第二章 蛋白質(zhì)化學

1、胰島素胰島素牛核糖核酸酶牛核糖核酸酶血紅蛋白血紅蛋白一級結構一級結構 (primary structure)二級結構二級結構 (secondary structure)三級結構三級結構 (tertiary structure)四級結構四級結構 (quaternary structure)高級高級結構結構蛋白質(zhì)的一級結構決定高級結構！蛋白質(zhì)的一級結構決定高級結構！一級結構測定的原則：一級結構測定的原則：將大化小，逐段分析，制成兩套肽片段將大化小，逐段分析，制成兩套肽片段，找出重，找出重疊位點，排出肽的前后位置，最后確定蛋白質(zhì)的疊位點，排出肽的前后位置，最后確定蛋白質(zhì)的完整序列完整序列將肽段順序進

2、行疊聯(lián)以確定完整的順序?qū)㈦亩雾樞蜻M行疊聯(lián)以確定完整的順序 將肽段分離并測出順序?qū)㈦亩畏蛛x并測出順序?qū)Ｒ恍粤呀鈱Ｒ恍粤呀饽┒税被釡y定末端氨基酸測定拆開二硫鍵拆開二硫鍵純蛋白質(zhì)純蛋白質(zhì) 拆分非共價鍵：可用拆分非共價鍵：可用8mol/L尿素尿素或或6mol/L鹽酸胍處理鹽酸胍處理 拆分拆分拆分拆分 二硝基氟苯法二硝基氟苯法 (DNFB法法) 丹磺酰氯法丹磺酰氯法 (DNS法法) 丹磺酰丹磺酰-氨氨基酸有很強基酸有很強的熒光性質(zhì)的熒光性質(zhì) 苯異硫氰酸苯異硫氰酸(酯酯)法法 (PITC法、法、PTC法、法、PTH法、法、Edman降解法降解法 ) 由于其連續(xù)反應特性，由于其連續(xù)反應特性，成為蛋白質(zhì)序列

3、分析儀成為蛋白質(zhì)序列分析儀的分析原理！的分析原理！肼解法：多肽與肼在無水條件下加熱，肼解法：多肽與肼在無水條件下加熱，C-端氨基酸即從端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則變成肼化物。肼肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端端氨基酸分離氨基酸分離H2NCHCROHNCHCROORnCCHHNOHn-1N-端氨基酸 C-端氨基酸ORnCCHH2NOHH2NCHCRONHNH2+H+NH2NH2氨基酸酰肼C-端氨基酸CH3S：CH2CH2CHN HCN HCHCOOR+B rC+NB r-CH3S+CH

4、2CH2CHN HCN HCHCOORCNCH3SCN CH2CHN HCN HCHCOORCH2+H2O+CH2CHN HCOCH2OH3N+CHCOR高絲氨酸內(nèi)酯NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1糜蛋白酶糜蛋白酶胃蛋白酶：胃蛋白酶：在在疏水性氨基酸疏水性氨基酸處部分水解，處部分水解，最適反應最適反應pH為為23利用利用兩套或多套肽段的氨基酸順序兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯彼此間的交錯重疊重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序主要化學鍵主要化學鍵：氫鍵氫鍵 肽鏈的主

5、鏈可看成是由被肽鏈的主鏈可看成是由被Ca隔開的許多平面組成隔開的許多平面組成N端C端事實上，一個天然蛋白質(zhì)多態(tài)鏈在一定條件下只有一種或很事實上，一個天然蛋白質(zhì)多態(tài)鏈在一定條件下只有一種或很少幾種構象，而且相當穩(wěn)定少幾種構象，而且相當穩(wěn)定1. a-螺旋螺旋 (a-helix) 2. -折疊折疊 (-pleated sheet) 3. -轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)角 (-turn) 4. 無規(guī)卷曲無規(guī)卷曲 (nonregular coil)（二）二級結構單元的種類（二）二級結構單元的種類1) 絕大多數(shù)天然蛋白質(zhì)都是絕大多數(shù)天然蛋白質(zhì)都是右手螺旋右手螺旋2) 每隔每隔3.6個氨基酸殘基螺旋個氨基酸殘基螺旋上升一圈；每圈

