微生物日常檢測(cè)項(xiàng)目

1、微生物日常檢測(cè)項(xiàng)目微生物日常檢測(cè)項(xiàng)目食品檢測(cè)1水質(zhì)檢測(cè)2公共衛(wèi)生3CONTENT Part 01 Life isnt about waiting for the storm to pass. its about learning to dance in the rain. 日常檢測(cè)項(xiàng)目菌落總數(shù)GB4789.2-2016大腸菌群GB4789.3-2016 GB/T4789.3-2003 14934-2016（餐具）沙門氏菌GB4789.4-2016金黃色葡萄球菌GB4789.10-2016霉菌+酵母GB4789.15-2016單細(xì)胞增生李斯特GB4789.30-2016溶血性鏈球菌GB4789.

2、11-2014志賀氏菌GB4789.5-2012商業(yè)無菌GB4789.26-2013菌落總數(shù)aerobicplatecountYOUR TITLE 定義：食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下(如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間等)培養(yǎng)后，所得每g(mL)檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)。 菌落總數(shù)并不能區(qū)分其中細(xì)菌的種類，所以有時(shí)被稱為雜菌數(shù)，需氧菌數(shù)等。 菌落總數(shù)測(cè)定是用來判定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量，它反映食品在生產(chǎn)過程中是否符合衛(wèi)生要求，以便對(duì)被檢樣品做出適當(dāng)?shù)男l(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)。菌落總數(shù)的多少在一定程度上標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣。菌落總數(shù)aerobicplatecountYOUR TITLE 樣品的稀釋：

3、固體和半固體樣品:稱取25g樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)， 8000r/min10000r/min均質(zhì)1min2min，或放入盛有225mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式 均質(zhì)器拍打1min2min，制成110的樣品勻液。液體樣品:以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶 (瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中，充分混勻，制成110的樣品勻液。用1mL無菌吸管或微量移液器吸取110樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面)，振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成110

4、0的樣品勻液。 制備10 倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1 次1 mL 無菌吸管或吸頭。 接種：根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2個(gè)3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液)，在 進(jìn)行10倍遞增稀釋時(shí)，吸取1mL樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。同時(shí)，分別吸取 1mL空白稀釋液加入兩個(gè)無菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。及時(shí)將15mL20mL冷卻至46 的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(可放置于461恒溫水浴箱 中保溫)傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。菌落總數(shù)aerobicplatecountYOUR TITLE 培養(yǎng)：待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，361培養(yǎng)48h2h。水產(chǎn)品301培養(yǎng)72h3h。

5、 如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長(zhǎng)的菌落時(shí)，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層 瓊脂培養(yǎng)基(約4mL)，凝固后翻轉(zhuǎn)平板，按以上條件進(jìn)行培養(yǎng)。 計(jì)數(shù)：可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以 6菌落形成單位(colony-formingunits，CFU)表示。 選取菌落數(shù)在30CFU300CFU之間、無蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300CFU的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的 平均數(shù)。其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋 度的菌落數(shù);若片

6、狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2，代表一個(gè)平板菌落數(shù)。 當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長(zhǎng)時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。菌落總數(shù)aerobicplatecountYOUR TITLE 計(jì)算：若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平 均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每g(mL)樣品中菌落總數(shù)結(jié)果。 若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按式(1)計(jì)算若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300CFU，則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可 記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。若所有稀

7、釋度的平板菌落數(shù)均小于30CFU，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30CFU300CFU之間，其中一部分小于30CFU 或大于 300CFU 時(shí)，則以最接近30CFU或300CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。菌落總數(shù)aerobicplatecountYOUR TITLE 示例：稀釋度稀釋度1:100（第一稀釋度）（第一稀釋度）1:1000（第二稀釋度）（第二稀釋度）結(jié)果結(jié)果菌落數(shù)（CFU）232，24423，252.4104232，24433，352.510423，2

8、43，22.41031325，1337325，3313.3105325，33115，143.3104l 一個(gè)稀釋度在30300之間：N=（232+244）/2100=23800 四舍五入：2.4104l 兩個(gè)稀釋度在30300之間：l 兩個(gè)稀釋度均30：N=（23+24）/2100=2350 四舍五入：2.4103l 兩個(gè)稀釋度均300：N=（325+331）/21000=328000 四舍五入：3.3105l 兩個(gè)稀釋度一個(gè)300，一個(gè)30：N=（325+331）/2100=32800 四舍五入：3.3104大腸菌群ColiformsYOUR TITLE 在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣

9、的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。大腸菌群并非細(xì)菌學(xué)分類命名，而是衛(wèi)生細(xì)菌領(lǐng)域的用語，它不代表某一個(gè)或某一屬細(xì)菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致。一般認(rèn)為該菌群細(xì)菌可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌等。大腸菌群是作為糞便污染指標(biāo)菌提出來的，主要是以該菌群的檢出情況來表示食品中有否糞便污染。檢測(cè)方法：GB4789.3-2016 第一法MPN法 第二法平板計(jì)數(shù)法 GB/T4789.3-2003 MPN法大腸菌群ColiformsMPNMPN法：（法：（20162016）稀釋稀釋 同菌落總數(shù)初發(fā)酵試驗(yàn)初發(fā)酵試驗(yàn) 每個(gè)

10、樣品，選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可以選擇原液)，每個(gè)稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯，每管接種1mL(如接種量超過1mL，則用雙料 LST肉湯)，361培養(yǎng)24h2h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，24h2h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)(證實(shí)試驗(yàn))，如未 產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h2h，產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)( (證實(shí)試驗(yàn)證實(shí)試驗(yàn)) ) 用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)管中，361培養(yǎng)48h2h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計(jì)為大腸菌群陽性管。報(bào)告報(bào)告 按以上確證的大腸菌群BGLB陽性管

11、數(shù)，檢索 MPN 表(見附錄B)，報(bào)告每g(mL)樣品中大腸菌群的MPN值大腸菌群Coliforms大腸菌群ColiformsMPNMPN法：（法：（20032003）乳糖發(fā)酵試驗(yàn)乳糖發(fā)酵試驗(yàn) 將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1 mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管，1 mL及1 mL以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種三管，置36C士1C溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24 h士2h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。分離培養(yǎng)分離培養(yǎng) 將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置36士1溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18h24h，然后取出，觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏

12、染色和證實(shí)試驗(yàn)。證實(shí)試驗(yàn)證實(shí)試驗(yàn) 在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1個(gè)2個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置36士1培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h士2h，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌，即可報(bào)告為大腸菌群陽性。大腸菌群ColiformsMPN法：（2003）大腸菌群ColiformsMPN法：2003 2016對(duì)比20032003（MPN/100gMPN/100g，mlml）20162016（MPN/gMPN/g，mlml）乳糖膽鹽發(fā)酵管(24h)月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯(24h，48h)EMB分離/革蘭氏染色鏡檢/乳糖發(fā)酵管(24h)煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)

