半抗原免疫分析

半抗原免疫分析內(nèi)容一、基本概念抗原抗體二、免疫分析方法分類ELISA原理與方法方法建立-蘇丹紅為例2020/11/32

抗原

antigen,Ag2020/11/33(一)抗原的概念

抗原(Antigen,Ag)是一類能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答,并能與相應(yīng)的免疫應(yīng)答產(chǎn)物在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì).2020/11/34(二)完全抗原與半抗原1.完全抗原（complexantigen):

既具免疫原性又有免疫反應(yīng)性的物質(zhì).

如:大多數(shù)蛋白質(zhì).2.半抗原(hapten):

僅有免疫反應(yīng)性而無免疫原性的物質(zhì).如:大多數(shù)多糖、類脂、某些藥物.

半抗原+載體(蛋白質(zhì))完全抗原2020/11/352020/11/36共同抗原與交叉反應(yīng)2020/11/37共同抗原與交叉反應(yīng)

1.共同抗原(Commonantigens)：存在于兩種不同的抗原之間的相同或相似的抗原決定簇，稱為共同抗原。

2.交叉反應(yīng)(Cross-reaction)：由于存在共同抗原造成抗體對(duì)具有相同或相似決定簇的不同抗原發(fā)生反應(yīng)，此稱為交叉反應(yīng)。檢測(cè)意義：假陽性（避免）多殘留檢測(cè)（利用）2020/11/382020/11/39農(nóng)藥、獸藥、生物毒素、重金屬、維生素、防腐劑、植物激素等半抗原

在食品安全、植物學(xué)、環(huán)境檢測(cè)等領(lǐng)域，主要是半抗原類物質(zhì)。2020/11/310抗體

antibody,Ab抗原與抗體是天生的一對(duì)，誰也離不了誰；兩者既是好朋友，又是一對(duì)冤家。2020/11/311一、基本概念1.抗體（Antibody，Ab）指B淋巴細(xì)胞受抗原刺激后活化、增殖、分化成為漿細(xì)胞，產(chǎn)生的能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。

存在形式：

膜型（membraneimmunoglobulin,mIg）

—

B細(xì)胞膜上的抗原受體；

分泌型(secretedimmunoglobulin,sIg)

—

分泌進(jìn)入體液,

介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。2020/11/312二、免疫球蛋白的分子結(jié)構(gòu)（一）免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu)：由四條多肽鏈組成，呈“Y”或“T”型

1.組成：

2條長鏈，又稱重鏈（Heavychain，H鏈）：含450-550aa，分子量為55-75KD。

2條短鏈，又稱輕鏈（Lightchain，L鏈）：含214aa，分子量為25KD。2020/11/3132020/11/3142020/11/3152.分類、分型：（1）根據(jù)重鏈氨基酸組成、序列及結(jié)構(gòu)的差異，將Ig分為五類：

IgM(μ)、IgG(γ)、IgA(α)、IgD(δ)、IgE(ε)

亞類：IgG：IgG1,IgG2,IgG3,IgG4

IgA：IgA1,IgA2

IgM:IgM1,IgM2（2）分兩型：

根據(jù)輕鏈氨基酸組成、序列及結(jié)構(gòu)的差異，可將輕鏈分為兩型：κ和λ型每一Ig單體分子兩條重鏈必須同類，兩條輕鏈必須同型。2020/11/3162020/11/317抗體的制備方法2020/11/3182020/11/3193.基因工程抗體(GeAb):

第三代抗體

由基因重組技術(shù)制備的抗體,稱為基因工程抗體。

嵌合抗體(chimeric

Ab)

人源抗體（humanizedAb)

雙特異性抗體（bispecific

Ab)

Fab/ScFV（singlechainFVfragment)

單域抗體（singlechainAb)

2020/11/320抗體的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，所展現(xiàn)出的生物學(xué)功能是其結(jié)構(gòu)的完美表演者。2020/11/321免疫分析技術(shù)內(nèi)容分析方法分類幾種常用免疫分析技術(shù)ELISA側(cè)流免疫層析分析方法的建立分析數(shù)據(jù)的擬合2020/11/322常用的免疫標(biāo)記物質(zhì)類別標(biāo)記物用途熒光素

