章基因功能研究基因打靶和轉(zhuǎn)基因

1、教師：教師：王華王華單位：吉單位：吉 林林 大大 學(xué)學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 分子生物學(xué)教研室分子生物學(xué)教研室電話：電話：85619369 (L)85619369 (L) Strategies for analyzing gene function第三節(jié)第三節(jié) 基因的生物學(xué)功能鑒定技術(shù)基因的生物學(xué)功能鑒定技術(shù)第二十二章第二十二章對題目的解析：對題目的解析：基因的功能基因的功能基本思路：基本思路：在在DNA水平的技術(shù)水平的技術(shù) 使相應(yīng)基因缺失而失活使相應(yīng)基因缺失而失活: 基因敲除基因敲除 細(xì)胞或動物獲得新基因、或細(xì)胞或動物獲得新基因、或 額外拷貝的基因：額外拷貝的基因：轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù) 在在

2、mRNA水平的技術(shù)：封閉或降解水平的技術(shù)：封閉或降解mRNA 反義反義RNA， RNAi 利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測的基因功能利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測的基因功能基因功能的研究是基因功能的研究是2121世紀(jì)生命科學(xué)研究的重點之一，這對于我們深世紀(jì)生命科學(xué)研究的重點之一，這對于我們深入理解疾病的發(fā)生機(jī)理、探索新的治療途徑非常重要！入理解疾病的發(fā)生機(jī)理、探索新的治療途徑非常重要！一、一、 使體內(nèi)原有基因缺失的技術(shù)使體內(nèi)原有基因缺失的技術(shù): : 基因敲除基因敲除 (gene knock-out)美國猶他大學(xué)Eccles人類遺傳學(xué)研究所馬里奧卡佩奇MarioR.Capecchi英國卡迪夫大學(xué)卡迪夫生命科學(xué)

3、學(xué)院馬丁埃文斯MartinJ.Evans美國北卡羅來納州大學(xué)教會山分校醫(yī)學(xué)院奧利弗史密斯OliverSmithies利用利用DNA同源重組的原理，在活體內(nèi)將特定基因從染色體同源重組的原理，在活體內(nèi)將特定基因從染色體上剔除的過程。上剔除的過程。Genomic DNA:Targeting DNA fragment:Genomic DNA/gene knocked out:Lost its original functionHomologous arm sequence（一）（一） 基因敲除的基因敲除的定義定義基因敲除基因敲除（gene knockout）* *利用利用DNA同源重組的原理，在同源重

4、組的原理，在ES細(xì)胞中細(xì)胞中定點破壞一條染色體上的定點破壞一條染色體上的內(nèi)內(nèi)源基因。源基因。然后利用然后利用ES細(xì)胞發(fā)育的全能性，獲得帶有細(xì)胞發(fā)育的全能性，獲得帶有特定基因缺陷的雜合子小鼠。特定基因缺陷的雜合子小鼠。最后通過遺傳育種最終獲得目的基因缺陷最后通過遺傳育種最終獲得目的基因缺陷的純合子個體。的純合子個體。1 構(gòu)建基因構(gòu)建基因敲除載體敲除載體基因敲除載體的特點：基因敲除載體的特點：待敲除基因的同源臂序列待敲除基因的同源臂序列陽性篩選標(biāo)記基因陽性篩選標(biāo)記基因陰性篩選標(biāo)記基因陰性篩選標(biāo)記基因（二）基因敲除的（二）基因敲除的基本流程基本流程* *PTargeting vector打靶載體打靶

5、載體問題：如何構(gòu)建打靶載體？問題：如何構(gòu)建打靶載體？NeoR* * 基因敲除載體的構(gòu)建過程：了解基因敲除載體的構(gòu)建過程：了解將待敲除基因切除大部分使其將待敲除基因切除大部分使其失活，留下用于重組的同源臂失活，留下用于重組的同源臂PP在同源臂的外側(cè)在同源臂的外側(cè)線性化載體線性化載體PTargeting Targeting vectorvectorPCloning Cloning vectorvector打靶載體打靶載體待敲除基因待敲除基因NeoR geneHSV-Tk genePRecombinant Recombinant cloning vectorcloning vectorTarget

6、genePRecombinant Recombinant cloning vectorcloning vector（二）基因敲除的（二）基因敲除的基本流程基本流程* *ES cellES cell(Embryonic stem cell) (Embryonic stem cell) Brown mouseBrown mouse基因敲除載體基因敲除載體2 2 將基因敲除載體導(dǎo)入將基因敲除載體導(dǎo)入ESES細(xì)胞細(xì)胞：重組置換：重組置換為什么需要將打靶載體線性化？為什么需要將打靶載體線性化？ 1 構(gòu)建基因構(gòu)建基因敲除載體敲除載體ES cellES cellPTargeting Targeting ve