6、間距上升一圈；每圈間距0.54nm，即每個氨基酸殘基沿螺旋，即每個氨基酸殘基沿螺旋中心軸上升中心軸上升0.15nm，旋轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)100a- -螺旋結構的主要特點：螺旋結構的主要特點：1. a-螺旋螺旋(a-helix)3) 每個氨基酸殘基的每個氨基酸殘基的N-H都都與前面第四個殘基的與前面第四個殘基的C=O形形成成氫鍵氫鍵，氫鍵幾乎平行于中，氫鍵幾乎平行于中心軸心軸 4) 螺旋體中所有氨基酸殘基螺旋體中所有氨基酸殘基側(cè)鏈都側(cè)鏈都伸向外側(cè)伸向外側(cè) * R為為Gly時，由于時，由于Ca上有上有2個氫，使個氫，使Ca-C、Ca-N的轉(zhuǎn)動的自由的轉(zhuǎn)動的自由度很大，即剛性很小，所以使螺旋的穩(wěn)定性大大降低。

7、度很大，即剛性很小，所以使螺旋的穩(wěn)定性大大降低。R基大基大(如如Ile)也也不易形成不易形成-螺旋螺旋* -螺旋遇到螺旋遇到Pro就會被就會被中斷中斷或拐彎，因為脯氨酸是亞氨基酸或拐彎，因為脯氨酸是亞氨基酸有剛性的環(huán)狀結構有剛性的環(huán)狀結構, 且無且無H原子來形成氫鍵原子來形成氫鍵 * 帶相同電荷的氨基酸殘基帶相同電荷的氨基酸殘基連續(xù)出現(xiàn)在肽鏈上時，螺旋的連續(xù)出現(xiàn)在肽鏈上時，螺旋的穩(wěn)穩(wěn)定性降低定性降低側(cè)鏈對側(cè)鏈對a-螺旋結構的影響：螺旋結構的影響：* R基較小基較小, 且不帶電荷的氨基酸利于且不帶電荷的氨基酸利于-螺旋的形成螺旋的形成, 如多聚如多聚丙氨酸在丙氨酸在pH7的水溶液中自發(fā)卷曲成的水

8、溶液中自發(fā)卷曲成-螺旋螺旋2. -折疊折疊 (-pleated sheet) -折疊折疊是同一條多肽鏈的不同部分平行排列或兩條是同一條多肽鏈的不同部分平行排列或兩條以上伸展的多肽鏈靠氫鍵聯(lián)結而成的鋸齒狀片狀結構以上伸展的多肽鏈靠氫鍵聯(lián)結而成的鋸齒狀片狀結構 在在 -折疊中，折疊中， -碳原子總是處于折疊的角上，氨基酸的碳原子總是處于折疊的角上，氨基酸的R基團處于折疊的棱角上并與棱角垂直，兩個氨基酸殘基之間基團處于折疊的棱角上并與棱角垂直，兩個氨基酸殘基之間的軸心距為的軸心距為0.35nm . -折疊結構的氫鍵主要是由兩條肽鏈之間形成的；也可以在折疊結構的氫鍵主要是由兩條肽鏈之間形成的；也可以在

9、同一肽鏈的不同部分之間形成。幾乎所有肽鍵都參與鏈內(nèi)氫鍵的同一肽鏈的不同部分之間形成。幾乎所有肽鍵都參與鏈內(nèi)氫鍵的交聯(lián)，氫鍵與鏈的長軸接近垂直交聯(lián)，氫鍵與鏈的長軸接近垂直 -折疊有兩種類型。一種為平行式，即所有肽鏈的折疊有兩種類型。一種為平行式，即所有肽鏈的N-端都在端都在同一邊。另一種為反平行式，即相鄰兩條肽鏈的方向相反。后同一邊。另一種為反平行式，即相鄰兩條肽鏈的方向相反。后者更為穩(wěn)定者更為穩(wěn)定3. -轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)角(-turn) 也稱也稱-回折回折，存在于球狀蛋白中。其特點是肽鏈回折，存在于球狀蛋白中。其特點是肽鏈回折180，使得氨基酸殘基的，使得氨基酸殘基的C=O與第四個殘基的與第四個殘基的N