13、管（48h)乳糖膽鹽發(fā)酵管LSTBGLBEMB大腸菌群Coliforms平板計(jì)數(shù)法：平板計(jì)數(shù)法：20162016 稀釋：稀釋：同菌落總數(shù) 培養(yǎng)：培養(yǎng)：及時(shí)將15mL20mL融化并恒溫至46的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)約傾注于每個(gè)平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3mL4mLVRBA 覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于361培養(yǎng)18h24h 菌落選擇：菌落選擇：選取菌落數(shù)在15CFU150CFU之間的平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落 (如菌落直徑較典型菌落小)。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大，最低稀釋度平板低

14、于15CFU的記錄具體菌落數(shù)。 證實(shí)試驗(yàn)：證實(shí)試驗(yàn)：從VRBA平板上挑取10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落，少于10個(gè)菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，361培養(yǎng)24h48h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣， 即可報(bào)告為大腸菌群陽性。大腸菌群Coliforms平板計(jì)數(shù)法：平板計(jì)數(shù)法：20162016 大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告：大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告：經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽性的試管比例乘以計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每 g(mL)樣品中大腸菌群數(shù)。例:10-4樣品稀釋液1mL，在 VRBA 平板上有100個(gè)典型和可疑菌落，挑 取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管，證實(shí)有

15、6個(gè)陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為:1006/10104/g(mL)= 6.0105CFU/g(mL)。若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。大腸菌群Coliforms餐具：餐具：14934-201614934-2016沙門氏菌Salmonella 1885年沙門氏等在霍亂流行時(shí)分離到豬霍亂沙門氏菌，故定名為沙門氏菌屬。沙門氏菌屬有的專對(duì)人類致病，有的只對(duì)動(dòng)物致病，也有對(duì)人和動(dòng)物都致病。沙門氏菌病是指由各種類型沙門氏菌所引起的對(duì)人類、家畜以及野生禽獸不同形式的總稱。感染沙門氏菌的人或帶菌者的糞便污染食品，可使人發(fā)生食物中毒。據(jù)統(tǒng)計(jì)在世界各國(guó)的種類細(xì)菌

16、性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首。我國(guó)內(nèi)陸地區(qū)也以沙門氏菌為首位。 沙門氏菌病的病原體。屬腸桿菌科，革蘭氏陰性腸道桿菌。已發(fā)現(xiàn)的近一千種（或菌株）。按其抗原成分，可沙門氏菌分為甲、乙、丙、丁、戊等基本菌組。其中與人體疾病有關(guān)的主要有甲組的副傷寒甲桿菌，乙組的副傷寒乙桿菌和鼠傷寒桿菌，丙組的副傷寒丙桿菌和豬霍亂桿菌，丁組的傷寒桿菌和腸炎桿菌等。除傷寒桿菌、副傷寒甲桿菌和副傷寒乙桿菌引起人類的疾病外，大多數(shù)僅能目引起家畜、鼠類和禽類等動(dòng)物的疾病，但有時(shí)也可污染人類的食物而引起食物中毒。 沙門氏菌在水中不易繁殖，但可生存2-3周，冰箱中可生存3-4個(gè)月，在自然環(huán)境的糞便中可存活1-2個(gè)月

17、。沙門氏菌最適繁殖溫度為37，在20以上即能大量繁殖，因此，低溫儲(chǔ)存食品是一項(xiàng)重要預(yù)防措施。沙門氏菌SalmonellaGB4789.4-2016 預(yù)增菌預(yù)增菌 無菌操作稱取25g(mL)樣品，置于盛有225mLBPW 的無菌均質(zhì)杯或合適容器內(nèi)，以8000r/min 10000r/min均質(zhì)1 min2 min，或置于盛有225 mLBPW 的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min2min。若樣品為液態(tài)，不需要均質(zhì)，振蕩混勻。如需調(diào)整 pH，用1 mol/mL無菌NaOH或HCl調(diào)pH至6.80.2。無菌操作將樣品轉(zhuǎn)至500mL錐形瓶或其他合適容器內(nèi)(如均質(zhì)杯本身具有無 孔蓋，可不轉(zhuǎn)移樣品)

18、，如使用均質(zhì)袋，可直接進(jìn)行培養(yǎng)，于36 1 培養(yǎng)8h18h。 如為冷凍產(chǎn)品，應(yīng)在45 以下不超過15min，或2 5 不超過18h解凍。 增菌增菌 輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)過的樣品混合物，移取1mL，轉(zhuǎn)種于10mLTTB 內(nèi)，于42 1 培養(yǎng)18h24h。 同時(shí)，另取1mL，轉(zhuǎn)種于10mLSC內(nèi)，于36 1 培養(yǎng)18h24h。 分離分離 分別用直徑3mm的接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個(gè)BS瓊脂平板和一個(gè) XLD瓊脂平板(或 HE 瓊脂平板或沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板)，于361分別培養(yǎng)40h48h(BS瓊脂平板)或18h24h (XLD瓊脂平板、HE瓊脂平板、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板)，觀察各個(gè)平板上生

19、長(zhǎng)的菌落，各個(gè)平板 上的菌落特征見表1。沙門氏菌Salmonella沙門氏菌Salmonella生化鑒定試驗(yàn)沙門氏菌Salmonella血清學(xué)鑒定血清學(xué)鑒定 檢查培養(yǎng)物有無自凝性檢查培養(yǎng)物有無自凝性 一般采用1.2%1.5%瓊脂培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗(yàn)用的抗原。首先排除自凝集反應(yīng)，在潔凈的 玻片上滴加一滴生理鹽水，將待試培養(yǎng)物混合于生理鹽水滴內(nèi)，使成為均一性的混濁懸液，將玻片輕輕 搖動(dòng)30s60s，在黑色背景下觀察反應(yīng)(必要時(shí)用放大鏡觀察)，若出現(xiàn)可見的菌體凝集，即認(rèn)為有自凝性，反之無自凝性。對(duì)無自凝的培養(yǎng)物參照下面方法進(jìn)行血清學(xué)鑒定。 多價(jià)菌體抗原多價(jià)菌體抗原(O)鑒定鑒定 在玻片上劃出2個(gè)約

20、1cm2cm 的區(qū)域，挑取1環(huán)待測(cè)菌，各放1/2環(huán)于玻片上的每一區(qū)域上部， 在其中一個(gè)區(qū)域下部加1滴多價(jià)菌體(O)抗血清，在另一區(qū)域下部加入1滴生理鹽水，作為對(duì)照。再用 無菌的接種環(huán)或針分別將兩個(gè)區(qū)域內(nèi)的菌苔研成乳狀液。將玻片傾斜搖動(dòng)混合1min，并對(duì)著黑暗背 景進(jìn)行觀察，任何程度的凝集現(xiàn)象皆為陽性反應(yīng)。O 血清不凝集時(shí)，將菌株接種在瓊脂量較高的(如 2%3%)培養(yǎng)基上再檢查;如果是由于 Vi抗原的存在而阻止了 O 凝集反應(yīng)時(shí)，可挑取菌苔于1mL生 理鹽水中做成濃菌液，于酒精燈火焰上煮沸后再檢查。 多價(jià)鞭毛抗原多價(jià)鞭毛抗原(H)鑒定鑒定 操作同上。H 抗原發(fā)育不良時(shí)，將菌株接種在0.55%0.