7、ctorvectorRestriction Restriction enzymeenzymeHomologous armsHomologous armsHSV-HSV-TkTkNeoNeo同源重組時可能遇到哪些問題，篩選標(biāo)志在這個過程中發(fā)揮什么樣的作用？同源重組時可能遇到哪些問題，篩選標(biāo)志在這個過程中發(fā)揮什么樣的作用？ （二）基因敲除的（二）基因敲除的基本流程基本流程* *2 2 將基因敲除載體導(dǎo)入將基因敲除載體導(dǎo)入ESES細(xì)胞細(xì)胞：重組置換：重組置換1 構(gòu)建基因構(gòu)建基因敲除載體敲除載體 P53 gene is replaced by Neo gene. Cells are resistant

8、 to both neomycin and gancyclovirHomologous RecombinationOther sitesRandom Insertion P53 gene is not replaced. Cells are resistant to neomycin but sensitive to gancyclovir.10-5-10-6Neo geneNeo geneNeo geneNeo geneHSV-HSV-TkTk gene geneHSV-HSV-TkTk Neo Neo in ES cellsP53 geneP53 geneP53 geneP53 geneP

9、53 geneP53 geneP53 geneP53 geneTwo ways for Neo gene insertion 細(xì)胞死亡細(xì)胞死亡細(xì)胞的培養(yǎng)基含細(xì)胞的培養(yǎng)基含單核苷酸類似物單核苷酸類似物 (gancyclovir)細(xì)胞生長良好細(xì)胞生長良好單核苷酸單核苷酸類似物類似物是是無毒的無毒的陰性篩選標(biāo)記基因（陰性篩選標(biāo)記基因（HSV-Tk）的篩選原理）的篩選原理陰性篩選目的：陰性篩選目的：但如果細(xì)胞中如果有但如果細(xì)胞中如果有HSV-TK 基基因的表達(dá)，即存在因的表達(dá)，即存在TK (thymidine kinase)，單核苷酸類似物單核苷酸類似物將將被被其其磷酸化磷酸化成有毒的產(chǎn)物成有毒的產(chǎn)物

10、用打靶載體轉(zhuǎn)染用打靶載體轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞時，我們細(xì)胞時，我們只需要同源部分重組只需要同源部分重組入入ES cell的的genome,而而Tk基因等載體的其它部分是不可以進(jìn)基因等載體的其它部分是不可以進(jìn)入入ES cell的的genome(by隨機(jī)重組隨機(jī)重組)。用單核苷酸類似物篩選。用單核苷酸類似物篩選轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，存活的細(xì)胞基本上不含載體的非目的序列轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，存活的細(xì)胞基本上不含載體的非目的序列Positive-negative selectionTransfectionHomologous recombinantsG418Neomycin (positive selection) kills

11、 the non-insertions;Gancyclovir (negative selection) kills the random insertionsIn survival cells, P53 gene is replaced by Neo, but only on 1 chr.Medium with G418 & GancyclovirNormalEScells1 構(gòu)建基因構(gòu)建基因敲除載體敲除載體2 將基因敲除載體導(dǎo)入將基因敲除載體導(dǎo)入ES細(xì)胞，通過同源重組建立細(xì)胞，通過同源重組建立 基因敲除的基因敲除的胚胎干細(xì)胞雜合子胚胎干細(xì)胞雜合子? a). .基因敲除基因敲除ES細(xì)

12、胞注射入胚泡細(xì)胞注射入胚泡 b). 嵌合胚泡植入假孕小鼠子宮中嵌合胚泡植入假孕小鼠子宮中 c). 嵌合體的雜交育種獲得雜合子小鼠嵌合體的雜交育種獲得雜合子小鼠3 然后利用然后利用ES細(xì)胞發(fā)育的全能性，獲得帶有特定基細(xì)胞發(fā)育的全能性，獲得帶有特定基因缺陷的雜合子小鼠。因缺陷的雜合子小鼠。（二）基因敲除的（二）基因敲除的基本流程基本流程* * a). .基因敲除基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡細(xì)胞注射入胚泡 Inject Chimeric Blastocystoriginal inner cell massInject the gene knocked-out ES cells into a blast

