實(shí)驗(yàn)五重組DNA技術(shù)

1、12復(fù)復(fù) 制制翻翻 譯譯轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 錄錄不同來源的不同來源的DNADNA分子通過磷酸二酯鍵連接成新的分子通過磷酸二酯鍵連接成新的DNADNA分子，分子，這一過程稱為這一過程稱為DNADNA重組。基因重組是自然界的一種常見現(xiàn)象，重組?；蛑亟M是自然界的一種常見現(xiàn)象，是物種演變、生物進(jìn)化的基礎(chǔ)。是物種演變、生物進(jìn)化的基礎(chǔ)。不同來源不同來源的的DNADNA分子分子重組重組DNADNA分子分子基因重組基因重組3 在分子水平上在分子水平上, ,根據(jù)人們的需要以人工的方法取得感根據(jù)人們的需要以人工的方法取得感興趣的目的基因興趣的目的基因, ,在體外與載體在體外與載體DNADNA分子重組分子重組, ,然后將重組然

2、后將重組分子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞分子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞, ,并篩選出能表達(dá)重組并篩選出能表達(dá)重組DNADNA的活細(xì)胞的活細(xì)胞, ,加加以純化、擴(kuò)增，成為克隆。以純化、擴(kuò)增，成為克隆。 克?。簛碜酝皇甲娴南嗤北净蚩截惖募?。如細(xì)克隆：來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。如細(xì)菌克隆、動(dòng)物克隆和分子（菌克隆、動(dòng)物克隆和分子（DNADNA）克隆等。）克隆等。Restriction enzymes: 選（分）選（分）切切接接轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)篩篩擴(kuò)擴(kuò)重組重組DNADNA技術(shù)的基本過程技術(shù)的基本過程5其作用是：其作用是：n攜帶目的基因攜帶目的基因DNADNA（或外源（或外源DNA)DNA)進(jìn)入宿主細(xì)胞（大腸桿進(jìn)入宿主細(xì)胞（大腸桿

3、菌，哺乳動(dòng)物細(xì)胞等）。菌，哺乳動(dòng)物細(xì)胞等）。n使外源使外源DNADNA在宿主細(xì)胞復(fù)制擴(kuò)增或表達(dá)。在宿主細(xì)胞復(fù)制擴(kuò)增或表達(dá)。 載體的選擇載體的選擇常用載體：常用載體：質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA，噬菌體，噬菌體DNADNA，病毒，病毒DNADNA61能在宿主細(xì)胞中獨(dú)立復(fù)制，并能攜帶重組能在宿主細(xì)胞中獨(dú)立復(fù)制，并能攜帶重組DNA片段片段一同擴(kuò)增；一同擴(kuò)增；2有合適的限制性酶切位點(diǎn)便于進(jìn)行克??；有合適的限制性酶切位點(diǎn)便于進(jìn)行克??；3載體分子應(yīng)盡量小，可插入較大的外源載體分子應(yīng)盡量小，可插入較大的外源DNA而不影而不影響復(fù)制；響復(fù)制；4有一定的篩選標(biāo)記，易于識(shí)別和篩選；有一定的篩選標(biāo)記，易于識(shí)別和篩選；5表達(dá)

4、型載體應(yīng)配備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子、前表達(dá)型載體應(yīng)配備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、增強(qiáng)子等調(diào)控元件；導(dǎo)序列、增強(qiáng)子等調(diào)控元件；6生物安全性好。生物安全性好。 載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)7insertBamHIreplication8存在于細(xì)菌染色體外的小存在于細(xì)菌染色體外的小的共價(jià)、閉環(huán)雙鏈的共價(jià)、閉環(huán)雙鏈DNADNA分分子。子。 （1）9本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的質(zhì)粒本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的質(zhì)粒10質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的提取和鑒定的提取和鑒定n堿裂解法抽提質(zhì)粒堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA: 利用基因組利用基因組DNA和質(zhì)粒和質(zhì)粒DNA變性和復(fù)性的差變性和復(fù)性的差異來分離提取質(zhì)粒。異來分離提取質(zhì)粒。在在pH高達(dá)高

