基因治療生物化學(xué)

1、1基因治療 基因治療（gene therapy）是向靶細(xì)胞導(dǎo)入外源基因，以糾正或補(bǔ)償基因缺陷，達(dá)到治療遺傳病目的。 人類遺傳疾病5000多種，基本上不可能用常規(guī)方法治療。個(gè)別病例只能對(duì)癥療法，減輕癥狀，不能治愈?；蛑委熆赡苁俏ㄒ坏姆椒ā?1990年美國(guó)重組DNA咨詢委員會(huì)批準(zhǔn)治療腺苷脫氨酶（ADA）臨床治療方案，2個(gè)病例癥狀改善。 1991年復(fù)旦大學(xué)與二軍大學(xué)合作用基因療法治療血友病B，患者癥狀有所改善2一、基因治療的類型 1. 基因調(diào)控治療 從基因水平調(diào)控缺陷基因表達(dá)，改善癥狀 鐮型細(xì)胞貧血癥-用5-氮胞苷抑制甲基化酶，使因甲基化而關(guān)閉的基因重新開放，產(chǎn)生HbF代替HbA 用反義RNA抑制

2、基因表達(dá) 核酶（ribozyme）切割RNA阻斷基因表達(dá) 腫瘤治療，在基因水平抑制腫瘤細(xì)胞基因惡性表達(dá)和引導(dǎo)腫瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)。3基因治療的類型（續(xù)） 2. 基因矯正治療 基因增補(bǔ)正?；?qū)牖颊唧w內(nèi)補(bǔ)償缺陷基因功能基因替換以正?；蛉〈儺惢蚧蛐Ｕw外對(duì)異?；蜻M(jìn)行糾正。4基因治療的類型（續(xù)）按矯正基因的類型分為兩種基因治療： 生殖細(xì)胞基因治療 對(duì)生殖細(xì)胞或早期胚胎細(xì)胞進(jìn)行基因矯正。 體細(xì)胞基因治療 以體細(xì)胞為受體細(xì)胞，不影響下一代 常用細(xì)胞介導(dǎo)法：選擇靶細(xì)胞在體外進(jìn)行基因修飾，再將其輸入體內(nèi)。5基因置換（gene replacement） 定義：定義：將特定目的基因?qū)胩囟?xì)胞將特定目的基因

3、導(dǎo)入特定細(xì)胞，通過定，通過定位重組，導(dǎo)入的位重組，導(dǎo)入的正?；蛘；颍?，以置換置換基因組內(nèi)原有基因組內(nèi)原有的的缺陷基因缺陷基因。 目的：目的：將缺陷基因的異常序列進(jìn)行橋正。將缺陷基因的異常序列進(jìn)行橋正。 對(duì)缺陷基因的缺陷部位進(jìn)行精確的原位修復(fù)，不對(duì)缺陷基因的缺陷部位進(jìn)行精確的原位修復(fù)，不涉及基因組的任何改變。涉及基因組的任何改變。 6定向整合的條件:轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的載體與基因組DNA具有相同的序列。帶有目的基因的載體就能找到同源重組的位點(diǎn)，進(jìn)行部分基因序列的交換?；?因 同 源 重 組 技 術(shù) 又 稱 為 基 因 打 靶 ( g e n e targeting）細(xì)胞內(nèi)基因同源重組的發(fā)生率很低。

4、基因同源重組技術(shù)基因同源重組技術(shù)7基因增補(bǔ)（gene augmentation） 定義定義: : 通過通過導(dǎo)入外源基因?qū)胪庠椿蚴拱屑?xì)胞表達(dá)其本身使靶細(xì)胞表達(dá)其本身 不表達(dá)的基因。不表達(dá)的基因。類型類型: :n有缺陷基因細(xì)胞中導(dǎo)入正?；颍?xì)胞內(nèi)有缺陷基因細(xì)胞中導(dǎo)入正?；?，而細(xì)胞內(nèi)的缺陷基因并未除去，通過導(dǎo)入正?；虻牡娜毕莼虿⑽闯?，通過導(dǎo)入正?；虻谋磉_(dá)產(chǎn)物，補(bǔ)償缺陷基因的功能；表達(dá)產(chǎn)物，補(bǔ)償缺陷基因的功能；n向靶細(xì)胞中導(dǎo)入靶細(xì)胞本來不表達(dá)的基因，向靶細(xì)胞中導(dǎo)入靶細(xì)胞本來不表達(dá)的基因，利用其表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到治療疾病的目的。利用其表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到治療疾病的目的。8基因干預(yù)（gene inte