13、ocyst.Normal Mouse embryoMate3 days Provides normal blastocyst b). 嵌合胚泡植入假孕小鼠子宮中嵌合胚泡植入假孕小鼠子宮中 Test offspring for presence of gene by PCR Implant into uterus of apseudopregnant foster mother Neo (+/-)Psuedopregnant black mouse（-/-）（+/-）（-/-） c). 嵌合體的雜交育種獲得嵌合體的雜交育種獲得雜合子小鼠雜合子小鼠如果某些嵌合體小鼠的生如果某些嵌合體小鼠的生殖細(xì)胞

14、恰巧是由基因敲除殖細(xì)胞恰巧是由基因敲除的的ES細(xì)胞發(fā)育成的，細(xì)胞發(fā)育成的，Mating with normal mice1/2 is heterozygous所有細(xì)胞所有細(xì)胞Neo (生殖細(xì)胞+/-) NeoMating between offsprings with genotype of Neo(+/-)（+/-）（-/-）（+/-）Neo（+/+）Mating heterozygous offsprings to produce homozygous gene knocked-out strain4 小結(jié)：基因敲除的小結(jié)：基因敲除的基本流程基本流程* *嵌合體嵌合體雜合子小鼠雜合子小鼠4

15、. 基因敲除的純合子小鼠基因敲除的純合子小鼠與陰性小鼠與陰性小鼠交配交配123Gene knockout mice is a powerful tool for studying gene function. 腫瘤基因腫瘤基因“ alive test tubes”. （三）基因敲除的（三）基因敲除的應(yīng)用應(yīng)用(1) 基因敲除鼠是基因功能研究的活試管基因敲除鼠是基因功能研究的活試管*基因敲除小鼠工程基因敲除小鼠工程2006年，年，美國美國NIH推出推出knockout Mouse Project (KOMP)將系統(tǒng)敲除或破壞小鼠的將系統(tǒng)敲除或破壞小鼠的2萬個基因萬個基因計劃投入計劃投入5200萬美

16、元建立小鼠基因組突變基因數(shù)據(jù)庫萬美元建立小鼠基因組突變基因數(shù)據(jù)庫此計劃與加拿大此計劃與加拿大North American Conditional Mouse Mutagenesis Project (NorCOMM)及及European Conditional Mouse Mutagenesis Program (EUCOMM)合作，以避免重復(fù)工作合作，以避免重復(fù)工作設(shè)想：設(shè)想：各種基因缺陷小鼠將成為研究基因功能、解釋人類疾病的模型。各種基因缺陷小鼠將成為研究基因功能、解釋人類疾病的模型。事實上，目前至少事實上，目前至少500種基因已經(jīng)獲得了基因敲除小鼠！種基因已經(jīng)獲得了基因敲除小鼠?。ㄈ┗?/p>

17、因敲除的（三）基因敲除的應(yīng)用應(yīng)用(1) 基因敲除鼠是基因功能研究的活試管基因敲除鼠是基因功能研究的活試管*(3) 基因敲入技術(shù)基因敲入技術(shù)-生物制藥生物制藥Mouse Ig genes were knocked outHuman Ig genes were knocked in“人鼠人鼠”Produce humanize antibodies(2) 獲得疾病的動物模型獲得疾病的動物模型*人人Ig基因敲入基因敲入（三）基因敲除的（三）基因敲除的應(yīng)用應(yīng)用(1) 基因敲除鼠是基因功能研究的活試管基因敲除鼠是基因功能研究的活試管*如何理解基因剔除過程其實就是一個經(jīng)過改造的基因敲入的過程？如何理解基因剔

18、除過程其實就是一個經(jīng)過改造的基因敲入的過程？（一）細(xì)胞水平：細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染（一）細(xì)胞水平：細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染 （二）動物水平：轉(zhuǎn)基因動物（二）動物水平：轉(zhuǎn)基因動物（三）動物水平：基因敲入（三）動物水平：基因敲入 基因功能獲得策略基因功能獲得策略本質(zhì)是將目的基因直接導(dǎo)入某一細(xì)胞或個體中，本質(zhì)是將目的基因直接導(dǎo)入某一細(xì)胞或個體中，使其獲得新的或更高水平的表達(dá)，然后通過細(xì)胞使其獲得新的或更高水平的表達(dá)，然后通過細(xì)胞或個體生物性狀的變化來研究基因功能?；騻€體生物性狀的變化來研究基因功能。方法：方法： （一）細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染（一）細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染 (gene (gene transfectiontransfec

