銅(II)離子對(duì)生物廢水處理系統(tǒng)中微生物的毒性

1、銅（II）離子對(duì)生物廢水處理系統(tǒng)中微生物的毒性摘要銅是一種重要的元素，但是，這種重金屬在相對(duì)較低的濃度下是微生物活性的抑制劑。這項(xiàng)研究的目的是評(píng)估銅（II）對(duì)廢物處理過(guò)程中負(fù)責(zé)去除有機(jī)成分和營(yíng)養(yǎng)物的各種微生物營(yíng)養(yǎng)組的抑制作用。批次生物測(cè)定結(jié)果表明銅（II）對(duì)廢水處理系統(tǒng)中的關(guān)鍵微生物群體造成了嚴(yán)重的抑制。發(fā)現(xiàn)反硝化細(xì)菌對(duì)銅（II）的存在非常敏感。引起50%抑制（IC50）的銅（II）對(duì)脫氮酶代謝活性的濃度為0.95mgL-1。銅對(duì)發(fā)酵細(xì)菌，需氧葡萄糖降解異養(yǎng)菌和硝化細(xì)菌也有抑制作用（IC50值分別為3.5,4.6和26.5mgL-1）。盡管如此，反硝化和硝化細(xì)菌在暴露于高銅水平（分別高達(dá)25和

2、100mgCu（II）L-1）暴露僅幾天后，其代謝活性顯著恢復(fù)（分別用于脫氮和硝化）?；謴?fù)可能是由于可溶性銅的衰減或微生物的適應(yīng)。一，簡(jiǎn)介重金屬對(duì)環(huán)境，公眾健康和經(jīng)濟(jì)的潛在影響一直是近幾十年來(lái)的一個(gè)主要問(wèn)題。銅，鋅，鎳和鎘等重金屬普遍存在于來(lái)自采礦，冶煉，半導(dǎo)體，冶金，電鍍和金屬加工行業(yè)。液體排放物中銅的濃度根據(jù)工業(yè)活動(dòng)而顯著不同。例如，塞爾維亞銅礦'Cerovo”采礦廢水中的銅含量高達(dá)1550mgL-1（Stankovicetal。，2009）。銅在半導(dǎo)體出水中的濃度也很高，通常在5-100mgL-1范圍內(nèi)（Sierra-Alvarez等人，2007）。但是，市政廢水中的銅含量預(yù)計(jì)會(huì)

3、相當(dāng)?shù)?，因?yàn)楣I(yè)廢水將被來(lái)自居民來(lái)源的廢水稀釋。另外，吸附和沉淀反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致生物廢水處理系統(tǒng)中銅的去除。由Crane等人進(jìn)行的研究（2010）報(bào)道了在不同類(lèi)型的二級(jí)生物廢水處理過(guò)程中大量去除銅。在加入高達(dá)40mgCuL-1的臺(tái)架測(cè)定中，分別獲得了99,84和47%的活性污泥，滴濾液和膜生物反應(yīng)器的銅去除率。銅是所有生物體必不可少的元素（Burgess等，1999;Cervantes和GutierrezCorona，1994）;然而，這種重金屬的高濃度抑制細(xì)胞代謝。含銅和銅的化合物被廣泛用作殺菌劑和殺真菌劑。銅的抗菌作用被認(rèn)為是銅離子螯合巰基的能力，從而與細(xì)胞蛋白質(zhì)或酶相互作用（Yeager，19

4、91）。已經(jīng)進(jìn)行了幾項(xiàng)研究來(lái)確定廢水處理過(guò)程中銅的微生物抑制潛力。銅對(duì)好氧異養(yǎng)細(xì)菌以及硫酸鹽還原和其他厭氧降解過(guò)程中微生物的抑制作用已被廣泛研究（Ahring和Westermann,1985;Jalali和Baldwin，2000;Karri2006;Lawrence和MeCwq，1965;Mori等，2000;Mosey和Hughes,1975;Utgikar等，2001）。相比之下，關(guān)于這種金屬對(duì)其他微生物群體在廢水處理中起關(guān)鍵作用的毒性的信息是有限的，例如硝化和反硝化微生物和葡萄糖發(fā)酵細(xì)菌。據(jù)報(bào)道即使對(duì)于同一營(yíng)養(yǎng)組中的微生物抑制其生物活性的銅（II）濃度差別也是很大。例如，在硫酸鹽還原菌

