SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量

1、整理課件1 SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量定蛋白質(zhì)分子量 整理課件2 SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳技術(shù)是動(dòng)物聚丙稀酰胺凝膠電泳技術(shù)是動(dòng)物生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)教學(xué)中一個(gè)重要實(shí)驗(yàn)之生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)教學(xué)中一個(gè)重要實(shí)驗(yàn)之一。一。整理課件3 能夠帶動(dòng)生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)綜合型能夠帶動(dòng)生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)綜合型實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的開設(shè)。實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的開設(shè)。 如：蛋白質(zhì)鹽析沉淀提取如：蛋白質(zhì)鹽析沉淀提取 葡聚葡聚糖凝膠層析分離糖凝膠層析分離 DEAE-纖維素分離纖維素分離提純蛋白質(zhì)提純蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)純度鑒定、蛋白蛋白質(zhì)純度鑒定、蛋白質(zhì)分子量測(cè)定等。質(zhì)分子量測(cè)定等。整理課件4一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康膎通過

2、該實(shí)驗(yàn)使學(xué)生掌握通過該實(shí)驗(yàn)使學(xué)生掌握SDS-PAGESDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理；測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理；n掌握該技術(shù)的操作方法（基礎(chǔ)性很掌握該技術(shù)的操作方法（基礎(chǔ)性很強(qiáng)，使用范圍寬闊強(qiáng)，使用范圍寬闊；n運(yùn)用運(yùn)用SDS-PAGESDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量測(cè)定蛋白質(zhì)分子量及染色鑒定。及染色鑒定。整理課件5二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 n帶電質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中向帶有異相電荷的電極移動(dòng)，帶電質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中向帶有異相電荷的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為這種現(xiàn)象稱為電泳。電泳。n電泳分類：移動(dòng)界面電泳、區(qū)帶電泳等。電泳分類：移動(dòng)界面電泳、區(qū)帶電泳等。n區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳 是在半固相或膠狀介質(zhì)上加一個(gè)點(diǎn)或一薄是

3、在半固相或膠狀介質(zhì)上加一個(gè)點(diǎn)或一薄層樣品溶液，然后加電場(chǎng)，分子在支持介質(zhì)上或支層樣品溶液，然后加電場(chǎng)，分子在支持介質(zhì)上或支持介質(zhì)中遷移。持介質(zhì)中遷移。 整理課件6 區(qū)帶電泳使用不同的支持介質(zhì)，有區(qū)帶電泳使用不同的支持介質(zhì)，有濾紙、纖維素粉、聚氯乙烯樹脂、淀濾紙、纖維素粉、聚氯乙烯樹脂、淀粉凝膠、瓊脂凝膠、醋酸纖維素膜，粉凝膠、瓊脂凝膠、醋酸纖維素膜，現(xiàn)在則多用現(xiàn)在則多用聚丙烯酰胺（聚丙烯酰胺（PAGEPAGE）和和瓊脂糖凝膠。瓊脂糖凝膠。整理課件7 （一）分類（一）分類 PAGEPAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類：兩大類： 1

4、. 1. 連續(xù)系統(tǒng)：連續(xù)系統(tǒng)：電泳體系中緩沖液電泳體系中緩沖液pHpH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，場(chǎng)作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。 整理課件8 2. 2.不連續(xù)系統(tǒng)不連續(xù)系統(tǒng)：由于緩沖液離子：由于緩沖液離子成分、成分、pHpH、凝膠濃度及電位梯度的、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在不連續(xù)性，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還還具有濃縮效應(yīng)，具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。晰度及分辨率均較前者佳。整理課件9 （二）特點(diǎn)：（二）特點(diǎn)

5、： SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDSSDS（十二（十二烷基磺酸鈉）。烷基磺酸鈉）。 整理課件10 蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的的SDSSDS溶液中，與溶液中，與SDSSDS分子按比例結(jié)合，分子按比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的形成帶負(fù)電荷的SDS-SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。蛋白質(zhì)復(fù)合物。 蛋白質(zhì)喪失了原有的蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)電荷狀態(tài)形成形成僅保持原有分子大小僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)為特征的負(fù)離子團(tuán)塊，塊，降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電

6、荷差異天然的電荷差異，因此在進(jìn)行電泳時(shí)，因此在進(jìn)行電泳時(shí)，整理課件11蛋白質(zhì)分蛋白質(zhì)分子移速度取決于分子大小。子移速度取決于分子大小。當(dāng)分子量在當(dāng)分子量在15000KD15000KD到到200000KD200000KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系呈線性關(guān)系。合下式：合下式： ，式中，式中 將已知分子量的將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲

7、線上求得分子量。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。整理課件12圖1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)與待測(cè)樣品電泳圖譜 圖2 電泳遷移率與logMW之間的關(guān)系 94 00062 00043 00031 00020 10014 400膠槽膠槽123注：膠槽1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白；膠槽2、3 樣品蛋白得到同行專家贊整理課件13 采用采用SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)蛋白質(zhì)分子量時(shí)，必須法測(cè)蛋白質(zhì)分子量時(shí)，必須完全打開完全打開蛋白質(zhì)之間的二硫鍵，使蛋白質(zhì)分子蛋白質(zhì)之間的二硫鍵，使蛋白質(zhì)分子被解聚，被解聚，SDSSDS才能定量地結(jié)合到亞基才能定量地結(jié)合到亞基上。上。因此在用因此在用SDSSDS處理樣品同時(shí)用處理樣品同

8、時(shí)用巰巰基乙醇處理基乙醇處理。巰基乙醇是一種強(qiáng)還原劑，它使被還原的二硫鍵不易再氧化，從巰基乙醇是一種強(qiáng)還原劑，它使被還原的二硫鍵不易再氧化，從而使很多不溶性蛋白質(zhì)溶解而與而使很多不溶性蛋白質(zhì)溶解而與SDSSDS定量結(jié)合。定量結(jié)合。整理課件14 三、三、 實(shí)驗(yàn)試劑和器材實(shí)驗(yàn)試劑和器材 材料材料 實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)試劑 1.低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑盒: 兔磷酸化酶兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌動(dòng)蛋白兔肌動(dòng)蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制劑胰蛋白酶抑制劑 MW=20,100 雞蛋清溶菌酶雞蛋清溶菌酶 MW=1

9、4,400 開封后溶于開封后溶于200l蒸餾水，置蒸餾水，置-20保存，使用前室溫融化，沸水浴中加熱保存，使用前室溫融化，沸水浴中加熱3-5分鐘后上樣。分鐘后上樣。 樣品樣品1：稱：稱3mg樣品樣品1，加，加2 ml蒸餾水溶解蒸餾水溶解。整理課件15 2. 30%丙烯酰胺（丙烯酰胺（Acr）：稱）：稱Acr30g，甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺 （Bis）0.8g，加蒸餾水至，加蒸餾水至100ml，過濾，過濾后置棕色瓶中后置棕色瓶中 3. 10%SDS（十二烷基磺酸鈉）（十二烷基磺酸鈉） 4. 1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl緩沖液：稱緩沖液：稱取取Tris18.2g（PH計(jì)）計(jì)）

10、整理課件16 （7）10%過硫酸銨過硫酸銨(AP) （8）TEMED（四甲基乙二胺）（四甲基乙二胺） （9）樣品溶解液：）樣品溶解液：SDS（100mg）+巰基乙醇（巰基乙醇（0.1ml）+ 溴酚藍(lán)（溴酚藍(lán)（2mg）+甘油（甘油（2g） +0.05mol/L pH8.0Tris- HCl（2ml），最后定容至），最后定容至10ml。 （10）固定液：?。┕潭ㄒ海喝?0%甲醇甲醇454ml，冰乙酸，冰乙酸46ml混勻。混勻。 （11）染色液：稱取考馬斯亮藍(lán)）染色液：稱取考馬斯亮藍(lán)R250 0.125g，加上述固，加上述固定液定液 250ml， 過濾后備用。過濾后備用。 （12）脫色液：冰乙酸）脫

11、色液：冰乙酸75ml，甲醇，甲醇50ml，加蒸餾水定容，加蒸餾水定容至至1000ml。 （13）電極緩沖液（內(nèi)含）電極緩沖液（內(nèi)含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸緩沖液甘氨酸緩沖液pH8.3）：稱）：稱Tris6.0g，甘，甘 氨酸氨酸28.8g，加入，加入SDS1g，加蒸餾水使其溶解后定容至，加蒸餾水使其溶解后定容至1000ml。 整理課件17實(shí)驗(yàn)器材實(shí)驗(yàn)器材n 垂直板電泳裝置垂直板電泳裝置n直流穩(wěn)壓電源電泳厚膠濃度后要做直流穩(wěn)壓電源電泳厚膠濃度后要做8各小時(shí)，薄膠各小時(shí)，薄膠5各小時(shí)）各小時(shí)）n 電泳儀電泳儀n 標(biāo)準(zhǔn)型酸度計(jì)（標(biāo)準(zhǔn)型酸度計(jì)（TLD80

