測定的結果判斷作出“有有”或或“無無