5、的研究中觀察達(dá)到50%的銅（II）的抑制水平其濃度從僅0.84mgL-1至多達(dá)200mgL-1（Jalali和Baldwin，2000;Karri等人，2006;Sani等人，2001;Utgikar等人，2001）。在同樣的方法中，厭氧污泥中產(chǎn)甲烷微生物的銅抑制水平發(fā)生了顯著的變化，其數(shù)值從2.2mgL-1到400mgL-1幾個(gè)數(shù)量級(jí)（Ahring和Westermann，1985;Karri等人，2006;Lawrence和MeCwq,1965;Mori等人，2000;Mosey和Hughes,1975）。報(bào)道的銅在血管內(nèi)水平觀察到的顯著變化很可能是由于在各種實(shí)驗(yàn)中使用的實(shí)驗(yàn)條件的差異（例如

6、，培養(yǎng)基的組成，pH值，溫度，銅配體濃度如硫化物，等），已知會(huì)影響銅的特性和生物利用度。本研究的目的是評(píng)估銅（II）對(duì)廢水生物處理過(guò)程中涉及有機(jī)物和氮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)去除的各種微生物種群的毒性效應(yīng)。為了比較不同微生物種群的抑制水平，所使用的毒性生物測(cè)定被設(shè)計(jì)為最小化實(shí)驗(yàn)變化（即pH值，微量元素溶液，溫度，振蕩條件在所有生物測(cè)定中相同）。2。材料和方法2.1。化學(xué)制品從SpectrumChemicalsandLaboratoryProducts（Gardena，CA，USA）獲得硝酸鉀和乙酸鈉（N99.0%純度）。從SigmaChemicalsCo.（St.Louis,MO,USA）購(gòu)買(mǎi)脫水氯化銅（II

7、）（99.0%ACS級(jí))，硫酸鈉(N99.5%)和硫酸(95-98%ACS級(jí))。碳酸氫銨由MPBiomedicals(Solon,OH,USA)獲得。苯酚(99.0%ACS級(jí))從EMDchemicals(Gibbstown,NJ,USA)獲得。無(wú)水D-葡萄糖購(gòu)自MallinckrodtChemical(Paris,KY,USA)。N2/CO2氣體(80/20,v/v)由美國(guó)空氣公司(美國(guó)亞利桑那州鳳凰城)交付。所有的化學(xué)品都是按收到的使用2.2。污泥來(lái)源厭氧產(chǎn)甲烷顆粒污泥(Eerbeek和Aviko污泥)的兩種類(lèi)型在這項(xiàng)研究中進(jìn)行了評(píng)估。Eerbeek污泥來(lái)自工業(yè)厭氧污泥床(UASB)再處理再

8、循環(huán)廢水(Industriewater,Eerbeek,TheNetherlands),以及來(lái)自UASB反應(yīng)器處理污泥處理廢水(Aviko,Steenderen,荷蘭)的Aviko污泥。將兩種接種物洗滌并篩分以除去細(xì)顆粒，并將其在4°C的氮?dú)庀聝?chǔ)存。Eerbeek和Aviko污泥中揮發(fā)性懸浮固體(VSS)的含量分別為12.9%和11.5%。硝化試驗(yàn)中使用的接種物RandolphParksludgeI是從全面污水處理設(shè)施(RandolphParkWastewaterReclamationFacility,Tucson,AZ,USA)的硝化階段獲得的。污泥中的VSS含量為4.8%。分別使

9、用Aviko顆粒污泥和RandolphParksludgeII在厭氧和好氧條件下獲得葡萄糖降解富集培養(yǎng)物。富集培養(yǎng)物是通過(guò)將培養(yǎng)上清液以葡萄糖消耗以5%(v/v)的速率成功轉(zhuǎn)移至含有新鮮葡萄糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中而形成的。好氧污泥，蘭道夫公園污泥l(xiāng)I(0.13%VSS),從蘭道夫公園廢水回收設(shè)施的曝氣池獲得。所有的污泥樣品在4C的氮?dú)庀聝?chǔ)存。2.3。培養(yǎng)基在三元生物測(cè)定法(BM-1)中提供的基礎(chǔ)礦物介質(zhì)的組成為(mgL-1)：NaHCO3(2000),NaH2PO4H2O(1200)和Na2HPO4(715)。包含(含L-1)：K2HPO4(250)的基礎(chǔ)礦物介質(zhì)在脫氮生物測(cè)定法(BM-2)(NH4