10、-H形成形成氫鍵。第二個氨基酸通常是氫鍵。第二個氨基酸通常是pro -轉(zhuǎn)角在蛋白質(zhì)分子的轉(zhuǎn)角在蛋白質(zhì)分子的表面，多數(shù)為親水氨基表面，多數(shù)為親水氨基酸組成酸組成4. 無規(guī)則卷曲無規(guī)則卷曲(non-regular coil) 又稱又稱自由卷曲自由卷曲，是指沒有一定規(guī)律的松散肽鏈，是指沒有一定規(guī)律的松散肽鏈結構，但是其結構是明確而穩(wěn)定的，常常構成酶的結構，但是其結構是明確而穩(wěn)定的，常常構成酶的功能部位功能部位無規(guī)卷曲常出現(xiàn)在無規(guī)卷曲常出現(xiàn)在a-螺旋與螺旋與a-螺旋、螺旋、a-螺旋與螺旋與-折折疊、疊、-折疊與折疊與-折疊之間。它是形成蛋白質(zhì)三級折疊之間。它是形成蛋白質(zhì)三級結構所必需的結構所必需的-螺

11、旋螺旋-折疊折疊-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)角自由卷曲自由卷曲(二二) 超二級結構的基本形式超二級結構的基本形式超二級結構又稱基序或模體（超二級結構又稱基序或模體（motif） 四種類型的超二級結構指多肽鏈在二級結構或超二級結構的基礎上形成三級結構指多肽鏈在二級結構或超二級結構的基礎上形成三級結構的局部折疊區(qū)，它是相對獨立的緊密球狀實體，具有局部的功的局部折疊區(qū)，它是相對獨立的緊密球狀實體，具有局部的功能，稱為結構域能，稱為結構域 (domain) 酵母己糖激酶三級結構由-折疊、-螺旋形成的結構域 丙酮酸激酶丙酮酸激酶的一個結構的一個結構域域 免疫球蛋白免疫球蛋白的一個結構的一個結構域域 三級結構三級結構(ter

12、tiary structure)：指的是多肽鏈在：指的是多肽鏈在二級結構、超二級結構和結構域的基礎上，主鏈構二級結構、超二級結構和結構域的基礎上，主鏈構象和側(cè)鏈構象相互作用，進一步盤曲折疊形成象和側(cè)鏈構象相互作用，進一步盤曲折疊形成球狀球狀分子結構分子結構(一一) 三級結構的概念三級結構的概念 球狀蛋白的三級的結構特征球狀蛋白的三級的結構特征含有多種二級結構單元含有多種二級結構單元分子表面往往有一個內(nèi)陷的空隙，常常是蛋白質(zhì)分子表面往往有一個內(nèi)陷的空隙，常常是蛋白質(zhì)的活性中心的活性中心 大多數(shù)非極性側(cè)鏈埋在分子內(nèi)部，形成大多數(shù)非極性側(cè)鏈埋在分子內(nèi)部，形成疏水核疏水核；而；而極性側(cè)鏈在分子表面，形

13、成極性側(cè)鏈在分子表面，形成親水面親水面 蛋白質(zhì)的三級結構具有明顯的折疊層次蛋白質(zhì)的三級結構具有明顯的折疊層次 分子呈現(xiàn)球狀或橢圓狀分子呈現(xiàn)球狀或橢圓狀(二二) 維持三級結構的作用力維持三級結構的作用力二硫鍵二硫鍵 共價鍵共價鍵 疏水鍵疏水鍵非共價鍵（次級鍵）非共價鍵（次級鍵）氫鍵氫鍵 離子鍵離子鍵范德華力范德華力離子鍵離子鍵氫鍵氫鍵范德華力范德華力疏水作用力疏水作用力90kcal/mol3kcal/mol1kcal/mol1kcal/mol0.1kcal/mol這四種鍵能遠小于共價鍵，稱這四種鍵能遠小于共價鍵，稱次級鍵次級鍵次級鍵微弱但卻是維持蛋白質(zhì)高級結構中主要的作次級鍵微弱但卻是維持蛋白質(zhì)

14、高級結構中主要的作用力，原因何在用力，原因何在? ? 四級結構四級結構(quaternary structure)：由兩條或兩條：由兩條或兩條以上具有三級結構的多肽以上具有三級結構的多肽鏈聚合而成、有特定三維鏈聚合而成、有特定三維結構的蛋白質(zhì)構象。每條結構的蛋白質(zhì)構象。每條多肽鏈又稱為多肽鏈又稱為亞基亞基(subunit) 例如，例如，血紅蛋血紅蛋白的四白的四級結構級結構(一一) 四級結構的概念四級結構的概念(二二) 蛋白質(zhì)四級結構的特點蛋白質(zhì)四級結構的特點v有多個亞基有多個亞基v穩(wěn)定性主要靠亞基間的穩(wěn)定性主要靠亞基間的疏水作用疏水作用維持維持v亞基單獨存在時無生物活性或活性很小，亞基單獨存在