FITC、RB200、TRITC免疫組化鑭系元素螯合物免疫分析測(cè)定放射性核素

3H、14C、32P、57Gr免疫分析測(cè)定

125I、131I酶

HRP、AP免疫組化免疫分析測(cè)定化學(xué)發(fā)光物L(fēng)uminol、lucigenin免疫分析測(cè)定金屬顆粒膠體金、鐵蛋白免疫組化免疫分析測(cè)定

2020/11/323一、標(biāo)記免疫方法分類1．按標(biāo)記物的種類分(1)放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)(2)酶免疫分析(enzymeimmunoassay，EIA)(3)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(chemiluminescentenzymeimmunoassay，CIZIA)(4)熒光免疫分析法(fluorescenceimmunoassay，F(xiàn)IA)。。。。。2020/11/324

2．按是否加入分離劑分(1)均相免疫分析(homogeneouslmmunoassay)

在某些免疫分析中，當(dāng)抗原一抗體反應(yīng)達(dá)到平衡后，反應(yīng)液中結(jié)合的標(biāo)記藥物與游離的標(biāo)記藥物之中有一種不產(chǎn)生信號(hào)或信號(hào)消失，因此無需將反應(yīng)液分作兩相，即可在均相溶液中進(jìn)行測(cè)定，故稱為均相免疫分析。如酶放大免疫測(cè)定技術(shù)(enzymemultipliedimmunoassaytechnique，EMIT)。(2)非均相免疫分析(heterogeneousimmunoassay)

在某些免疫分析中，當(dāng)抗原一抗體反應(yīng)達(dá)到平衡后，只有在反應(yīng)液中加入分離劑，將游離標(biāo)記藥物和結(jié)合標(biāo)記藥物分開之后，才能測(cè)出各自部分的標(biāo)記藥物濃度。否則，測(cè)定的是兩者的總濃度。由于這種信號(hào)的測(cè)定需將反應(yīng)液分成液-固兩相后，才能分別測(cè)定，故稱為非均相免疫分析。如ELISA(Enzymelinkedimmunosorbentimmunoassay)2020/11/325ELISA簡介2020/11/326（一）ELISA技術(shù)的原理間接法

夾心法

競爭法2020/11/3272020/11/328夾心法Sandwich2020/11/329競爭法2020/11/330（二）ELISA所用試劑材料1、固相2、酶3、底物4、緩沖液5、儀器2020/11/3311、固定相聚次亞乙烯2020/11/3322、最常用的標(biāo)記酶1．辣根過氧化物酶(HRP):約有50％的EIA使用此酶。2．堿性磷酸酯酶(AP):AP標(biāo)記的結(jié)合物性質(zhì)穩(wěn)定，其活性可用分光光度計(jì)或熒光計(jì)測(cè)量。3．6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G-6-PD):通常用于均相EIA。4．β-半乳糖苷酶(β-Gal):適用于均相EIA和非均相EIA。5．蘋果酸脫氫酶(MDH):多用于尿樣的均相EIA。2020/11/3333、最常用的底物鄰苯二酚(OPC)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)2020/11/3344、緩沖液PBS(T)Tris-HClNa3N是HRP（辣根過氧化物酶）的抑制劑2020/11/335酶標(biāo)儀4、儀器2020/11/336酶標(biāo)儀2020/11/337（三）免疫分析方法建立

——蘇丹紅為例2020/11/338Step1:Haptenandconjugate2020/11/339Step2:characterizationofconjugate2020/11/340Step3:chessboardtiatrionandcalibrationcurve2020/11/341Step4:optimization—nonessential

2020/11/342例1、標(biāo)記抗原濃度對(duì)檢測(cè)的影響2020/11/343例，pH影響2020/11/344Step5:sampleanalysis2020/11/345Step6:validation2020/11/346一個(gè)難點(diǎn)：基質(zhì)效應(yīng)2020/11/347