21、65%半固體瓊脂平板的中央，待菌落 蔓延生長(zhǎng)時(shí)，在其邊緣部分取菌檢查;或?qū)⒕晖ㄟ^接種裝有0.3%0.4%半固體瓊脂的小玻管1次 2次，自遠(yuǎn)端取菌培養(yǎng)后再檢查.沙門氏菌Salmonella金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)Staphylococcusaureus 金黃色葡萄球菌是人類的一種重要病原菌，引起許多嚴(yán)重感染。典型的金黃色葡萄球菌為球形，直徑0.8m左右，顯微鏡下排列成葡萄串狀。金黃色葡萄球菌無芽孢、鞭毛，大多數(shù)無莢膜，革蘭氏染色陽性。是一種不利于人體的細(xì)菌。 金黃色葡萄球菌在自然界中無處不在，空氣、水、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中都可找到。因此，食品受其污染的機(jī)會(huì)很多。美國(guó)疾病控制中心報(bào)告，由金黃色葡萄

22、球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌。金黃色葡萄球菌腸毒素是個(gè)世界性衛(wèi)生問題，在美國(guó)由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒占整個(gè)細(xì)菌性食物中毒的33%，加拿大則更多，占45%，中國(guó)每年發(fā)生的此類中毒事件也非常多。 流行病學(xué)一般有如下特點(diǎn)：季節(jié)分布，多見于春夏季；中毒食品種類多，如奶、肉、蛋、魚及其制品。此外，剩飯、油煎蛋、糯米糕及涼粉等引起的中毒事件也有報(bào)道。上呼吸道感染患者鼻腔帶菌率83%，所以人畜化膿性感染部位常成為污染源。 傳播途徑一般來說，金黃色葡萄球菌可通過以下途徑污染食品：食品加工人員、炊事員或銷售人員帶菌，造成食品污染；食品在加工前本身帶菌，或在加工過程中受到了污染，產(chǎn)生了腸毒素

23、，引起食物中毒；熟食制品包裝不嚴(yán)，運(yùn)輸過程受到污染；奶牛患化膿性乳腺炎或禽畜局部化膿時(shí)，對(duì)肉體其他部位的污染。金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)Staphylococcusaureus第一法第一法 金黃色葡萄球菌定性檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌定性檢驗(yàn) 樣品的處理樣品的處理 稱取25g樣品放入盛有225 mL7.5%氯化鈉肉湯無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打 1 min 2min。若樣品為液態(tài)，吸取25mL樣品至盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯的無菌錐形瓶(瓶?jī)?nèi)可預(yù)置適 當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中，振蕩混勻。 增菌增菌 將上述樣品勻液于36 1 培養(yǎng)18h24h。金黃色葡萄球菌在7.5%氯化鈉肉湯中呈混濁 生長(zhǎng)。 分離分離

24、 將增菌后的培養(yǎng)物，分別劃線接種到 Baird-Parker平板和血平板，血平板361培養(yǎng)18h 24h。Baird-Parker平板36 1 培養(yǎng)24h48h。 初步鑒定初步鑒定 金黃色葡萄球菌在 Baird-Parker平板上呈圓形，表面光滑、凸起、濕潤(rùn)、菌落直徑為2mm3mm， 顏色呈灰黑色至黑色，有光澤，常有淺色(非白色)的邊緣，周圍繞以不透明圈(沉淀)，其外常有一清晰 帶。當(dāng)用接種針觸及菌落時(shí)具有黃油樣黏稠感。有時(shí)可見到不分解脂肪的菌株，除沒有不透明圈和清 晰帶外，其他外觀基本相同。從長(zhǎng)期貯存的冷凍或脫水食品中分離的菌落，其黑色常較典型菌落淺些， 且外觀可能較粗糙，質(zhì)地較干燥。在血平

25、板上，形成菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤(rùn)、金黃色(有時(shí)為白色)，菌落周圍可見完全透明溶血圈。挑取上述可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗(yàn)。金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)Staphylococcusaureus第一法第一法 金黃色葡萄球菌定性檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌定性檢驗(yàn) 確證鑒定確證鑒定染色鏡檢染色鏡檢 金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，直徑約為 0.5m1m。血漿凝固酶試驗(yàn)血漿凝固酶試驗(yàn) 挑取Baird-Parker平板或血平板上至少5個(gè)可疑菌落(小于5個(gè)全選)，分別接 種到5mLBHI和營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面，36 1 培養(yǎng)18h24h。取新鮮配制兔血漿0.5mL，放入小試管中

26、，再加入BHI培養(yǎng)物0.2 mL0.3 mL，振蕩搖勻，置 36 1 溫箱或水浴箱內(nèi)，每半小時(shí)觀察一次，觀察6h，如呈現(xiàn)凝固(即將試管傾斜或倒置時(shí)，呈現(xiàn) 凝塊)或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽性結(jié)果。同時(shí)以血漿凝固酶試驗(yàn)陽性和陰性葡萄球菌 菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對(duì)照。也可用商品化的試劑，按說明書操作，進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)。 結(jié)果如可疑，挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到5mLBHI，36 1 培養(yǎng)18h48h，重復(fù)試驗(yàn)。金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)Staphylococcusaureus第一法第一法 金黃色葡萄球菌定性檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌定性檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)Staphylococcusaureus第二法第