10、)HCO3(417)和NaHCO3(1500)。用于好氧異養(yǎng)生物測(cè)定和發(fā)酵毒性生物測(cè)定(BM-3)的基礎(chǔ)礦物介質(zhì)包含(inmgL-1)：NH4Cl(280);NaHCO3(2000);K2HPO4(250);KH2PO4(2050);CaSO42H2O(10),MgSO47H2O(100)和酵母提取物(50)。所有培養(yǎng)基中添加10mgL-1酵母提取物和1mLL-1微量元素溶液(50),FeCl24H2O(2000),ZnCl2(50),MnCl24H2O(50),(NH4)6Mo7O244H2O(50),AlCl36H2O(200),CuCl22H2O(30),NaSeO35H2O(100),

11、EDTA(1000),刃天青(200),CoCl26H2O和36%的HCl(1mLL-1)。所有培養(yǎng)基根據(jù)需要用HCl或NaOH調(diào)節(jié)至pH7.2。2.4。分批微生物毒性分析在各種毒性生物體中使用的實(shí)驗(yàn)條件總結(jié)在表1中。除非另有說(shuō)明,批量生物測(cè)定使用補(bǔ)充有50ml培養(yǎng)基的玻璃血清燒瓶(165ml)進(jìn)行。使用氯化銅(CuCl22H2O)的濃縮儲(chǔ)備溶液加入所需量的銅(II)。在稀鹽酸(10mM)中制備儲(chǔ)備溶液以確保完全溶解銅。燒瓶缺乏銅也孵化和作為不受限制的控制。在厭氧和缺氧生物測(cè)定中,用丁基橡膠密封墊和鋁制卷曲密封封口，然后用N2:CO2氣體(80：20,v/v)沖洗頂部空間以確保無(wú)氧條件。好氧異

12、養(yǎng)和氮化生物測(cè)定的頂空是大氣,并且每天補(bǔ)充以防止氧的限制。在所有生物測(cè)定中,由于基礎(chǔ)礦物介質(zhì)的高緩沖能力，加入銅原液后的最終pH值約為7.2。硝化作用(mgNH4+-消耗的g-1VSSd-1),反硝化作用(mgNO3一g-1VSSd-1)和葡萄糖降解(mg葡萄糖降解的g-1VSSd-1)的最大活性由銨濃度，硝酸鹽濃度和葡萄糖消耗生物量濃度與時(shí)間(d),作三個(gè)平行重復(fù)測(cè)定的平均值計(jì)算得到。在每種情況下，在無(wú)銅對(duì)照顯示最大特異活性的時(shí)間段內(nèi),確定給定銅濃度下的最大特異活性。觀察到的抑制作用如下所示計(jì)算。與未抑制的對(duì)照相比，引起活性降低20,50和80%的銅(II)的初始濃度分別被稱為IC20,IC

13、50和IC80。這些值通過(guò)在繪制抑制劑濃度的作用所觀察到的抑制作用()的圖中插入來(lái)計(jì)算。除非另有說(shuō)明,否則所報(bào)導(dǎo)的抑制濃度是三個(gè)平行相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值。2.5。分析方法使用Agilent7500a的電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）得到液體樣品中的銅（II）濃度。分析系統(tǒng)的功率為1500W，等離子氣體流量為15Lmin-1,載氣流量為1.2Lmin-1。取樣后立即用薄膜過(guò)濾（0.45pm）,用稀硝酸稀釋。如別處所述（Dubois等，1956）,用比色法測(cè)定糖。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將0.5ml離心樣品轉(zhuǎn)移到試管中，然后加入0.5ml5%（v/v）苯酚和2.5ml濃硫酸。混勻樣品并使其靜置7分鐘。隨后，

14、將管在45°C加熱20分鐘。使溶液冷卻，并通過(guò)在490nm處測(cè)量樣品的顏色強(qiáng)度來(lái)測(cè)定生物測(cè)定中的葡萄糖濃度。先前構(gòu)建了含有范圍從2.9到14.3mgL-1的葡萄糖濃度的校準(zhǔn)曲線。用空白樣品校正。使用Dionex3000系統(tǒng)（Sunnyvale，CA，USA），用DionexIonPacAS18分析柱（4X250mm）和AG18保護(hù)柱（4X40mm），通過(guò)抑制電導(dǎo)離子色譜分析硝酸鹽和亞硝酸鹽。該柱維持在35C。使用的洗脫液為10mMKOH，流速為1.0mLmin-1。注射量為25pL。在測(cè)量之前，將所有樣品離心（10,000rpm）10分鐘或者通過(guò)膜濾器（0.45pm）。使用Orion