15、時無生物活性或活性很小， 只有通過亞基相互聚合成四級結構后，蛋只有通過亞基相互聚合成四級結構后，蛋白質(zhì)才具有完整的生物活性白質(zhì)才具有完整的生物活性 v亞基間具有亞基間具有協(xié)同效應協(xié)同效應和和變構效應變構效應 二級結構二級結構超二級結構超二級結構結構域結構域三級結構三級結構四級結構四級結構 倫琴 倫琴妻子之手結構生物學的發(fā)展始于結構生物學的發(fā)展始于1895年年倫琴對倫琴對X-射線的發(fā)現(xiàn)射線的發(fā)現(xiàn) X-射線是由于原子中射線是由于原子中內(nèi)層電內(nèi)層電子躍遷子躍遷所發(fā)出的輻射所發(fā)出的輻射 研究蛋白質(zhì)構象的方法研究蛋白質(zhì)構象的方法1912年勞厄發(fā)現(xiàn)晶體的年勞厄發(fā)現(xiàn)晶體的晶格恰晶格恰好是好是X-射線波長的變

16、體射線波長的變體，可以，可以作為光柵，能夠產(chǎn)生衍射，為作為光柵，能夠產(chǎn)生衍射，為晶體結構掀起了一個新的紀元晶體結構掀起了一個新的紀元 上世紀五十年代上世紀五十年代Waston 和和Crick 通過研究通過研究 DNA結構，建結構，建立了立了DNA的雙螺旋模型，為結的雙螺旋模型，為結構生物學的發(fā)展拉開了帷幕構生物學的發(fā)展拉開了帷幕 1924年，奧地利物理學家泡里就提出年，奧地利物理學家泡里就提出了某些了某些核可以自旋核可以自旋，這種運動必然產(chǎn)，這種運動必然產(chǎn)生角動量和磁偶極矩生角動量和磁偶極矩 有磁矩的原子核，在靜磁場中由于磁有磁矩的原子核，在靜磁場中由于磁矩和磁場相互作用形成一組分裂的能矩和磁

17、場相互作用形成一組分裂的能級，在合適頻率的射頻作用下，能級級，在合適頻率的射頻作用下，能級間發(fā)生躍遷而出現(xiàn)的共振現(xiàn)象間發(fā)生躍遷而出現(xiàn)的共振現(xiàn)象 1. 一級結構可以提供重要的生物進化信息一級結構可以提供重要的生物進化信息2. 一級結構相似的蛋白質(zhì)具有相似的生物功能一級結構相似的蛋白質(zhì)具有相似的生物功能 3. 一級結構一級結構“關鍵關鍵”部位的改變也會改變其生物活性部位的改變也會改變其生物活性4. 一級結構的改變可引起分子病一級結構的改變可引起分子病生物生物 與人不同的與人不同的AAAA數(shù)目數(shù)目黑猩猩黑猩猩 0恒河猴恒河猴 1兔兔 9袋鼠袋鼠 10牛、豬、羊、狗牛、豬、羊、狗 11馬馬 12雞、火

18、雞雞、火雞 13響尾蛇響尾蛇 14海龜海龜 15金槍魚金槍魚 21角餃角餃 23小蠅小蠅 25蛾蛾 31小麥小麥 35粗早鏈孢霉粗早鏈孢霉 43酵母酵母 44 鐮刀形鐮刀形紅細胞紅細胞正常紅正常紅細胞細胞 -鏈鏈N端氨基酸排列順序端氨基酸排列順序 1 2 3 4 5 6 7 8 Hb-A (正常人正常人) Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys Hb-S (患患 者者) Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lysw是最早認識的一種分子病。流行于非洲，死亡率極高，大是最早認識的一種分子病。流行于非洲，死亡率極高，大部分患者童年時就夭折，活過童年的壽命也