27、二法 金黃色葡萄球菌平板計(jì)數(shù)法金黃色葡萄球菌平板計(jì)數(shù)法 稀釋稀釋 同菌落總數(shù)同菌落總數(shù) 樣品的接種樣品的接種 根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2個(gè)3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液)，在進(jìn) 行10倍遞增稀釋的同時(shí)，每個(gè)稀釋度分別吸取1mL樣品勻液以0.3mL、0.3mL、0.4mL接種量分別加入三塊 Baird-Parker平板，然后用無菌涂布棒涂布整個(gè)平板，注意不要觸及平板邊緣。使用前，如 Baird-Parker平板表面有水珠，可放在25 50的培養(yǎng)箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。 培養(yǎng)培養(yǎng) 在通常情況下，涂布后，將平板靜置10min，如樣液不易吸收，可將平板放在培養(yǎng)箱36 1

28、培養(yǎng)1h;等樣品勻液吸收后翻轉(zhuǎn)平板，倒置后于36 1 培養(yǎng)24h48h。 典型菌落計(jì)數(shù)和確認(rèn)典型菌落計(jì)數(shù)和確認(rèn) 金黃色葡萄球菌在 Baird-Parker平板上呈圓形，表面光滑、凸起、濕潤(rùn)、菌落直徑為2 mm 3mm，顏色呈灰黑色至黑色，有光澤，常有淺色(非白色)的邊緣，周圍繞以不透明圈(沉淀)，其外常有一 清晰帶。當(dāng)用接種針觸及菌落時(shí)具有黃油樣黏稠感。有時(shí)可見到不分解脂肪的菌株，除沒有不透明圈和清晰帶外，其他外觀基本相同。從長(zhǎng)期貯存的冷凍或脫水食品中分離的菌落，其黑色常較典型菌落淺 些，且外觀可能較粗糙，質(zhì)地較干燥。 選擇有典型的金黃色葡萄球菌菌落的平板，且同一稀釋度3個(gè)平板所有菌落數(shù)合計(jì)在

29、20CFU 200CFU 之間的平板，計(jì)數(shù)典型菌落數(shù) 初步鑒定初步鑒定 同第一法同第一法 確證鑒定確證鑒定 同第一法同第一法金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)Staphylococcusaureus第二法第二法 金黃色葡萄球菌平板計(jì)數(shù)法金黃色葡萄球菌平板計(jì)數(shù)法 計(jì)算計(jì)算若只有一個(gè)稀釋度平板的典型菌落數(shù)在20CFU200CFU 之間，計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落，按式(1)計(jì)算。 若最低稀釋度平板的典型菌落數(shù)小于20CFU，計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落，按式(1)計(jì)算。 若某一稀釋度平板的典型菌落數(shù)大于200CFU，但下一稀釋度平板上沒有典型菌落，計(jì)數(shù)該稀釋 度平板上的典型菌落，按式(1)計(jì)算。 若某一 稀 釋

30、度 板的典型菌落數(shù)大于200CFU，而下一 稀釋度平板上雖有典型菌落但不在20CFU200CFU 范圍內(nèi)，應(yīng)計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落，按式(1)計(jì)算。 若2個(gè)連續(xù)稀釋度的平板典型菌落數(shù)均在20CFU200CFU 之間，按式(2)計(jì)算。式中: T 樣品中金黃色葡萄球菌菌落數(shù); A1第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))典型菌落的總數(shù);B1 第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))鑒定為陽性的菌落數(shù); C1 第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))用于鑒定試驗(yàn)的菌落數(shù); A2 第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))典型菌落的總數(shù);B2 第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))鑒定為陽性的菌落數(shù);C2 第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))用于鑒定試驗(yàn)的菌落數(shù); 1.1計(jì)算系數(shù);d

31、稀釋因子(第一稀釋度)。式中: T 樣品中金黃色葡萄球菌菌落數(shù);A 某一稀釋度典型菌落的總數(shù); B 某一稀釋度鑒定為陽性的菌落數(shù);C 某一稀釋度用于鑒定試驗(yàn)的菌落數(shù); d 稀釋因子。 稀釋度稀釋度1:10（第一稀釋度）（第一稀釋度）1:100（第二稀釋度）（第二稀釋度）鑒定試驗(yàn)的菌鑒定試驗(yàn)的菌落數(shù)落數(shù)鑒定為陽性鑒定為陽性的菌落數(shù)的菌落數(shù)計(jì)算計(jì)算菌落數(shù)（CFU）2，3，517，20，23 （60）54604/51008，9，12 （29）35，37，42 （114）5/53/4（293/5+1144/5）/（1.110）金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)Staphylococcusaureus第三法第三法 金黃

32、色葡萄球菌金黃色葡萄球菌MPNMPN法法 MPN/g(mL)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)StaphylococcusaureusB-PB-P平板平板血平板血平板霉菌和酵母oulds and yeasts)l 霉菌是真菌的一種，其特點(diǎn)是菌絲體較發(fā)達(dá)，無較大的子實(shí)體。同其他真菌一樣，也有細(xì)胞壁，寄生或腐生方式生存。霉菌有的使食品轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸疚镔|(zhì)，有的可能在食品中產(chǎn)生毒素，即霉菌毒素。自從發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素以來，霉菌與霉菌毒素對(duì)食品的污染日益引起重視。對(duì)人體健康造成的危害極大，主要表現(xiàn)為慢性中毒、致癌、致畸、致突變作用。l 霉菌毒素對(duì)人和畜禽主要毒性表現(xiàn)在神經(jīng)和內(nèi)分泌紊亂、免疫抑制、致癌致畸、肝腎損傷、繁殖障礙等。

33、雞天生對(duì)霉菌毒素敏感，飼料中較低的毒素含量就會(huì)造成雞群大量死亡。霉菌毒素對(duì)蛋雞的影響集中表現(xiàn)在:卵巢和輸卵管萎縮，產(chǎn)蛋量下降，產(chǎn)畸形蛋;采食量減少、生產(chǎn)性能下降、飼料報(bào)酬降低;種蛋的孵化率降低。不同霉菌毒素對(duì)蛋雞造成的危害有所區(qū)別。在已經(jīng)知道的霉菌毒素中對(duì)蛋雞影響及毒害作用較大的有麥角毒素、單端孢霉毒素、腐馬毒素、玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素等。霉菌和酵母oulds and yeasts) 稀稀釋釋 同菌落總數(shù) 接種接種 同菌落總數(shù) 培養(yǎng)培養(yǎng) 及時(shí)將20 mL25 mL冷卻至46的馬鈴薯葡萄糖瓊脂或孟加拉紅瓊脂(可放置于46士1恒溫水浴箱中保溫)傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。置水平