5、rference） 基因失活 定義： 采用特定的方式抑制某個(gè)基因的表達(dá)，或者通過破壞某個(gè)基因的結(jié)構(gòu)而使之不能表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。9（一）反義RNA（antisense RNA） 1. 反義RNA與基因表達(dá)調(diào)控 利用反義RNA對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控，通常采用的方法有兩種： （1）體外合成反義RNA，直接作用于培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞吸收RNA后，發(fā)揮作用。 （2）構(gòu)建一些能轉(zhuǎn)錄反義RNA的重組質(zhì)粒，將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄出反義RNA而發(fā)揮作用。10反義RNA技轉(zhuǎn)移術(shù) 受體介導(dǎo)的受體介導(dǎo)的RNA轉(zhuǎn)移十分專一，而且效率高；轉(zhuǎn)移十分專一，而且效率高；被轉(zhuǎn)移的被轉(zhuǎn)移的RNA是被保護(hù)的，與周圍

6、環(huán)境之間是被保護(hù)的，與周圍環(huán)境之間存在多聚賴氨酸的保護(hù)層存在多聚賴氨酸的保護(hù)層, 可以抵抗環(huán)境中可以抵抗環(huán)境中的核酸酶的降解作用。的核酸酶的降解作用。 借助前述的受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移方法，可借助前述的受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移方法，可以實(shí)現(xiàn)受體介導(dǎo)的反義以實(shí)現(xiàn)受體介導(dǎo)的反義RNA轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移。11反義RNA的優(yōu)點(diǎn) 受體介導(dǎo)的反義受體介導(dǎo)的反義RNA基因治療有其自身的優(yōu)點(diǎn)，基因治療有其自身的優(yōu)點(diǎn)，而在一定程度上補(bǔ)充了轉(zhuǎn)基因治療的不足。而在一定程度上補(bǔ)充了轉(zhuǎn)基因治療的不足。 （l）安全性高）安全性高 （2）反義）反義RNA設(shè)計(jì)和制備方便設(shè)計(jì)和制備方便 （3）具有劑量調(diào)節(jié)效應(yīng)）具有劑量調(diào)節(jié)效應(yīng) （4）能直接作用于一

7、些）能直接作用于一些RNA病毒病毒12核酶 (ribozyme) 天然核酶多為單一的天然核酶多為單一的RNA分子，具有自我分子，具有自我剪切作用。但核酶也可以由兩個(gè)剪切作用。但核酶也可以由兩個(gè)RNA分子組成。分子組成。 在基因治療時(shí)，利用核酶分子結(jié)合到靶在基因治療時(shí)，利用核酶分子結(jié)合到靶RNA分子中適當(dāng)?shù)牟课?，形成錘頭狀核酶結(jié)構(gòu)，分子中適當(dāng)?shù)牟课?，形成錘頭狀核酶結(jié)構(gòu)，將靶將靶RNA分子切斷，通過破壞靶分子切斷，通過破壞靶RNA分子而達(dá)分子而達(dá)到治療疾病的目的。到治療疾病的目的。 13核酶錘頭狀的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu) 只要兩個(gè)RNA分子通過互補(bǔ)序列相結(jié)合，形成錘頭狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)（3個(gè)螺旋區(qū)），并能組成核

8、酶的核心序列（13個(gè)或11個(gè)保守核苷酸序列），就可在錘頭右上方產(chǎn)生剪切反應(yīng)。目 錄14 1.核酶的設(shè)計(jì) 核酶是通過靶核酶是通過靶RNA分子與核酶分子共同組成酶分子與核酶分子共同組成酶活性結(jié)構(gòu)域，要從靶分子和核酶分子兩個(gè)方面來設(shè)計(jì)活性結(jié)構(gòu)域，要從靶分子和核酶分子兩個(gè)方面來設(shè)計(jì)核酶。核酶。 （1 1）選擇合適的靶部位，該部位具有核酶切割位點(diǎn)，）選擇合適的靶部位，該部位具有核酶切割位點(diǎn)，能與核酶分子結(jié)合并組成酶活性結(jié)構(gòu)域。能與核酶分子結(jié)合并組成酶活性結(jié)構(gòu)域。 （2）核酶的基本組成：用于基因治療的核酶分子由）核酶的基本組成：用于基因治療的核酶分子由三個(gè)部分組成，中間是保守序列（能夠組成酶活性結(jié)三個(gè)部分