19、不長，它是由部分患者童年時就夭折，活過童年的壽命也不長，它是由于遺傳基因突變導致血紅蛋白分子結構的突變于遺傳基因突變導致血紅蛋白分子結構的突變 由于纈氨酸上的非極性基團與相鄰非極性基團間由于纈氨酸上的非極性基團與相鄰非極性基團間在疏水力作用下相互靠攏，并引發(fā)所在鏈扭曲為束狀，在疏水力作用下相互靠攏，并引發(fā)所在鏈扭曲為束狀，整個蛋白質(zhì)由球狀變?yōu)殓牭缎?，與氧結合功能喪失，整個蛋白質(zhì)由球狀變?yōu)殓牭缎?，與氧結合功能喪失，導致病人窒息甚至死亡，但病人可抗非洲瘧疾導致病人窒息甚至死亡，但病人可抗非洲瘧疾肌紅蛋白肌紅蛋白 Mb血紅蛋白血紅蛋白 Hb蛋白質(zhì)的空間結構與功能蛋白質(zhì)的空間結構與功能肌紅蛋白肌紅蛋白

20、(Mb)和血紅蛋白和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線的氧解離曲線蛋白質(zhì)的特定空間構象與其特殊生理功能密切相關蛋白質(zhì)的特定空間構象與其特殊生理功能密切相關蛋白質(zhì)特定空間構象被破壞，其生物功能也喪失蛋白質(zhì)特定空間構象被破壞，其生物功能也喪失蛋白質(zhì)以無活性形式存在，轉(zhuǎn)變?yōu)樘囟嬒蟊憩F(xiàn)其活性蛋白質(zhì)以無活性形式存在，轉(zhuǎn)變?yōu)樘囟嬒蟊憩F(xiàn)其活性(R)relaxed state(T) tense state 血中氧分子的運送LungMuscle靜脈靜脈動脈環(huán)境氧高時Hb 快速吸收氧分子環(huán)境氧低時Hb 迅速釋放氧分子釋放氧分子后 Hb變回 T state任何一個亞基接受氧分子后，會增進其它亞基吸附氧分子的能力 天然

21、狀態(tài)，天然狀態(tài)，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、 -巰基乙醇巰基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巰基乙醇巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性非折疊狀態(tài)，無活性瘋牛病病牛的海綿樣腦組織瘋牛病瘋牛病可能是由可能是由于于朊蛋白朊蛋白（Pron protein，PrP）的錯誤折疊引起的錯誤折疊引起肽鏈的肽鏈的正確折疊正確折疊或或亞基裝配亞基裝配常常需要由一些蛋白質(zhì)，例如常常需要由一些蛋白質(zhì)，例如熱熱激蛋白激蛋白（Heat shock protein , Hsp）和某些酶的幫助，并且）和某些酶的幫助，并且消耗消耗ATP。但是，這樣的蛋白質(zhì)與酶并不加入到最終的折疊。但是，這樣的蛋白質(zhì)與酶并不加入到最終的折疊產(chǎn)物或裝配

22、復合物中。它們被稱為產(chǎn)物或裝配復合物中。它們被稱為分子伴侶分子伴侶（molecular chaperone） 二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) 由于蛋白質(zhì)分子量很大，在水溶液中形成由于蛋白質(zhì)分子量很大，在水溶液中形成1-100nm的顆的顆粒，因而粒，因而具有膠體溶液的特征具有膠體溶液的特征 (布郎運動、丁道爾現(xiàn)象、不能布郎運動、丁道爾現(xiàn)象、不能透過半透膜透過半透膜)1. 1.蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素 可溶性蛋白質(zhì)分子表面分布著大量極性氨基酸殘基，對水可溶性蛋白質(zhì)分子表面分布著大量極性氨基酸殘基，對水有很高的親和性，通過水合作用在蛋白質(zhì)顆粒表面形成有很高的親和性，通過水合

23、作用在蛋白質(zhì)顆粒表面形成水化層水化層，可防止分子互碰而聚集可防止分子互碰而聚集 蛋白質(zhì)在非等電點狀態(tài)時帶同種電荷，在蛋白質(zhì)在非等電點狀態(tài)時帶同種電荷，在顆粒表面形成顆粒表面形成電電荷層荷層，同性電荷互斥，使分子不能聚集同性電荷互斥，使分子不能聚集+帶正電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負電荷的蛋白質(zhì)帶負電荷的蛋白質(zhì)在等電點的蛋白質(zhì)在等電點的蛋白質(zhì)水化層水化層+帶正電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負電荷的蛋白質(zhì)帶負電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸酸堿堿酸酸堿堿酸酸堿堿脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用 蛋白質(zhì)沉聚蛋白質(zhì)沉聚蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)膠膠體體溶溶液液沉沉淀淀作作用用示示