12、-2B）n 離心機(jī)等離心機(jī)等整理課件18 四、四、實(shí)驗(yàn)過程實(shí)驗(yàn)過程 如：如：免疫球蛋白免疫球蛋白G G 分子量的測(cè)定分子量的測(cè)定 （一）血清（一）血清- -球蛋白的提取球蛋白的提取 硫酸胺鹽析沉淀法硫酸胺鹽析沉淀法 （二）（二） - -球蛋白脫鹽純化球蛋白脫鹽純化 葡聚糖凝膠過濾（柱層析法）除去硫酸胺，得到葡聚糖凝膠過濾（柱層析法）除去硫酸胺，得到- -球蛋白球蛋白（去年完成的基金項(xiàng)目）（去年完成的基金項(xiàng)目） （三）純化免疫球蛋白（三）純化免疫球蛋白G G DEAE-DEAE-離子交換纖維素法純化免疫球蛋白離子交換纖維素法純化免疫球蛋白G G。 （四）（四） SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

13、法測(cè)定聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定血液免疫球血液免疫球蛋白蛋白G G的分子量的分子量（ 連續(xù)四個(gè)單項(xiàng)實(shí)驗(yàn)）。 整理課件19 （1 1）制膠）制膠（簡(jiǎn)單敘述（簡(jiǎn)單敘述）（雙層膠，摸索膠濃度）（雙層膠，摸索膠濃度） A.A.將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干, , 準(zhǔn)備準(zhǔn)備2 2個(gè)干個(gè)干凈的錐形瓶。把玻璃板在灌膠支架上固定好。凈的錐形瓶。把玻璃板在灌膠支架上固定好。 B.B.按比例配好按比例配好分離膠，分離膠，溶液立即傾入制膠溶液立即傾入制膠模板中模板中(1 5(1 5模板模板) )，加少許蒸餾水，待膠凝，加少許蒸餾水，待膠凝固后，倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干，按比固后，倒出水并用濾紙

14、把剩余的水分吸干，按比例例配好濃縮膠，配好濃縮膠，連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5mm5mm處，樣梳需一次平穩(wěn)插入，靜置處，樣梳需一次平穩(wěn)插入，靜置4040分鐘，待模板分鐘，待模板中的膠定型后，輕輕取出梳形樣品槽模具，梳口中的膠定型后，輕輕取出梳形樣品槽模具，梳口處不得有氣泡，拔出樣梳后，在上槽內(nèi)加入緩沖處不得有氣泡，拔出樣梳后，在上槽內(nèi)加入緩沖液。液。 整理課件20 C.C.拔出樣梳后拔出樣梳后, ,在上槽內(nèi)加入緩沖液在上槽內(nèi)加入緩沖液, , D. D.加樣（摸索加樣量）加樣（摸索加樣量） 取取10l標(biāo)準(zhǔn)蛋白標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶解液于溶解液于EP管內(nèi)，再加入管內(nèi)，再加入10l 2

15、倍樣品緩沖液，上樣量為倍樣品緩沖液，上樣量為20l。 取取10l樣品溶液樣品溶液，再加入，再加入10l 2倍樣品緩沖液，上倍樣品緩沖液，上樣量分別為樣量分別為5l 和和10l。 E.E.用微量注射器距槽底三分之一處進(jìn)樣用微量注射器距槽底三分之一處進(jìn)樣, ,加樣前加樣前, ,樣品在沸水中樣品在沸水中加熱加熱3 3分鐘，去掉亞穩(wěn)態(tài)聚合。分鐘，去掉亞穩(wěn)態(tài)聚合。整理課件21 F.F.電泳槽中加入緩沖液，電泳槽中加入緩沖液，接通電源，進(jìn)行接通電源，進(jìn)行電泳，開始電流恒定在電泳，開始電流恒定在8mA，（電流、電壓），（電流、電壓）當(dāng)進(jìn)入分離膠后改為當(dāng)進(jìn)入分離膠后改為16mA，溴酚藍(lán)距凝膠邊，溴酚藍(lán)距凝膠邊