15、Thermo組合離子選擇性電極測(cè)定銨。使用PerpHecTROSS玻璃組合電極以O(shè)rionmodel310PerpHecTpH-meter取樣后立即測(cè)定pH。揮發(fā)性懸浮物和其他分析參數(shù)是根據(jù)“水和廢水檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法”（APHA，1998）確定的。3。結(jié)果與討論圖1顯示了在0,1,2.5,5,10,25,35,50,80和100mg銅（II）L-1存在下硝化活性測(cè)定中來(lái)自氨的硝酸鹽形成的時(shí)間進(jìn)程的說(shuō)明性實(shí)例。含有銅（II）的處理中的硝化活性基于不含銅的不受抑制的對(duì)照的活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。圖2A顯示硝化微生物作為初始銅（II）濃度的函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化活性。由對(duì)照最大硝酸鹽形成時(shí)間計(jì)算其硝化活性，約90至180

16、小時(shí)。本研究中其他微生物的生物活性用相同的方法計(jì)算。3.1。葡萄糖發(fā)酵菌銅（II）在極低濃度時(shí)對(duì)污泥中的厭氧葡萄糖發(fā)酵微生物具有抑制作用（表2）。觀察厭氧培養(yǎng)物中銅濃度在0-10mgL-1范圍內(nèi)的葡萄糖利用率的顯著降低（圖3A）。厭氧富集培養(yǎng)和厭氧顆粒污泥（Aviko）對(duì)葡萄糖利用率產(chǎn)生50%抑制的銅（II）濃度分別為1.4和3.5mgL-1。這些結(jié)果表明，發(fā)酵微生物的生長(zhǎng)在某種程度上與其代謝活性相比，更受銅（II）的影響。文獻(xiàn)中銅對(duì)發(fā)酵菌的IC50值差異很大。Lin和Shei（2008）使用蔗糖評(píng)估了銅對(duì)發(fā)酵產(chǎn)氫產(chǎn)生的影響，發(fā)現(xiàn)在本研究中確定的IC50值與相同數(shù)量級(jí)（6.5mgL-1）的相同

17、。兩項(xiàng)研究銅對(duì)蔗糖產(chǎn)生H2的影響中（LiandFang，2007），一項(xiàng)來(lái)自乳品廢水（YuandFang,2001）實(shí)驗(yàn)，IC50值高出一個(gè)數(shù)量級(jí)（分別為65和30mgL-1）。Zheng和Yu（2004）在評(píng)估銅對(duì)乳品廢棄物轉(zhuǎn)化為H2的影響的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，其IC50值（350mgL-1）相當(dāng)高。在厭氧環(huán)境降解有機(jī)物其他微生物如產(chǎn)甲烷菌和硫酸鹽還原菌相比發(fā)酵細(xì)菌似乎更容易受到銅的抑制作用，.IC50的可溶性銅與發(fā)酵細(xì)菌相比在這兩個(gè)微生物群落的結(jié)果往往是發(fā)酵細(xì)菌一個(gè)或多個(gè)數(shù)量級(jí)（Ahring和Westermann，1985;Jalali和Baldwin，2000;Karri等人，2006;Law-

18、rence和MeCwq，1965;Mori等人，2000;Mosey和Hughes,1975;Utgikar等，2001;Utgikar等，2003）。在葡萄糖發(fā)酵毒性測(cè)定中，觀察到可溶性銅（II）水平快速下降。圖4顯示了在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)各種處理中測(cè)定的可溶性銅（II）的濃度。作為一個(gè)例子，Cu（II）L-1在2和50mgCu（II）L-1處理后分別只檢測(cè)到0.60和4.4mgCu（II）L-1。負(fù)責(zé)去除銅的機(jī)制可能是由于沉淀和吸附到污泥（Artolaetal。，1997;Karrietal。，2006）。礦物介質(zhì)中含有Bi-碳酸鹽，磷酸鹽和羥基基團(tuán);因此，由于CuCO3，Cu（OH）2和C

19、u3（PO4）2的溶解度較低的產(chǎn)物分別為2.5X10-10,2.2X10-20和1.4X10-37,會(huì)發(fā)生銅的化學(xué)沉淀Stumm和Morgan,1981）。銅還可以形成高度不溶性的沉淀物（硫酸銅的溶度積為8X10-37,Stumm和Morgan,1981）,這是負(fù)責(zé)厭氧生物反應(yīng)器中（部分）銅解毒的過(guò)程。然而，由于硫酸鹽和硫化物鹽在所有生物測(cè)定中被排除在基礎(chǔ)礦物介質(zhì)之外，所以需要注意CuS的形成，以防止（生物）硫化物沉淀銅?？扇苄糟~濃度也可以通過(guò)將銅吸附到生物質(zhì)上而得到消除（Hu等，2004;White等，1995）,些研究表明銅的抑制作用隨著生物量的增加而降低銅的比例Braam和Kkapwij