24、意意圖圖2. 蛋白質(zhì)的沉淀反應蛋白質(zhì)的沉淀反應 如果加入適當?shù)脑噭┦沟鞍踪|(zhì)分子處于等電點狀態(tài)或失去如果加入適當?shù)脑噭┦沟鞍踪|(zhì)分子處于等電點狀態(tài)或失去水化層水化層( (消除相同電荷消除相同電荷，除去水膜除去水膜) )，蛋白質(zhì)膠體溶液就不再穩(wěn)，蛋白質(zhì)膠體溶液就不再穩(wěn)定并將產(chǎn)生沉淀定并將產(chǎn)生沉淀 沉淀方法類別沉淀方法類別: : 高濃度中性鹽高濃度中性鹽( (鹽析鹽析) ) 等電點沉淀等電點沉淀 有機溶劑沉淀有機溶劑沉淀 重金屬鹽類沉淀重金屬鹽類沉淀 生物堿試劑和某些酸類沉淀生物堿試劑和某些酸類沉淀 加熱變性沉淀加熱變性沉淀臨床醫(yī)學上變性因素常被應用來消毒及滅菌臨床醫(yī)學上變性因素常被應用來消毒及滅菌三

25、、蛋白質(zhì)的變性與復性三、蛋白質(zhì)的變性與復性蛋白質(zhì)在某些物理和化學因素作用下，其特蛋白質(zhì)在某些物理和化學因素作用下，其特定的空間構象被破壞，也即定的空間構象被破壞，也即的空間結構的空間結構的空間結構，從而導致其的空間結構，從而導致其和和1. 蛋白質(zhì)變性的概念蛋白質(zhì)變性的概念2. 變性的本質(zhì)變性的本質(zhì) 破壞非共價鍵，不改變蛋白質(zhì)的一級結構破壞非共價鍵，不改變蛋白質(zhì)的一級結構 應用舉例應用舉例臨床醫(yī)學上，變性因素常被應用來消毒及臨床醫(yī)學上，變性因素常被應用來消毒及滅菌滅菌此外此外, , 防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白質(zhì)制劑質(zhì)制劑( (如疫苗等如疫苗等) )的必要條件的必

26、要條件 5. 蛋白質(zhì)的復性蛋白質(zhì)的復性 若蛋白質(zhì)若蛋白質(zhì)變性程度較輕變性程度較輕，去除變性因素后，去除變性因素后，可緩慢地重新可緩慢地重新自發(fā)折疊自發(fā)折疊成原來的構象，恢復或部分恢復其原有的構象和功成原來的構象，恢復或部分恢復其原有的構象和功能，稱為能，稱為復性復性(renaturation)，這種變性也稱為可逆變性，這種變性也稱為可逆變性可逆變性作用可逆變性作用 蛋白質(zhì)復性蛋白質(zhì)復性(尿素、尿素、-巰基乙醇巰基乙醇) ( (去除尿素、去除尿素、-巰基乙醇巰基乙醇) )非折疊狀態(tài)，無活性非折疊狀態(tài)，無活性天然狀態(tài)，天然狀態(tài)，有催化活性有催化活性一般程序：一般程序： 1、從組織細胞中溶解放出蛋白

27、質(zhì)，并保持天然狀態(tài)，常用、從組織細胞中溶解放出蛋白質(zhì)，并保持天然狀態(tài)，常用低溫冰凍、化學試劑及溶菌酶破壁、破膜，再用溶劑提取低溫冰凍、化學試劑及溶菌酶破壁、破膜，再用溶劑提取 2、分離所需要蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)、分離所需要蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì) a 等電點沉淀等電點沉淀 b 鹽析和有機溶劑分級分離鹽析和有機溶劑分級分離 c 離子交換層析離子交換層析 d 凝膠過濾層析凝膠過濾層析 e 親和層析親和層析 3、結晶提純、結晶提純 a 多次結晶，除雜蛋白和變性蛋白多次結晶，除雜蛋白和變性蛋白 b 結晶的最佳條件：略過飽和溶液結晶的最佳條件：略過飽和溶液 各步驟要求條件溫和，并加少量殺菌劑各步驟要求條件溫和，