34、臺(tái)面待培養(yǎng)基完全凝固。瓊脂凝固后，正置平板，置28士1培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄培養(yǎng)至第5d的結(jié)果。 菌落計(jì)數(shù)菌落計(jì)數(shù) 用肉眼觀察，必要時(shí)可用放大鏡或低倍鏡，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的霉菌和酵母菌落數(shù)。以菌落形成單位(colony-forming units，CFU)表示。選取菌落數(shù)在10 CFU150 CFU的平板，根據(jù)菌落形態(tài)分別計(jì)數(shù)霉菌和酵母。霉菌蔓延生長(zhǎng)覆蓋整個(gè)平板的可記為菌落蔓延。 結(jié)果結(jié)果 同菌落總數(shù)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌Listeria monocytogenes 是一種兼性厭氧細(xì)菌，為李斯特菌癥的病原體。李斯特菌是革蘭氏陽性菌，屬厚壁菌門，取名自約瑟夫李斯特。它主要以食物為傳染媒介，是

35、最致命的食源性病原體之一。 李斯特菌在環(huán)境中無處不在，在絕大多數(shù)食品中都能找到李斯特菌。肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜等都已被證實(shí)是李斯特菌的感染源。李斯特菌中毒嚴(yán)重的可引起血液和腦組織感染，很多國(guó)家都已經(jīng)采取措施來控制食品中的李斯特菌，并制定了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。 特點(diǎn)分布廣：存在于土壤、水域(地表水、污水、廢水)、昆蟲、植物、蔬菜、魚、鳥、野生動(dòng)物、家禽。生存環(huán)境可塑性大：能在2-42下生存(也有報(bào)道0能緩慢生長(zhǎng) )能在冰箱冷藏室內(nèi)較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)繁殖。適應(yīng)范圍大：酸性、堿性條件下都適應(yīng)。帶菌較高的食品有：牛奶和乳制品；肉類(特別是牛肉)；蔬菜；沙拉；海產(chǎn)品；冰淇凌等。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌L

36、isteria monocytogenes 本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的定性檢驗(yàn); 第二法適用于單核細(xì)胞增生李 斯特氏菌含量較高的食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的計(jì)數(shù); 第三法適用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌 含量較低(100CFU/g)而雜菌含量較高的食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的計(jì)數(shù)，特別是牛奶、水以 及含干擾菌落計(jì)數(shù)的顆粒物質(zhì)的食品。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌Listeria monocytogenes 增菌增菌 以無菌操作取樣品25g(mL)加入到含有225mLLB1 增菌液的均質(zhì)袋中，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù) 均質(zhì)1min2min;或放入盛有225mLLB1 增菌液的均質(zhì)杯中，

37、8000r/min10000r/min均質(zhì) 1min2min。于30 1 培養(yǎng)24h2h，移取0.1mL，轉(zhuǎn)種于10mLLB2 增菌液內(nèi)，于30 1 培養(yǎng)24h2h。 分離分離 取 LB2 二次增菌液劃線接種于李斯特氏菌顯色平板和 PALCAM 瓊脂平板，于36 1 培養(yǎng) 24h48h，觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落。典型菌落在 PALCAM 瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落， 周圍有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷;在李斯特氏菌顯色平板上的菌落特征，參照產(chǎn)品說明進(jìn)行 判定。 初篩初篩 自選擇性瓊脂平板 上 分 別 挑 取 3 個(gè) 5 個(gè) 典 型 或 可 疑 菌 落，分 別 接 種 木 糖、鼠 李 糖

38、 發(fā) 酵 管，于 36 1 培養(yǎng)24h2h，同時(shí)在 TSA-YE平板上劃線，于361培養(yǎng)18h24h，然后選擇木糖陰性、鼠李糖陽性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進(jìn)行鑒定。 鑒定鑒定第一法 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌Listeria monocytogenes第一法 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)李斯特顯色平板PALCAM平板單核細(xì)胞增生李斯特氏菌Listeria monocytogenes單核細(xì)胞增生李斯特氏菌Listeria monocytogenes 樣品的稀釋樣品的稀釋 以無菌操作稱取樣品25g(mL),放入盛有225mL 緩沖蛋白胨水或無添加劑的 LB肉湯的無菌 均質(zhì)袋內(nèi)(或

39、均質(zhì)杯)內(nèi),在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1min2min或以8000r/min10000r/min均 質(zhì)1min2min。液體樣品,振蕩混勻,制成110的樣品勻液。 用1mL無菌吸管或微量移液器吸取110樣品勻液1mL,沿管壁緩慢注于盛有9mL緩沖蛋白胨水或無添加劑的LB肉湯的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻,制成1100 的樣品勻液。按以上操作程序,制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次,換用1支1mL無菌吸管或吸頭。 樣品的接種樣品的接種 根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì),選擇2個(gè)3個(gè)適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液

40、), 每個(gè)稀釋度的樣品勻液分別吸取1mL以0.3mL、0.3mL、0.4mL的接種量分別加入3塊李斯特氏菌顯色平板,用無菌 L 棒涂布整個(gè)平板,注意不要觸及平板邊緣。使用前,如瓊脂平板表面有水珠,可放 在25 50 的培養(yǎng)箱里干燥,直到平板表面的水珠消失。 培養(yǎng)培養(yǎng) 在通常情況下,涂布后,將平板靜置10min,如樣液不易吸收,可將平板放在培養(yǎng)箱361培養(yǎng)1h;等樣品勻液吸收后翻轉(zhuǎn)平皿,倒置于培養(yǎng)箱,361培養(yǎng)24h48h。第二法第二法 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法單核細(xì)胞增生李斯特氏菌Listeria monocytogenes 典型菌落計(jì)數(shù)和確認(rèn)典型菌落計(jì)

41、數(shù)和確認(rèn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在李斯特氏菌顯色平板上的菌落特征以產(chǎn)品說明為準(zhǔn)。 選擇有典型單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌落的平板,且同一稀釋度3個(gè)平板所有菌落數(shù)合計(jì)在15CFU150CFU之間的平板,計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)。如果: 鑒定鑒定 從典型菌落中任選5個(gè)菌落(小于5 個(gè)全選),分別按第一法鑒定第二法第二法 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法菌落菌落 30-30030-300大腸大腸 15-15015-150金葡金葡 20-20020-200霉菌霉菌 10-15010-150李斯特李斯特 15-15015-150a) 只有一個(gè)稀釋度的平板菌落數(shù)在15CFU150CFU之間

42、且有典型菌落,計(jì)數(shù)該稀釋度平板 上的典型菌落; b) 所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于15CFU且有典型菌落,應(yīng)計(jì)數(shù)最低稀釋度平板上的典型菌落;c) 某一稀釋度的平板菌落數(shù)大于150CFU 且有典型菌落,但下一稀釋度平板上沒有典型菌落, 應(yīng)計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落; d) 所有稀釋度的平板菌落數(shù)大于150CFU 且有典型菌落,應(yīng)計(jì)數(shù)最高稀釋度平板上的典型 菌落; e) 所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在15CFU150CFU 之間且有典型菌落,其中一部分小于15CFU 或大于150CFU 時(shí),應(yīng)計(jì)數(shù)最接近15CFU 或150CFU 的稀釋度平板上的典型菌落。 以上按式(1)計(jì)算。 f) 2個(gè)連續(xù)稀釋

