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文檔簡介

1、ZFN 由鋅指蛋白(ZFP)和 Fok核酸內(nèi)切酶組成。其中,由 ZFP 構(gòu)成的 DNA 識別域能識別特異位點并與之結(jié)合,而由Fok構(gòu)成的切割域能執(zhí)行剪切功能,兩者結(jié)合可使靶位點的雙鏈DNA 斷裂(DSB)。于是, 細胞可以通過同源重組(HR)修復機制和非同源末端連接(NHEJ)修復機制來修復 DNA。HR 修復有可能會對靶標位點進行恢復修飾或者插入修飾,而 NHEJ 修復極易發(fā)生插入突變或缺失突變。兩者都可造成移碼突變,因此達到基因敲除的目的。TALENs 包含兩個 TALEN 蛋白, 每個 TALEN 都是由 TALE array 與 Fok融合而成. 其中一個 TALEN 靶向正義鏈上靶標

2、位點, 另一個則靶向反義鏈上的靶標位點. 然后 Fok形成二聚體, 在靶向序列中間的 spacer 處切割 DNA, 造成雙鏈 DNA 斷裂, 隨后細胞啟動 DNA 損傷修復機制. 針對不同的TALEN 骨架, 其最適宜的spacer長度不同, 其長度范圍一般為1220 bp. 實驗結(jié)果表明, TALENs在靶向DNA時, 第一個堿基為 T 時其結(jié)合效果更佳。3. CRISPR /Cas9 基因組編輯技術(shù)CRISPR/Cas 系統(tǒng)由 Cas9 核酸內(nèi)切酶與sgRNA構(gòu)成. 轉(zhuǎn)錄的 sgRNA 折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)后與 Cas9 蛋白形成復合體, 指導 Cas9 核酸內(nèi)切酶識別特定靶標位點, 在 PAM 序列上游處切割 DNA 造成雙鏈 DNA 斷裂, 并啟動 DNA 損傷修復機制. 從不同菌種中分離的 CRISPR/Cas 系統(tǒng), 其 CrRNA(或者是人工構(gòu)建的sg

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