19、tion) )如何進(jìn)行這項實驗如何進(jìn)行這項實驗 ？Kozak sequenceCoding sequence(gcc)gccRccATGG-TAA-6-5-4-3-2-1+1+2+3+4一般是嘌呤一般是嘌呤(A 或或G)目的基因目的基因:起始密碼和終止密碼起始密碼和終止密碼Kozak 序列：是核糖體序列：是核糖體高效率起始翻譯所必需的。高效率起始翻譯所必需的。 +4G 和和-6G 對于核糖體識別對于核糖體識別AUG 有顯著的促進(jìn)作用有顯著的促進(jìn)作用必要的順式作用元件如必要的順式作用元件如啟動子啟動子等等篩選標(biāo)記基因篩選標(biāo)記基因（二）用轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)研究基因的功能（二）用轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)研究基因的

20、功能 轉(zhuǎn)基因技術(shù)（轉(zhuǎn)基因技術(shù)（transgenic technologytransgenic technology）是指將外源基因是指將外源基因?qū)胧芫鸦蚺咛ジ杉?xì)胞（導(dǎo)入受精卵或胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell），即），即ES細(xì)細(xì)胞，通過胞，通過隨機(jī)重組隨機(jī)重組使外源基因插入細(xì)胞染色體使外源基因插入細(xì)胞染色體DNA。隨后將受精卵或隨后將受精卵或ES細(xì)胞植入假孕受體動物的子宮，使細(xì)胞植入假孕受體動物的子宮，使得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞發(fā)育成轉(zhuǎn)基因個體。得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞發(fā)育成轉(zhuǎn)基因個體。 轉(zhuǎn)基因動物（轉(zhuǎn)基因動物（transgenic animaltransgenic animal）是指應(yīng)用轉(zhuǎn)基因

21、技是指應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出的攜帶外源基因，并能穩(wěn)定遺傳的動物。術(shù)培育出的攜帶外源基因，并能穩(wěn)定遺傳的動物。轉(zhuǎn)基因小轉(zhuǎn)基因小鼠最為常見。鼠最為常見。 *基本流程基本流程*：transgenic animal transgenic animal 的制備步驟：的制備步驟：*Ptransgenic geneEnhancer NeoR (1) (1) 轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建；轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建；pronucleipronucleiES cellsES cells兩種方法：兩種方法：前核法前核法胚胎干細(xì)胞法胚胎干細(xì)胞法Fertilized eggFertilized egg(2) (2) 外源基因的導(dǎo)入受

22、精卵（或外源基因的導(dǎo)入受精卵（或ES cellES cell）細(xì)胞核內(nèi)；）細(xì)胞核內(nèi)；基本流程基本流程*：transgenic animal transgenic animal 的制備步驟：的制備步驟：*(1) (1) 轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建；轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建；transgenic animal transgenic animal 的制備步驟：的制備步驟：*Psuedopregnantmouse檢測子代是否檢測子代是否存在轉(zhuǎn)基因存在轉(zhuǎn)基因通過雜合子后代通過雜合子后代交配，獲得純合交配，獲得純合子轉(zhuǎn)基因動物子轉(zhuǎn)基因動物(1) 轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建；轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建；(2) 外源基因的導(dǎo)入受精

23、卵（或外源基因的導(dǎo)入受精卵（或ES cell）細(xì)胞核內(nèi)；）細(xì)胞核內(nèi)；(3) 上述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移植入假孕小鼠的子宮腔中；上述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移植入假孕小鼠的子宮腔中；(3)(4)(5)轉(zhuǎn)基因是隨機(jī)整合到染色體上。轉(zhuǎn)基因是隨機(jī)整合到染色體上。一般情況下，轉(zhuǎn)基因雜合子的幾一般情況下，轉(zhuǎn)基因雜合子的幾率在率在10-20% 10-20% 以下以下 1982年美國哈佛大學(xué)的一個科學(xué)家小組，將大鼠年美國哈佛大學(xué)的一個科學(xué)家小組，將大鼠的生長激素（的生長激素（rGH）基因與小鼠的金屬硫蛋白基因）基因與小鼠的金屬硫蛋白基因的啟動子順序連接，再引入質(zhì)粒中。科學(xué)家把這種的啟動子順序連接，再引入質(zhì)粒中?？茖W(xué)家把這種重組的質(zhì)粒