43、度的平板菌落數(shù)均在15CFU150CFU 之間,按式(2)計(jì)算。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌Listeria monocytogenes單核細(xì)胞增生李斯特氏菌Listeria monocytogenes第三法第三法 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌單核細(xì)胞增生李斯特氏菌MPNMPN計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)法 MPN/g(mL)型溶血性鏈球菌（Streptococcus）溶血性鏈球菌又稱沙培林,對(duì)熱和化學(xué)清毒劑均敏感，常引起扁桃體、咽部、中耳等感染。亦為腎盂腎炎、產(chǎn)褥熱、猩紅熱的病原體。鏈球菌呈球形或橢圓形，直徑0.6-1.0m，呈鏈狀排列，長(zhǎng)短不一，從4-8個(gè)至20-30個(gè)菌細(xì)胞組成不等，鏈的長(zhǎng)短與細(xì)菌的種類及生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)

44、。在液體培養(yǎng)基中易呈長(zhǎng)鏈，固體培養(yǎng)基中溶血性鏈球菌常呈短鏈，由于鏈球菌能產(chǎn)生脫鏈酶，所以正常情況下鏈球菌的鏈不能無限制的延長(zhǎng)。多數(shù)菌株在血清肉湯中培養(yǎng)2-4h易形成透明質(zhì)酸的莢膜，繼續(xù)培養(yǎng)后消失。該菌不形成芽胞，無鞭毛，易被普通的堿性染料著色，革蘭氏陽性，老齡培養(yǎng)或被中性粒細(xì)胞吞噬后，轉(zhuǎn)為革蘭氏陰性。型溶血性鏈球菌（Streptococcus） 根據(jù)鏈球菌在血液培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖后是否溶血及其溶血性質(zhì)分為三類。 -溶血性鏈球菌(-hemolytic streptococcus):菌落周圍有1-2mm寬的草綠色溶血環(huán)，環(huán)內(nèi)紅細(xì)胞未溶解，血紅蛋白變成綠色這類鏈球菌亦稱為草綠色鏈球菌，也稱甲型溶血。此

45、類細(xì)菌致病力不強(qiáng)，多為條件致病菌。在人類呼吸道及腸道中有型溶血鏈球菌正常寄生，但有時(shí)也可引起亞急性心內(nèi)膜炎等癥。 -溶血性鏈球菌(-hemolytic streptococcus):菌落周圍形成一個(gè)2-4mm寬、界限分明、完全透明的無色溶血環(huán)，也稱乙型溶血，因而這類菌亦稱為溶血性鏈球菌，該菌的致病力強(qiáng)，常引起人類和動(dòng)物的多種疾病。具體用途是用于研究和質(zhì)量控制。能夠產(chǎn)生型溶血的化（或A群鏈球（Streptococcus pyogenes）和無乳（或B群）鏈球菌（Streptococcus agalactiae）。 -溶血鏈球菌(-streptococcus):不產(chǎn)生溶血素，菌落周圍無溶血環(huán)，也稱

46、為丙型或不溶血性鏈球菌(Streptococcus non-hemolytics)，該菌無致病性，常存在于乳類和糞便中，偶爾也引起感染。型溶血性鏈球菌（Streptococcus） 樣品處理及增菌樣品處理及增菌 按無菌操作稱取檢樣 25 g（mL），加入盛有 225 mL mTSB 的均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì) 1 min2 min；或加入盛有 225 mL mTSB 的均質(zhì)杯中，以 8000 r/min10000 r/min 均質(zhì) 1 min2 min。若樣品為液態(tài)，振蕩均勻即可。36 1 培養(yǎng) 18 h24 h。 分離分離 將將增菌液劃線接種于哥倫比亞 CNA 血瓊脂平板，36 1 厭氧

47、培養(yǎng) 18 h24 h，觀察菌落形態(tài)。溶血性鏈球菌在哥倫比亞 CNA 血瓊脂平板上的典型菌落形態(tài)為直徑約 2 mm3 mm，灰白色、半透明、光滑、表面突起、圓形、邊緣整齊，并產(chǎn)生 型溶血。 分純培養(yǎng)分純培養(yǎng) 挑取 5 個(gè)（如小于 5 個(gè)則全選）可疑菌落分別接種哥倫比亞血瓊脂平板和 TSB 增菌液， 36 1 培養(yǎng) 18 h24 h。 革蘭氏染色鏡檢革蘭氏染色鏡檢 挑取可疑菌落染色鏡檢。 型溶血性鏈球菌為革蘭氏染色陽性，球形或卵圓形，常排列成短鏈狀。 觸酶試驗(yàn)觸酶試驗(yàn) 挑取可疑菌落于潔凈的載玻片上，滴加適量 3%過氧化氫溶液，立即產(chǎn)生氣泡者為陽性。 型溶血性鏈球菌觸酶為陰性。志賀氏菌(Shige

48、lla)增菌增菌 以無菌操作取檢樣 25 g（mL），加入裝有滅菌 225 mL 志賀氏菌增菌肉湯的均質(zhì)杯，用旋轉(zhuǎn)刀片式均質(zhì)器以 8 000 r/min10000r/min 均質(zhì)；或加入裝有225mL志賀氏菌增菌肉湯的均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器連續(xù)均質(zhì)1 min2 min，液體樣品振蕩混勻即可。于41.5 ，厭氧培養(yǎng)16 h20h。 分離分離 取增菌后的志賀氏增菌液分別劃線接種于XLD瓊脂平板和MAC瓊脂平板或志賀氏菌顯色培養(yǎng)基平板上，于 36 1 培養(yǎng) 20 h24 h，觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)。宋內(nèi)氏志賀氏菌的單個(gè)菌落直徑大于其他志賀氏菌。若出現(xiàn)的菌落不典型或菌落較小不易觀察，則繼續(xù)培養(yǎng)