5、達(dá)12.6的條件下，染色體的條件下，染色體DNA的氫鍵斷的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但它的的大部分氫鍵也斷裂，但它的超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離，當(dāng)以超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離，當(dāng)以pH4.8的醋酸的醋酸鉀高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其鉀高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)又恢復(fù)原來的構(gòu)型。而染色體型。而染色體DNA不易復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。不易復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。n進(jìn)一步用氯仿使蛋白質(zhì)變性去除蛋白雜質(zhì)，用無水乙醇沉淀質(zhì)粒進(jìn)一步用氯仿使蛋白質(zhì)變性去除蛋白雜質(zhì)，

6、用無水乙醇沉淀質(zhì)粒DNA，可得到純化的質(zhì)?？傻玫郊兓馁|(zhì)粒DNA。11 將菌液倒入將菌液倒入1.5ml離心管中離心管中(盡量倒?jié)M盡量倒?jié)M) 12000rpm /30s (沉淀菌體沉淀菌體) 在原管中重復(fù)上述操作在原管中重復(fù)上述操作1次次 棄上清扣干棄上清扣干,加入預(yù)冷的加入預(yù)冷的solution 100L,劇烈振蕩打散菌體劇烈振蕩打散菌體, 冰浴冰浴5min （以下操作要輕柔）（以下操作要輕柔） 加入新配制的加入新配制的solution 200L,溫和顛倒離心管溫和顛倒離心管23次混勻，室溫放置次混勻，室溫放置5min （此時(shí)液體應(yīng)由混濁變?yōu)橥该髡吵恚ù藭r(shí)液體應(yīng)由混濁變?yōu)橥该髡吵恚?加入預(yù)冷

7、的加入預(yù)冷的solution 150L, 溫和顛倒離心管溫和顛倒離心管23次混勻，冰浴次混勻，冰浴5min 離心離心12000rpm/5min 小心將含有質(zhì)粒小心將含有質(zhì)粒DNA的上清移至另一離心管中的上清移至另一離心管中 加等體積氯仿加等體積氯仿,輕微振蕩，離心輕微振蕩，離心12000rpm /2min 轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管 加入加入2倍體積冰冷無水乙醇倍體積冰冷無水乙醇,輕輕混勻室溫放置輕輕混勻室溫放置2分鐘分鐘 離心離心12000rpm /5min 棄上清棄上清,加入加入70%乙醇洗滌沉淀，離心乙醇洗滌沉淀，離心12000rpm /2min，棄上清，棄上清 重復(fù)洗

8、滌重復(fù)洗滌1次次棄上清，液體盡量倒凈并在吸水紙上扣干棄上清，液體盡量倒凈并在吸水紙上扣干 室溫放置室溫放置15min干燥干燥 加入加入1TE 30L 溶解質(zhì)粒溶解質(zhì)粒,用于定量分析、電泳檢測(cè)等。用于定量分析、電泳檢測(cè)等。12nSolution I 中的中的EDTA可以螯合二價(jià)金屬離子進(jìn)而抑制依可以螯合二價(jià)金屬離子進(jìn)而抑制依賴于二價(jià)金屬離子的賴于二價(jià)金屬離子的DNA酶的活性，對(duì)酶的活性，對(duì)DNA起到保護(hù)作起到保護(hù)作用。加入用。加入solution后一定要充分打散菌體。后一定要充分打散菌體。nSolution II要新鮮配置要新鮮配置,NaOH可吸收空氣中的二氧化碳而可吸收空氣中的二氧化碳而減弱堿