9、組成，中間是保守序列（能夠組成酶活性結(jié)構(gòu)域），兩端是引導(dǎo)序列。構(gòu)域），兩端是引導(dǎo)序列。 15干擾RNA 1.RNA干擾現(xiàn)象干擾現(xiàn)象 RNA干擾干擾（RNA interference， RNAi）是一種由雙鏈?zhǔn)且环N由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。在此過程中，與雙鏈誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列的信使有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，從而抑制該基因的表達(dá)。有義）被降解，從而抑制該基因的表達(dá)。有義RNA（sense RNA）或反義）或反義RNA（antisense RNA）均能抑制線蟲基因的表達(dá)，雙）均能抑制線蟲基因的表達(dá)，雙鏈鏈RNA比單鏈比單鏈RNA更為有效。這與

10、傳統(tǒng)上對(duì)反義更為有效。這與傳統(tǒng)上對(duì)反義RNA技術(shù)的解釋正好技術(shù)的解釋正好相反。而且其抑制基因表達(dá)的效率比反義相反。而且其抑制基因表達(dá)的效率比反義RNA至少高至少高2個(gè)數(shù)量級(jí)。個(gè)數(shù)量級(jí)。 16 2.RNA干擾的機(jī)制 RNA干擾過程主要有干擾過程主要有2個(gè)步驟：個(gè)步驟： （1）小干擾性）小干擾性RNA（siRNA）（2）siRNA與細(xì)胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，與細(xì)胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，稱為稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex, RISC)。17研究基因功能的新工具 由于由于 RNA干擾技術(shù)具有高度的序列專一性干擾技

11、術(shù)具有高度的序列專一性和有效的干擾能力，可以使特定基因沉默或功和有效的干擾能力，可以使特定基因沉默或功能喪失，因此可以作為功能基因組學(xué)的一種強(qiáng)能喪失，因此可以作為功能基因組學(xué)的一種強(qiáng)有力的研究工具。有力的研究工具。 RNA干擾技術(shù)能夠在哺乳動(dòng)物中抑制特定干擾技術(shù)能夠在哺乳動(dòng)物中抑制特定基因的表達(dá)，建立多種表型；抑制基因表達(dá)的基因的表達(dá)，建立多種表型；抑制基因表達(dá)的時(shí)間可以控制在發(fā)育的任何階段。時(shí)間可以控制在發(fā)育的任何階段。 181. 體外化學(xué)合成; 2.用質(zhì)粒載體或病毒載體可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地生成。siRNA的產(chǎn)生的產(chǎn)生19 定義：將“自殺”基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，這種基因編碼的酶能使無毒性的藥物前體

12、轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性代謝物，誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生“自殺”效應(yīng)，從而達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的目的。 應(yīng)用：是惡性腫瘤基因治療的主要方法。（四）自殺基因治療(Suicide Gene Therapy)20 （五）基因免疫調(diào)節(jié) 通過將抗癌免疫增強(qiáng)的細(xì)胞因子或通過將抗癌免疫增強(qiáng)的細(xì)胞因子或MHC基因?qū)肽[瘤組織，以增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中的基因?qū)肽[瘤組織，以增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中的抗癌免疫反應(yīng)?？拱┟庖叻磻?yīng)。 21二、基因治療的條件 對(duì)導(dǎo)入的基因及其產(chǎn)物有詳盡了解； 外源基因有效導(dǎo)入受體細(xì)胞、穩(wěn)定整合、適量表達(dá)； 不影響受治細(xì)胞基因組及表達(dá)調(diào)控；導(dǎo)入基因方法安全，載體對(duì)靶細(xì)胞無害； 22三、基因治療的原則 對(duì)象是病情嚴(yán)重、預(yù)后差、

13、別無他法的患者轉(zhuǎn)移的基因被克隆無需高水平表達(dá)和精確定量控制就有治療效果靶細(xì)胞獲取或回輸安全轉(zhuǎn)移基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞微環(huán)境無嚴(yán)格特異性要求23四、基因療法的步驟 目的（治療）基因的選擇 根據(jù)基因治療類型選擇相應(yīng)目的基因（增補(bǔ)、替換、添加） 基因載體的構(gòu)建 使目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)高效、可控、穩(wěn)定地表達(dá) 受體細(xì)胞選擇 易分離獲取，體外增殖存活，大量擴(kuò)增。如成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓造血干細(xì)胞24 基因轉(zhuǎn)移(gene transfer)方法 1.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移 2.非病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移非病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移25 1.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng) 病毒載體病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移效率較高介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移