49、至 48 h 再進(jìn)行觀察。志賀氏菌在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征見表 1。志賀氏菌(Shigella)初步生化試驗(yàn)初步生化試驗(yàn) 自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個(gè)以上典型或可疑菌落，分別接種TSI、半固體和營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面各一管，置36 1 培養(yǎng)20 h24 h，分別觀察結(jié)果。凡是三糖鐵瓊脂中斜面產(chǎn)堿、底層產(chǎn)酸（發(fā)酵葡萄糖，不發(fā)酵乳糖，蔗糖）、不產(chǎn)氣（福氏志賀氏菌6型可產(chǎn)生少量氣體）、不產(chǎn)硫化氫、半固體管中無動(dòng)力的菌株，挑取其已培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上生長(zhǎng)的菌苔，進(jìn)行生化試驗(yàn)和血清學(xué)分型。生化試驗(yàn)及附加生化試驗(yàn)生化試驗(yàn)及附加生化試驗(yàn) 生化試驗(yàn)生化試驗(yàn) 用已培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上生長(zhǎng)的菌苔，進(jìn)行生化試驗(yàn)，即

50、-半乳糖苷酶、尿素、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶以及水楊苷和七葉苷的分解試驗(yàn)。除宋內(nèi)氏志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌 13 型的鳥氨酸陽性;宋內(nèi)氏菌和痢疾志賀氏菌 1 型，鮑氏志賀氏菌 13 型的-半乳糖苷酶為陽性以外，其余生化試驗(yàn)志賀氏菌屬的培養(yǎng)物均為陰性結(jié)果。另外由于福氏志賀氏菌 6 型的生化特性和痢疾志賀氏菌或鮑氏志賀氏菌相似，必要時(shí)還需加做靛基質(zhì)、甘露醇、棉子糖、甘油試驗(yàn)，也可做革蘭氏染色檢查和氧化酶試驗(yàn)，應(yīng)為氧化酶陰性的革蘭氏陰性桿菌。生化反應(yīng)不符合的菌株，即使能與某種志賀氏菌分型血清發(fā)生凝集，仍不得判定為志賀氏菌屬。志賀氏菌屬生化特性見表 2。志賀氏菌(Shigella)志賀氏菌(Shige

51、lla)附加生化實(shí)驗(yàn)由于某些不活潑的大腸埃希氏菌（anaerogenic E.coli）、A-D（Alkalescens-D isparbiotypes 堿性-異型）菌的部分生化特征與志賀氏菌相似，并能與某種志賀氏菌分型血清發(fā)生凝集；因此前面生化實(shí)驗(yàn)符合志賀氏菌屬生化特性的培養(yǎng)物還需另加葡萄糖胺、西蒙氏檸檬酸鹽、粘液酸鹽試驗(yàn)(36培養(yǎng)24 h48 h)。志賀氏菌屬和不活潑大腸埃希氏菌、A-D 菌的生化特性區(qū)別見表 3。志賀氏菌(Shigella)血清學(xué)鑒定血清學(xué)鑒定抗原的準(zhǔn)備抗原的準(zhǔn)備 志賀氏菌屬?zèng)]有動(dòng)力，所以沒有鞭毛抗原。志賀氏菌屬主要有菌體（O）抗原。菌體 O 抗原又可分為型和群的特異性抗

52、原。一般采用 1.2%1.5%瓊脂培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗(yàn)用的抗原。凝集反應(yīng)凝集反應(yīng) 在玻片上劃出 2 個(gè)約 1cm2cm 的區(qū)域，挑取一環(huán)待測(cè)菌，各放1/2 環(huán)于玻片上的每一區(qū)域上部，在其中一個(gè)區(qū)域下部加 1 滴抗血清，在另一區(qū)域下部加入1滴生理鹽水，作為對(duì)照。再用無菌的接種環(huán)或針分別將兩個(gè)區(qū)域內(nèi)的菌落研成乳狀液。將玻片傾斜搖動(dòng)混合1 min，并對(duì)著黑色背景進(jìn)行觀察，如果抗血清中出現(xiàn)凝結(jié)成塊的顆粒，而且生理鹽水中沒有發(fā)生自凝現(xiàn)象，那么凝集反應(yīng)為陽性。如果生理鹽水中出現(xiàn)凝集，視作為自凝。這時(shí)，應(yīng)挑取同一培養(yǎng)基上的其他菌落繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)。如果待測(cè)菌的生化特征符合志賀氏菌屬生化特征，而其血清學(xué)試驗(yàn)為陰

53、性的話，則按以上注1進(jìn)行試驗(yàn)注1：一些志賀氏菌如果因?yàn)?K 抗原的存在而不出現(xiàn)凝集反應(yīng)時(shí)，可挑取菌苔于 1 mL 生理鹽水做成濃菌液，100 煮沸15 min60 min 去除 K 抗原后再檢查。注 2：D 群志賀氏菌既可能是光滑型菌株也可能是粗糙型菌株，與其他志賀氏菌群抗原不存在交叉反應(yīng)。與腸桿菌科不同，宋內(nèi)氏志賀氏菌粗糙型菌株不一定會(huì)自凝。宋內(nèi)氏志賀氏菌沒有 K 抗原。志賀氏菌(Shigella)志賀氏菌(Shigella)志賀氏菌(Shigella)商業(yè)無菌 商業(yè)無菌指不含危害公共健康的致病菌和毒素;不含任何在產(chǎn)品儲(chǔ)存、運(yùn)輸及銷售期間能繁殖的微生物;在產(chǎn)品有效期內(nèi)保持質(zhì)量穩(wěn)定和良好的商業(yè)

54、價(jià)值。 罐頭食品經(jīng)過適度的殺菌后，不含有致病性微生物，也不含有在通常溫度下能在其中繁殖的非致病性微生物。l罐頭第九大類l乳制品第五大類l蛋制品第十九大類商業(yè)無菌l 罐頭：畜禽肉類罐頭、水產(chǎn)動(dòng)物類罐頭、水果類罐頭、蔬菜類蔬菜類罐頭罐頭、食用菌罐頭、其他罐頭全部檢測(cè)商業(yè)無菌全部檢測(cè)商業(yè)無菌蔬菜類罐頭番茄罐頭霉菌檢測(cè)（4789.15-2016第二法）l 乳制品：液體乳（滅菌乳、調(diào)制乳）、其他乳制品（煉乳、奶油） 調(diào)制乳：限采用滅菌工藝生產(chǎn)的調(diào)制乳檢測(cè) 煉乳：限淡煉乳和調(diào)制淡煉乳檢測(cè) 奶油：限以罐頭工藝或超高溫瞬時(shí)滅菌工藝加工的稀奶油產(chǎn)品檢測(cè)。l 蛋制品：再制蛋、其他類限以罐頭食品加工工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品檢