9、性。加入減弱堿性。加入solution II后放置時(shí)間不要超過后放置時(shí)間不要超過5min，以，以免變性質(zhì)粒不易復(fù)性。免變性質(zhì)粒不易復(fù)性。n加入加入solution II后液體應(yīng)由混濁變?yōu)橥该髡吵?，可見拉絲后液體應(yīng)由混濁變?yōu)橥该髡吵?，可見拉絲現(xiàn)象。若沒有上述現(xiàn)象發(fā)生，則實(shí)驗(yàn)不能繼續(xù)下去，應(yīng)檢現(xiàn)象。若沒有上述現(xiàn)象發(fā)生，則實(shí)驗(yàn)不能繼續(xù)下去，應(yīng)檢查試劑配制及操作是否有誤，然后重新開始。查試劑配制及操作是否有誤，然后重新開始。n質(zhì)粒質(zhì)粒DNA提取過程中動(dòng)作要輕柔，以免對(duì)提取過程中動(dòng)作要輕柔，以免對(duì)DNA造成損傷。造成損傷。13為什么用無水乙醇沉淀為什么用無水乙醇沉淀DNADNA？ n這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉

10、淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。nDNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實(shí)驗(yàn)中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67左右。14瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒DNA DNA的電泳原理與蛋白質(zhì)電泳基本相同。在pH高于其pI時(shí)，DNA分子帶負(fù)電荷，在直流電場(chǎng)中DNA向正極泳動(dòng)。不同的DNA分子因所帶電荷、構(gòu)象和分子量大小不同，在同一電泳系統(tǒng)中的泳動(dòng)速度存在差異，因而可以使核酸片段彼此分離，并檢測(cè)其分子大小。電

11、泳后的凝膠浸泡于熒光染料（如溴化乙錠）中，染料分子可嵌入DNA分子堿基之間，在紫外線照射下發(fā)出熒光，可觀察到核酸片段所在的位置和亮度，從而對(duì)DNA進(jìn)行定性或定量測(cè)定。 15瓊脂糖凝膠分離范圍瓊脂糖凝膠分離范圍 瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度% % 線狀線狀DNADNA分子分離范圍分子分離范圍KbKb 0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2瓊脂糖凝膠的濃度可根瓊脂糖凝膠的濃度可根據(jù)據(jù)DNA分子的大小來確分子的大小來確定，一般基因組定，一般基因組DNA可可用用0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，質(zhì)粒電

12、泳檢測(cè)，質(zhì)粒DNA選選擇擇1瓊脂糖凝膠，而瓊脂糖凝膠，而對(duì)只有幾百個(gè)堿基對(duì)的對(duì)只有幾百個(gè)堿基對(duì)的寡核苷酸可制備濃度更寡核苷酸可制備濃度更高一些的瓊脂糖凝膠。高一些的瓊脂糖凝膠。161凝膠板的制備2灌膠3待膠凝固完全后，將鋪膠的有機(jī)玻璃膠槽放在電泳槽中，加入0.5TBE電泳緩沖液，液面高于凝膠面約0.5cm ，輕輕拔出梳子。4加樣：將質(zhì)粒DNA作為上樣樣品。將樣品10L和上樣緩沖液6：1混勻，用微量加樣器將樣品分別加入膠板的樣品小槽內(nèi)（注意：加樣時(shí)應(yīng)防止加樣器頭碰壞凝膠孔壁）。5電泳：靠近樣品槽一端連接負(fù)極，另一端連接正極，接通電源，開始電泳，控制電壓在80-100V左右 。當(dāng)染料條帶移動(dòng)到距離凝膠前沿1cm時(shí)，停止電泳。6染色：將電泳后的膠板小心推進(jìn)含溴化乙錠（0.5g/mL）的染色液中，室溫下浸泡約30min。7觀察：小心取出凝膠并用水輕輕沖洗膠表面的溴化乙錠溶液，將凝膠放在紫外燈觀察臺(tái)上，在波長(zhǎng)254nm紫外燈下進(jìn)行觀察。8結(jié)果分析：在DNA存在的位置呈現(xiàn)橘紅色熒光，肉眼可觀察到清晰的條帶。質(zhì)粒DNA由于不同構(gòu)型的DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移率不同，因此在瓊脂糖凝膠電泳可出現(xiàn)三條電泳帶，分別為三種構(gòu)型的質(zhì)粒DN