28、并加少量殺菌劑 防止蛋白質(zhì)變性、蛋白質(zhì)酶作用及微生物污染防止蛋白質(zhì)變性、蛋白質(zhì)酶作用及微生物污染(一一) 利用溶解度不同的分離純化方法利用溶解度不同的分離純化方法 1. 等電點沉淀等電點沉淀 利用各種蛋白質(zhì)在等電點時，溶解度最小利用各種蛋白質(zhì)在等電點時，溶解度最小 這一性質(zhì)，可以通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的這一性質(zhì)，可以通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH值，值， 將不同的蛋白質(zhì)分開將不同的蛋白質(zhì)分開2. 鹽溶和鹽析鹽溶和鹽析 鹽溶鹽溶：低濃度低濃度的中性鹽在蛋白質(zhì)分子表面形成的中性鹽在蛋白質(zhì)分子表面形成 雙電層使蛋白質(zhì)溶解度增加；雙電層使蛋白質(zhì)溶解度增加； 鹽析鹽析：高濃度高濃度的中性鹽破壞蛋白質(zhì)分子表面的的中

29、性鹽破壞蛋白質(zhì)分子表面的 水化層，使蛋白質(zhì)溶解度降低，發(fā)生沉水化層，使蛋白質(zhì)溶解度降低，發(fā)生沉 淀析出淀析出 分子在等電點時，相互吸引，聚合沉淀，加入少量鹽離子后破壞了這種吸引力，使分子分散溶于水中鹽溶鹽溶鹽析鹽析蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)域，都聚集許多水分子，高濃度鹽使得水分子被抽出，暴露出的疏水性區(qū)域相互結合，形成沉淀3. 有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法 a. 有機溶劑有機溶劑(與水相溶與水相溶)爭取蛋白質(zhì)顆粒上的水爭取蛋白質(zhì)顆粒上的水 膜，使之沉淀膜，使之沉淀 b. 有機溶劑：乙醇、丙酮有機溶劑：乙醇、丙酮 c. 低溫操作，邊加入邊攪拌，防止局部過熱，低溫操作，邊加入邊攪拌，防止局部過熱， 引

30、起變性，盡量縮短處理時間引起變性，盡量縮短處理時間(二二) 根據(jù)分子大小不同的分離方法根據(jù)分子大小不同的分離方法 1. 透析和超過濾透析和超過濾 透析：根據(jù)的透析：根據(jù)的蛋白質(zhì)不能通過半透膜蛋白質(zhì)不能通過半透膜的性質(zhì)，而水和的性質(zhì)，而水和 無機鹽等小分子自由通過，此方法只能無機鹽等小分子自由通過，此方法只能將蛋白將蛋白 質(zhì)和小分子物質(zhì)分開，不能將不同蛋白質(zhì)分開質(zhì)和小分子物質(zhì)分開，不能將不同蛋白質(zhì)分開 超過濾：是利用外加壓或離心使水和其他分通過半透超過濾：是利用外加壓或離心使水和其他分通過半透 膜，蛋白質(zhì)留在膜上，膜，蛋白質(zhì)留在膜上，達到濃縮蛋白質(zhì)溶液達到濃縮蛋白質(zhì)溶液 的目的的目的透析與超過濾

31、簡易裝置透析與超過濾簡易裝置透析袋待分離混合物蒸餾水凝膠過濾法凝膠過濾法3. 密度梯度離心密度梯度離心 a. 蛋白質(zhì)顆粒沉降不僅決定蛋白質(zhì)顆粒沉降不僅決定 于它的大小也取決于它的于它的大小也取決于它的 密度密度 b. 顆粒沉降到與自身密度顆粒沉降到與自身密度 相等的介質(zhì)梯度時，即相等的介質(zhì)梯度時，即 停止不前停止不前 c. 在離心力的作用下，各種在離心力的作用下，各種 蛋白質(zhì)在不同密度介質(zhì)蛋白質(zhì)在不同密度介質(zhì) 中形成獨立的區(qū)帶中形成獨立的區(qū)帶蔗糖密度梯度1. 電泳電泳蛋白質(zhì)在高于或低于其蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白

32、質(zhì)在電在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達到分離各種蛋白質(zhì)的技術，稱為場中泳動而達到分離各種蛋白質(zhì)的技術，稱為電泳電泳(elctrophoresis) 根據(jù)支撐物不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等根據(jù)支撐物不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等 (三三) 根據(jù)電荷不同的分離方法根據(jù)電荷不同的分離方法 幾種重要的蛋白質(zhì)電泳幾種重要的蛋白質(zhì)電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳，是分離、鑒定蛋白質(zhì)的常用，是分離、鑒定蛋白質(zhì)的常用 方法方法 等電聚焦電泳等電聚焦電泳，通過蛋白質(zhì)等電點的差異而分離蛋，通過蛋白質(zhì)等電點的差異而分離蛋 白質(zhì)的電泳方法白質(zhì)的電泳方法 雙向凝膠電泳雙向凝膠電