24、直接注射入小鼠受精卵中，經(jīng)過充分發(fā)重組的質(zhì)粒直接注射入小鼠受精卵中，經(jīng)過充分發(fā)育后終于分娩出了育后終于分娩出了21小鼠，其中有七只帶有融合基小鼠，其中有七只帶有融合基因，六只生長迅速，每只體重平均可達(dá)因，六只生長迅速，每只體重平均可達(dá)44g，超過同，超過同窩無融合基因小鼠（平均體重窩無融合基因小鼠（平均體重29g）的）的1.5倍，這就倍，這就是聞名于世的是聞名于世的“超級小鼠超級小鼠”。(2) As animal models ： HBV transgenic mice(3) 改良動物（植物）品種？改良動物（植物）品種？轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用(1) 基因功能的研究基因功能的研究轉(zhuǎn)基因

25、動物存在的問題轉(zhuǎn)基因動物存在的問題(1) 隨機(jī)插入，隨機(jī)插入，可能破壞抑癌基因等宿主基因；可能破壞抑癌基因等宿主基因；(2) 外源基因整合到宿主染色體上的拷貝數(shù)不確定；外源基因整合到宿主染色體上的拷貝數(shù)不確定；(3) 插入的外源基因的丟失。插入的外源基因的丟失。難點：難點：TK基因: 陰性篩選標(biāo)記基因SpecificRandom 【重點內(nèi)容重點內(nèi)容】2 2、基本流程基本流程* *1 1、定義定義 * *3 3、應(yīng)用、應(yīng)用一、一、 基因敲除基因敲除 二、二、 轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因 2 2、基本流程基本流程* *1 1、定義定義 * *3 3、應(yīng)用、應(yīng)用【拓展知識拓展知識】思考思考1：Primer 2Ne

26、oRPrimer 1Mouse genome如何如何鑒定發(fā)生了同源重組的基因敲除鑒定發(fā)生了同源重組的基因敲除ESES細(xì)胞細(xì)胞？提示：提示：Each arm should be about 3 Kb. Shorter than 2 Kb might result in a reduced frequency of recombination.Homologous armHomologous arm方法方法1 1 ：PCR Determination of homologous recombinant ES cells (hybrid)思考：思考：如何如何鑒定發(fā)生了同源重組的基因敲除鑒定發(fā)生了同源

27、重組的基因敲除ESES細(xì)胞細(xì)胞？用什么方法可以鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠？用什么方法可以鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠？要求：要求：明確轉(zhuǎn)基因是否存在、明確轉(zhuǎn)基因是否存在、轉(zhuǎn)基因整合到染色體的轉(zhuǎn)基因整合到染色體的拷貝數(shù)拷貝數(shù)思考：思考：qPCR考慮：考慮：用用EcoRI 酶切提取的轉(zhuǎn)基因酶切提取的轉(zhuǎn)基因動物的基因組，但轉(zhuǎn)進(jìn)去的基動物的基因組，但轉(zhuǎn)進(jìn)去的基因不會被切斷。因不會被切斷。 如何解釋上面的照片？如何解釋上面的照片？ 用什么方法可以鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠？用什么方法可以鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠？思考：思考：方法：方法：Southern blot有些基因是胚胎生長發(fā)育過程中非常重要的基因，有些基因是胚胎生長發(fā)育過程中非常重要的基因，一

28、旦被敲除可導(dǎo)致胚胎發(fā)育受損甚至不能發(fā)育為一旦被敲除可導(dǎo)致胚胎發(fā)育受損甚至不能發(fā)育為一個個體。一個個體。問：問：針對這類對于生長發(fā)育非常重要的基因，是否可針對這類對于生長發(fā)育非常重要的基因，是否可以在已經(jīng)形成個體的動物活體內(nèi)進(jìn)行以在已經(jīng)形成個體的動物活體內(nèi)進(jìn)行knock out knock out ？該如何達(dá)到上述目的呢？該如何達(dá)到上述目的呢？思考思考3：了解即可了解即可條件性基因敲除條件性基因敲除Conditional gene knockout利用利用可可誘導(dǎo)性啟動子誘導(dǎo)性啟動子和和Cre重組酶重組酶特異性識別位點構(gòu)特異性識別位點構(gòu)建基因敲除載體，通過誘導(dǎo)劑實現(xiàn)可控性基因敲除建基因敲除載體，通過誘導(dǎo)劑實現(xiàn)可控性基因敲除兩個要素：兩個要素：誘導(dǎo)型啟動子誘導(dǎo)型啟動子Cre重組酶重組酶Cre:是一種蛋白質(zhì)是一種蛋白質(zhì)(從噬菌體從噬菌體P1提取獲得提取獲得)名字來源于名字來源于cause recombination特異性識別特異性識別DNA序列序列 (34bp)LoxP (