20、k,1981;Pamukoglu和Kargi，2007）。吸附和沉淀反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致生物廢水處理系統(tǒng)和水生環(huán)境中銅的大量去除。一篇綜述提到，在活性污泥處理過(guò)程中，銅的去除率為33-98（Lester，1983）。3.2。硝化和脫硝銅（II）被發(fā)現(xiàn)抑制硝化微生物在aero-bic污泥。搖動(dòng)的批次生物測(cè)定顯示隨著銅（II）含量的增加，氨消耗速率和硝酸鹽形成速率顯著降低（圖2A），在添加銅濃度為50mgL-1或更高時(shí)，幾乎完全抑制了硝化作用。IC20，IC50和IC80的值在表2中進(jìn)行了總結(jié)。有趣的是，硝化細(xì)菌快速地適應(yīng)銅（II），在銅暴露140小時(shí)后，最初被銅抑制的代謝活性大大增加（圖1）。銅濃度在50

21、100mgL-1范圍內(nèi)在120140h內(nèi)完全抑制，但隨后其活性急劇上升，達(dá)到接近不受抑制的水平。這種恢復(fù)可歸因于主要的硝化菌對(duì)銅（II）的生理適應(yīng)或微生物群體向更耐銅的II（II）的轉(zhuǎn)換。介質(zhì)中銅濃度的逐漸下降可能是導(dǎo)致微生物適應(yīng)毒性的另一個(gè)原因。文獻(xiàn)研究表明，金屬的毒性與溶液中的自由離子濃度有關(guān)，而與總金屬濃度有關(guān)（Campbell,1995）。與其他毒性生物測(cè)定法類(lèi)似，測(cè)定可溶性銅（I）濃度的顯著降低。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)所有的硝化處理進(jìn)行的可溶性銅（I）的分析證實(shí)，Cu濃度大大降低到只有0.25到0.51mgL-1。值得注意的是，低濃度的銅（II）（b10mgL-1）被發(fā)現(xiàn)對(duì)微生物將氨氧化成硝

22、酸鹽具有適度的刺激作用。文獻(xiàn)中早先報(bào)道了硝化的刺激作用。Barber和Stuckey（2000）觀察到，在生物反應(yīng)器中加入銅（32mgL-1），硝化效率大大提高（提高了68%）。然而，持續(xù)補(bǔ)充銅在四周后就會(huì)停止硝化。從廢水中去除銅后，硝化作用恢復(fù)。銅是硝化所必需的，因?yàn)閰⑴c電子轉(zhuǎn)移鏈的許多酶以及主要的酶氨加合酶都含有銅（Jones，1982;Painter，1970）。銅被發(fā)現(xiàn)是潛在的抑制劑，可以抑制微生物的活性（圖2B）。確定的IC20，IC50和IC80值分別為0.40,0.95和2.50mgCu（II）L-1。然而，與硝化生物測(cè)定法類(lèi)似，在所有處理的培養(yǎng)49-60小時(shí)后恢復(fù)了代謝活動(dòng)含量

23、低于25mgCu（II）L-1的原因可能是由于微生物種群結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致對(duì)銅不敏感的脫氮物種占主導(dǎo)地位。另外，銅（II）的逐漸沉淀可能是對(duì)觀察到的行為的另一種可能的解釋。很少有文獻(xiàn)研究考慮了銅對(duì)反硝化微生物的抑制作用。唯一發(fā)現(xiàn)的研究指出銅濃度高達(dá)26mgL-1時(shí)對(duì)懸浮生長(zhǎng)系統(tǒng)中的反硝化生物量沒(méi)有受到抑制（Kamath等，1991）。銅是脫氮所需的微量元素。參與脫氮的幾種酶，例如一些亞硝酸鹽還原酶和一氧化二氮還原酶是依賴于銅的酶（Stouthamer,1991;Vanniel等，1992）。根據(jù)這些結(jié)果，可以得出這樣的結(jié)論：與硝化劑相比，脫硝劑對(duì)銅（II）的抑制作用更容易受到影響。然而，在這兩種情況下，微生物種群在從廢水中回收氮的生物過(guò)程的恢復(fù)是