55、測(cè)GB4789.26-2013 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 商業(yè)無菌檢驗(yàn)商業(yè)無菌 1樣品準(zhǔn)備 2稱重 3保溫 4開啟 5留樣 6感官檢查 7pH測(cè)定 8涂片染色鏡檢 9結(jié)果判定商業(yè)無菌樣品準(zhǔn)備品準(zhǔn)備 去除表面標(biāo)簽，在包裝容器表面用防水的油性記號(hào)筆做好標(biāo)記，并記錄容器、編號(hào)、產(chǎn)品性狀、泄漏情況、是否有小孔或銹蝕、壓痕、膨脹及其他異常情況。稱重稱重 1 kg 及以下的包裝物精確到 1 g，1 kg 以上的包裝物精確到 2 g，10 kg 以上的包裝物精確到 10 g，并記錄。 保溫保溫 每個(gè)批次取 1 個(gè)樣品置 2 5 冰箱保存作為對(duì)照，將其余樣品在 36 1 下保溫 10 d。保溫過程中應(yīng)每天檢查，如有膨

56、脹或泄漏現(xiàn)象，應(yīng)立即剔出，開啟檢查。保溫結(jié)束時(shí)，再次稱重并記錄，比較保溫前后樣品重量有無變化。如有變輕，表明樣品發(fā)生泄漏。將所有包裝物置于室溫直至開啟檢查。開啟開啟 如有膨脹的樣品，則將樣品先置于 2 5 冰箱內(nèi)冷藏?cái)?shù)小時(shí)后開啟。如有膨用冷水和洗滌劑清洗待檢樣品的光滑面。水沖洗后用無菌毛巾擦干。以含 4%碘的乙醇溶液浸泡消毒光滑面 15 min 后用無菌毛巾擦干，在密閉罩內(nèi)點(diǎn)燃至表面殘余的碘乙醇溶液全部燃燒完。膨脹樣品以及采用易燃包裝材料包裝的樣品不能灼燒，以含 4%碘的乙醇溶液浸泡消毒光滑面 30min 后用無菌毛巾擦干。在超凈工作臺(tái)或百級(jí)潔凈實(shí)驗(yàn)室中開啟。帶湯汁的樣品開啟前應(yīng)適當(dāng)振搖。使用

57、無菌開罐器在消毒后的罐頭光滑面開啟一個(gè)適當(dāng)大小的口，開罐時(shí)不得傷及卷邊結(jié)構(gòu)，每一個(gè)罐頭單獨(dú)使用一個(gè)開罐器，不得交叉使用。如樣品為軟包裝，可以使用滅菌剪刀開啟，不得損壞接口處。立即在開口上方嗅聞氣味，并記錄。注：嚴(yán)重膨脹樣品可能會(huì)發(fā)生爆炸，噴出有毒物。可以采取在膨脹樣品上蓋一條滅菌毛巾或者用一個(gè)無菌漏斗倒扣在樣品上等預(yù)防措施來防止這類危險(xiǎn)的發(fā)生。商業(yè)無菌樣品準(zhǔn)備品準(zhǔn)備 去除表面標(biāo)簽，在包裝容器表面用防水的油性記號(hào)筆做好標(biāo)記，并記錄容器、編號(hào)、產(chǎn)品性狀、泄漏情況、是否有小孔或銹蝕、壓痕、膨脹及其他異常情況。稱重稱重 1 kg 及以下的包裝物精確到 1 g，1 kg 以上的包裝物精確到 2 g，10

58、 kg 以上的包裝物精確到 10 g，并記錄。 保溫保溫 每個(gè)批次取 1 個(gè)樣品置 2 5 冰箱保存作為對(duì)照，將其余樣品在 36 1 下保溫 10 d。保溫過程中應(yīng)每天檢查，如有膨脹或泄漏現(xiàn)象，應(yīng)立即剔出，開啟檢查。保溫結(jié)束時(shí)，再次稱重并記錄，比較保溫前后樣品重量有無變化。如有變輕，表明樣品發(fā)生泄漏。將所有包裝物置于室溫直至開啟檢查。開啟開啟 如有膨脹的樣品，則將樣品先置于 2 5 冰箱內(nèi)冷藏?cái)?shù)小時(shí)后開啟。如有膨用冷水和洗滌劑清洗待檢樣品的光滑面。水沖洗后用無菌毛巾擦干。以含 4%碘的乙醇溶液浸泡消毒光滑面 15 min 后用無菌毛巾擦干，在密閉罩內(nèi)點(diǎn)燃至表面殘余的碘乙醇溶液全部燃燒完。膨脹樣

59、品以及采用易燃包裝材料包裝的樣品不能灼燒，以含 4%碘的乙醇溶液浸泡消毒光滑面 30min 后用無菌毛巾擦干。在超凈工作臺(tái)或百級(jí)潔凈實(shí)驗(yàn)室中開啟。帶湯汁的樣品開啟前應(yīng)適當(dāng)振搖。使用無菌開罐器在消毒后的罐頭光滑面開啟一個(gè)適當(dāng)大小的口，開罐時(shí)不得傷及卷邊結(jié)構(gòu)，每一個(gè)罐頭單獨(dú)使用一個(gè)開罐器，不得交叉使用。如樣品為軟包裝，可以使用滅菌剪刀開啟，不得損壞接口處。立即在開口上方嗅聞氣味，并記錄。注：嚴(yán)重膨脹樣品可能會(huì)發(fā)生爆炸，噴出有毒物。可以采取在膨脹樣品上蓋一條滅菌毛巾或者用一個(gè)無菌漏斗倒扣在樣品上等預(yù)防措施來防止這類危險(xiǎn)的發(fā)生。商業(yè)無菌留樣留樣 開啟后，用滅菌吸管或其他適當(dāng)工具以無菌操作取出內(nèi)容物至少

60、 30 mL（g）至滅菌容器內(nèi)，保存2 5 冰箱中，在需要時(shí)可用于進(jìn)一步試驗(yàn)，待該批樣品得出檢驗(yàn)結(jié)論后可棄去。開啟后的樣品可進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋４?，以備日后容器檢查時(shí)使用。感官檢查感官檢查 在光線充足、空氣清潔無異味的檢驗(yàn)室中，將樣品內(nèi)容物傾入白色搪瓷盤內(nèi)，對(duì)產(chǎn)品的組織、形態(tài)、色澤和氣味等進(jìn)行觀察和嗅聞，按壓食品檢查產(chǎn)品性狀，鑒別食品有無腐敗變質(zhì)的跡象，同時(shí)觀察包裝容器內(nèi)部和外部的情況，并記錄。pH測(cè)定 樣品處理 測(cè)定 液態(tài)制品混勻備用，有固相和液相的制品則取混勻的液相部分備用。 對(duì)于稠厚或半稠厚制品以及難以從中分出汁液的制品（如：糖漿、果醬、果凍、油脂等），取一部分樣品在均質(zhì)器或研缽中研磨，如果研磨