哺乳動物DNA的快速分離與PCR擴(kuò)增1111

1、1會計學(xué)哺乳動物哺乳動物DNA的快速分離與的快速分離與PCR擴(kuò)增擴(kuò)增1111一、一、 實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康?、了解真核細(xì)胞中基因組結(jié)構(gòu)與組成的復(fù)雜性；學(xué)會、了解真核細(xì)胞中基因組結(jié)構(gòu)與組成的復(fù)雜性；學(xué)會 并掌握從哺乳動物組織中并掌握從哺乳動物組織中提取基因組總提取基因組總DNA的原理的原理 與技術(shù)，為與技術(shù)，為PCR分析，分析，RFLP分析，基因文庫的構(gòu)分析，基因文庫的構(gòu) 建，基因檢測等研究打下基礎(chǔ)；建，基因檢測等研究打下基礎(chǔ)；模板模板DNADNA在在9494條件下變性形成單鏈；條件下變性形成單鏈； 在在5555條件下根據(jù)目的條件下根據(jù)目的基因兩側(cè)序列設(shè)計的引物分別與其同源序列結(jié)合；基因兩側(cè)序列設(shè)計

2、的引物分別與其同源序列結(jié)合；7272下在耐下在耐熱性熱性DNADNA聚合酶聚合酶Taq Taq 酶催化酶催化下，下， 在種在種dNTPdNTP存在條件下延伸形存在條件下延伸形成雙鏈。完成一次循環(huán)。成雙鏈。完成一次循環(huán)。 接著又以新合成的接著又以新合成的DNADNA為模板進(jìn)行同為模板進(jìn)行同樣反應(yīng)，如次往復(fù)循環(huán)樣反應(yīng)，如次往復(fù)循環(huán)3030次，由于每次循環(huán)目標(biāo)次，由于每次循環(huán)目標(biāo)DNADNA都以都以n n次次冪擴(kuò)增，冪擴(kuò)增，3030次循環(huán)后目的次循環(huán)后目的DNADNA的量增加的量增加10106 67 7倍。成功的倍。成功的PCRPCR反反應(yīng)要求反應(yīng)有很好的特異性和相當(dāng)?shù)臄U(kuò)增效率。應(yīng)要求反應(yīng)有很好的特

3、異性和相當(dāng)?shù)臄U(kuò)增效率。 要達(dá)此目的要達(dá)此目的PCRPCR反應(yīng)要注意以下問題：反應(yīng)要注意以下問題：DNADNA模板模板：反應(yīng)中：反應(yīng)中DNADNA量在量在50 ng50 ng200 ng200 ng左右。且左右。且DNADNA純純 度較高，以增加反應(yīng)特異性。度較高，以增加反應(yīng)特異性。dNTPdNTP: :反應(yīng)體系中達(dá)反應(yīng)體系中達(dá)100M100M200M200M。三、實驗儀器、材料與試劑三、實驗儀器、材料與試劑1 1、實驗儀器與材料、實驗儀器與材料： 臺式高速冷凍離心機(jī)，恒溫水浴，真空泵，臺式高速冷凍離心機(jī)，恒溫水浴，真空泵，PCRPCR儀，臺式儀，臺式冷凍離心機(jī)、滅菌的微量離心管、凝膠電泳系統(tǒng)，

4、凝膠成冷凍離心機(jī)、滅菌的微量離心管、凝膠電泳系統(tǒng)，凝膠成像系統(tǒng)，冰箱、微量移液器、組織勻漿器，制冰機(jī)，一次像系統(tǒng)，冰箱、微量移液器、組織勻漿器，制冰機(jī)，一次性使用塑料手套和乳膠手套，性使用塑料手套和乳膠手套，豬肝組織豬肝組織。2 2、實驗試劑、實驗試劑： 細(xì)胞裂解緩沖液細(xì)胞裂解緩沖液 10 mM Tris-Cl (pH 8.0),1 mM EDTA 10 mM Tris-Cl (pH 8.0),1 mM EDTA (pH 8.0), 1% SDS(pH 8.0), 1% SDS，70% 70% 乙醇，異丙醇，醋酸鉀乙醇，異丙醇，醋酸鉀( (pH=4.8) 60mlpH=4.8) 60ml的的5

5、mol/L KAc, 11.5mL 5mol/L KAc, 11.5mL 冰醋酸，冰醋酸，28.5 ml 28.5 ml H H2 2OO，TE (pH 8.0)TE (pH 8.0)或無菌水，或無菌水，無無DNaseDNase的的RNase ARNase A (10mg/ml)(10mg/ml)，蛋白酶蛋白酶K(20 mg/mL)K(20 mg/mL)； TaKaRa TaqTaKaRa Taq (5U/ (5U/ L)L)，1010PCR Buffer (MgPCR Buffer (Mg2+2+ Plus) Plus)，dNTP Mixture (each 2.5 mM)dNTP Mixt