33、泳，是蛋白質(zhì)組學研究的重要技術，是蛋白質(zhì)組學研究的重要技術PAGE電泳結果電泳結果原理原理等電聚焦電泳：等電聚焦電泳：當?shù)鞍踪|(zhì)在其等電點時，凈電荷當?shù)鞍踪|(zhì)在其等電點時，凈電荷為零，在電場中不再移動為零，在電場中不再移動+5.06.07.0穩(wěn)定穩(wěn)定pH梯度梯度5.06.07.0穩(wěn)定穩(wěn)定pH梯度梯度通電通電+離子交換層析法離子交換層析法(四四) 根據(jù)配體特異性的分離根據(jù)配體特異性的分離親和層析親和層析 1. 根據(jù)蛋白質(zhì)分子能與另一種稱為配體的分子特異根據(jù)蛋白質(zhì)分子能與另一種稱為配體的分子特異而非共價結合而非共價結合 2. 如：酶的作用底物、輔酶、調(diào)節(jié)效應物及其結構如：酶的作用底物、輔酶、調(diào)節(jié)效應物

34、及其結構類似物，激素和受體蛋白，抗原和抗體互為配體類似物，激素和受體蛋白，抗原和抗體互為配體 3. 用含有自由配體的溶液洗脫蛋白質(zhì)用含有自由配體的溶液洗脫蛋白質(zhì)親合層析原理及流程示意圖親合層析原理及流程示意圖 (一一) 蛋白質(zhì)純度的鑒定蛋白質(zhì)純度的鑒定 常用常用聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳法法 高純度：電泳得到均一的一條區(qū)帶高純度：電泳得到均一的一條區(qū)帶 低純度：電泳得到幾條區(qū)帶低純度：電泳得到幾條區(qū)帶 綠色熒光蛋白（綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein, GFP）是一類存在于包括）是一類存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔腸動物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白。其內(nèi)源發(fā)光基團

35、在受水母、水螅和珊瑚等腔腸動物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白。其內(nèi)源發(fā)光基團在受到紫外或藍光激發(fā)時，可高效發(fā)射綠光，且無需底物和輔因子。到紫外或藍光激發(fā)時，可高效發(fā)射綠光，且無需底物和輔因子。GFP可作可作為一種為一種“熒光標簽熒光標簽”被用來研究目標蛋白的定位及移動情況被用來研究目標蛋白的定位及移動情況 定點突變的應用：定點突變的應用： 報告基因的突變報告基因的突變蛋白質(zhì)改造蛋白質(zhì)改造諾獎獲得者：錢永健、下村修、約翰森諾獎獲得者：錢永健、下村修、約翰森 整體水平抗體生成技術抗體技術發(fā)展經(jīng)歷三個階段抗體技術發(fā)展經(jīng)歷三個階段 抗體技術抗體技術 抗抗體體X-a-b-c-d-a -b -c -d抗原決定基BAL

36、B/cabbcd傳統(tǒng)抗體 (抗血清) 是所有抗體的混和 脾臟產(chǎn)生各種B細胞免疫前要先把抗原作成乳劑免疫免疫 抗原抗原采血后得到傳統(tǒng)抗血清已建立小鼠骨髓癌細胞株由脾臟收集B細胞抗原通常有多個抗原決定基免疫后的脾臟約在兩月內(nèi)注射五到八次Ag X-d細細胞融合胞融合-a-b-c-dAgXAgXELISAHAT PEG Cell fusionHybridoma cells 融合瘤細胞ddabcdabcd+-X-d-c-b-a+-dNS-1骨髓癌細胞B cell分株培養(yǎng)篩選篩選篩選單單抗抗傳統(tǒng)抗體 (抗血清)試驗專一性對抗原的反應無法分辨完全不同d舊有抗原d新的抗原小分子抗體鼠單抗人源化基因工程改造的抗體基因工程改造的抗體藥物設計新模式藥物設計新模式HIV-蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑的設計的設計 在對HIV-蛋白酶抑制劑的設計中，通過對該蛋白酶三維結構的研究，發(fā)現(xiàn)其具有一個二重旋轉(zhuǎn)軸的對稱性，進行分子對接模擬計算后設計了抑制劑，并最