16、緣約緣約5mm時(shí)，停止電泳。時(shí)，停止電泳。 G.G.凝膠板剝離與染色凝膠板剝離與染色 電泳結(jié)束后，撬開電泳結(jié)束后，撬開玻璃板，將凝膠板做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，玻璃板，將凝膠板做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入染色液，染色加入染色液，染色 過夜。過夜。 H.H.脫色脫色 染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數(shù)染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色次，再用脫色液脫色 。剝膠時(shí)要小心剝膠時(shí)要小心, ,保持膠完好無損保持膠完好無損, ,染色要充分染色要充分。整理課件22圖1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)與待測(cè)樣品電泳圖譜 圖2 電泳遷移率與logMW之間的關(guān)系 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析94 00062 00043

17、00031 00020 10014 400膠槽膠槽123注：膠槽1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白；膠槽2、3 樣品蛋白整理課件23六、分析計(jì)算六、分析計(jì)算繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：按下式計(jì)算 電泳遷移率電泳遷移率 = 樣品遷移距離樣品遷移距離/溴酚籃遷移距離溴酚籃遷移距離 以每個(gè)以每個(gè)蛋白標(biāo)準(zhǔn)的分子量對(duì)數(shù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)的分子量對(duì)數(shù)對(duì)它的相對(duì)對(duì)它的相對(duì)遷移遷移率作圖率作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測(cè)出其分于量，這樣的標(biāo)難曲線只對(duì)出其分于量，這樣的標(biāo)難曲線只對(duì)同一塊凝膠同一塊凝膠上的上的樣品的分子量測(cè)定才具有可靠性。樣品的分子量測(cè)定才具有可靠性。整理課件24 標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量（

18、標(biāo)準(zhǔn)試劑盒）：標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量（標(biāo)準(zhǔn)試劑盒）： 97400kD、66200kD、43000kD、 31000kD、20100kD、14400kD。 采用不連續(xù)采用不連續(xù)SDS-PAGE電泳法對(duì)所分電泳法對(duì)所分離純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行純度鑒定，發(fā)現(xiàn)圖中離純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行純度鑒定，發(fā)現(xiàn)圖中電泳圖譜可以清晰的看到電泳圖譜可以清晰的看到兩條蛋白帶兩條蛋白帶。整理課件25 兩條蛋白帶代表兩條蛋白帶代表綿羊免疫球蛋白綿羊免疫球蛋白G的重的重鏈和輕鏈。鏈和輕鏈。 計(jì)算分析結(jié)果表明：計(jì)算分析結(jié)果表明： 綿羊血清綿羊血清lgG重鏈和輕鏈的分子量分別重鏈和輕鏈的分子量分別為為50000和和28000Kd。一般說來，當(dāng)?shù)鞍?/p>

19、。一般說來，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在質(zhì)的分子量在200000至至15000 kD 之間之間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)時(shí)，電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系系 。實(shí)驗(yàn)結(jié)果各譜帶所代表的成分的分子實(shí)驗(yàn)結(jié)果各譜帶所代表的成分的分子量的范圍均在此之間。量的范圍均在此之間。用用SDS-PAGE垂直板電泳測(cè)得綿羊血清具有一定的垂直板電泳測(cè)得綿羊血清具有一定的可信度可信度 。 整理課件26 七、思考題七、思考題n在不連續(xù)體系在不連續(xù)體系SDS-PAGESDS-PAGE中中, ,當(dāng)分離膠加完后當(dāng)分離膠加完后, ,需需在其上加一層水在其上加一層水, ,為什么為什么? ?n在不連續(xù)體系在不連續(xù)體系SDS-PAGESDS-PAGE中中, ,分離膠與濃縮膠中分離膠與濃縮膠中均含有均含有TEMEDTEMED和和AP,AP,試述其作用試述其作用? ?n樣品液為何在加樣前需在沸水中加熱幾分鐘樣品液為何在加樣前需在沸水中加熱幾分鐘? ?整理課件27 十二、達(dá)到預(yù)期目標(biāo)十二、達(dá)到預(yù)期目標(biāo) 1. SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳技術(shù)聚丙稀酰胺凝膠電泳技術(shù)是動(dòng)是動(dòng)物生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)教學(xué)中物生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)教學(xué)中一個(gè)綜合性實(shí)一個(gè)綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目驗(yàn)項(xiàng)目， 且是一個(gè)較高水平的一個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)且是一個(gè)較高水平的一個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。目。 整理課件28 蛋白質(zhì)鹽析沉淀提取蛋白質(zhì)鹽析沉淀提取 凝膠層析分離（上年基金項(xiàng)目已完成）凝膠層析分