6、ure (each 2.5 mM)，豬肝基因組，豬肝基因組DNADNA，引物，引物（Forward primer and Reverse primer)Forward primer and Reverse primer)。四、實驗操作步驟四、實驗操作步驟（一）、（一）、豬肝組織豬肝組織DNADNA的抽提的抽提1 1、切下、切下10-20 mg 10-20 mg 組織，在組織，在液氮液氮中碾磨成粉末。中碾磨成粉末。2 2、將粉末轉(zhuǎn)入、將粉末轉(zhuǎn)入1.5 mL 1.5 mL 離心管中，加離心管中，加0.6 mL 0.6 mL 細(xì)胞裂解細(xì)胞裂解 緩沖液緩沖液和和3 3 L L 蛋白酶蛋白酶K K，混勻

7、，置于，混勻，置于55 55 水浴中水浴中3 h 3 h 以上以上, ,但不要超過但不要超過16 h16 h。3 3、消化液降至室溫，然后加入、消化液降至室溫，然后加入 2 2 L L無無DNaseDNase的的RNaseRNase A A，混勻。，混勻。37 37 水浴中放置水浴中放置0.5 h0.5 h。4 4、將樣品降至室溫，加入、將樣品降至室溫，加入 200200L L 醋酸鉀溶液醋酸鉀溶液，劇烈震，劇烈震蕩蕩 20 sec 20 sec 使其充分混合。冰上放置使其充分混合。冰上放置5 min5 min。5 5、12000 g 12000 g 離心離心 5 min 5 min （4 4

8、 ）。）。6 6、將上清液轉(zhuǎn)移到一個新離心管中，加、將上清液轉(zhuǎn)移到一個新離心管中，加0.6 mL 0.6 mL 異丙醇異丙醇。 充分混勻，充分混勻， 12000 g 12000 g 離心離心 5 min 5 min （4 4 ）。）。7 7、去掉上清，加入、去掉上清，加入0.6 mL 0.6 mL 70% 70% 乙醇乙醇。顛倒離心管數(shù)次，。顛倒離心管數(shù)次， 12000 g 12000 g 離心離心 1 min1 min（4 4）。）。8 8、去掉上清，空氣中干燥、去掉上清，空氣中干燥 DNADNA沉淀沉淀 15 min15 min。9 9、將、將DNADNA沉淀沉淀溶解溶解于于 100 10

9、0 L TE L TE 或水中?；蛩?。1010、濃度和純度測定：、濃度和純度測定： ODOD260260/OD/OD280280= 1.8-2.0= 1.8-2.0； 1 OD1 OD260260= 50 = 50 g/ mLg/ mL1、設(shè)計、設(shè)計PCR反應(yīng)程序反應(yīng)程序 9494預(yù)變性預(yù)變性2 min2 min后開始以下循環(huán)后開始以下循環(huán) 94 30 sec94 30 sec 55 30 sec 25 cycles 55 30 sec 25 cycles 72 30 sec 72 30 sec 72 5 min 72 5 min； 4 4 冷卻恒定。冷卻恒定。（二）、（二）、PCR擴(kuò)增基因

10、片斷擴(kuò)增基因片斷2 2、在、在0.5ml0.5ml薄壁管中，依次加入以下各成分：薄壁管中，依次加入以下各成分： ddHddH2 2O:O: 18.0 18.0 L L 10 10buffer: 2.5 buffer: 2.5 L L dNTPs(2.5 dNTPs(2.5 mMmM) ) 1.0 L L Forward primer (10 Forward primer (10 M M) ) : 1.0 : 1.0 L L Reverse primer (10 Reverse primer (10 M M) ) : 1.0 : 1.0 L L Taq DNA Taq DNA 酶酶(5U/(5U

11、/ L L) ) : 0.5 : 0.5 L L Template DNA(20ng/ Template DNA(20ng/ L L): 1.0 ): 1.0 L L 總體積總體積 25 25 L L3 3、混勻后，離心、混勻后，離心2-3 sec2-3 sec，將，將PCRPCR薄壁管放入薄壁管放入PCRPCR儀的儀的 樣品槽中，選擇預(yù)先設(shè)定的程序，按樣品槽中，選擇預(yù)先設(shè)定的程序，按STARTSTART鍵啟動鍵啟動 PCRPCR儀。儀。4 4、采用、采用1.21.2瓊脂糖凝膠電泳分析瓊脂糖凝膠電泳分析PCRPCR產(chǎn)物的量、引產(chǎn)物的量、引 物擴(kuò)增的特異性。物擴(kuò)增的特異性。五、實驗結(jié)果與分析五、實驗結(jié)果與分析 1 1、提取的豬