14、效率較高 據(jù)統(tǒng)計(jì)，有據(jù)統(tǒng)計(jì)，有72%72%的臨床實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和的臨床實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和71%71%的病的病例使用了病毒載體，其中用得最多的是例使用了病毒載體，其中用得最多的是反轉(zhuǎn)反轉(zhuǎn)錄病毒載體。錄病毒載體。26反轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)及生活周期反轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)及生活周期（1 1）反轉(zhuǎn)錄病毒）反轉(zhuǎn)錄病毒 27 （2）腺病毒(adenovirus)載體 通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中。 腺病毒是人類呼吸道感染的病原體，尚未發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生有關(guān)聯(lián)。28常用基因治療載體常用基因治療載體 整合整合致病性致病性感染細(xì)胞感染細(xì)胞克隆容量克隆容量反 轉(zhuǎn)

15、錄 病 毒反 轉(zhuǎn) 錄 病 毒 載體載體隨機(jī)整合，效率隨機(jī)整合，效率高高可能致病可能致病分裂細(xì)胞分裂細(xì)胞7kb7kb腺病毒載體腺病毒載體不整合，可能丟不整合，可能丟失失不致病不致病分裂細(xì)胞、非分裂細(xì)胞、非分裂細(xì)胞分裂細(xì)胞 腺相關(guān)病毒載腺相關(guān)病毒載體體定點(diǎn)整合定點(diǎn)整合( (1919號(hào)染號(hào)染色體特定區(qū)域色體特定區(qū)域) )不致病不致病分裂細(xì)胞、非分裂細(xì)胞、非分裂細(xì)胞分裂細(xì)胞5kb5kb7.5kb7.5kb29 2.非病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng) （1）脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 使用方便、成本低廉。 基本原理: 利用陽離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，可形成包埋外源DNA的脂質(zhì)體，然后與細(xì)胞一起孵育，即可通過

16、細(xì)胞內(nèi)吞作用將外源DNA（即目的基因）轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，并進(jìn)行表達(dá)。 30 （2）受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù) 將將DNA與細(xì)胞或組織親和性的配體偶聯(lián)，與細(xì)胞或組織親和性的配體偶聯(lián)，可使可使DNA具有靶向性。這種偶聯(lián)通常通過多具有靶向性。這種偶聯(lián)通常通過多聚陽離子（如多聚賴氨酸）來實(shí)現(xiàn)。多聚陽聚陽離子（如多聚賴氨酸）來實(shí)現(xiàn)。多聚陽離子與配體共價(jià)連接后，又通過電荷相互作離子與配體共價(jià)連接后，又通過電荷相互作用與帶負(fù)電荷的用與帶負(fù)電荷的DNA結(jié)合，將結(jié)合，將DNA包圍，只包圍，只留下配體暴露于表面。這樣形成的復(fù)合物可留下配體暴露于表面。這樣形成的復(fù)合物可被帶有特異性受體的靶細(xì)胞吞飲，從而將外被帶有特異性受體的靶細(xì)

17、胞吞飲，從而將外源源DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞。導(dǎo)入靶細(xì)胞。31 （3）基因直接注射技術(shù) 不需要進(jìn)行基因工程的繁瑣操作，直接將裸露DNA注入動(dòng)物肌肉或某些器官組織內(nèi)。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：接受注射外源DNA的小鼠能夠按其基因編碼合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，并能維持?jǐn)?shù)月之久。 將促進(jìn)心臟血管生長(zhǎng)的基因直接注入實(shí)驗(yàn)鼠的心臟，可使其心臟壁內(nèi)毛細(xì)血管增加30%40%； 將胰島素基因直接注入鼠骨骼肌細(xì)胞，能分泌糖尿病所缺少的胰島素； 肌內(nèi)注射凝血因子基因，可產(chǎn)生血友病所需的凝血因子 。32 基因直接注射法的優(yōu)點(diǎn)p制備具有調(diào)控部件的質(zhì)粒制備具有調(diào)控部件的質(zhì)粒DNA重組體的技術(shù)較容重組體的技術(shù)較容易；易；p排除病毒載體可能潛在的致癌

18、性或其他副作用；排除病毒載體可能潛在的致癌性或其他副作用；p導(dǎo)入的基因不需整合即可表達(dá)，避免了反轉(zhuǎn)錄病導(dǎo)入的基因不需整合即可表達(dá)，避免了反轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入整合后，一旦發(fā)生副作用不易中止或毒載體導(dǎo)入整合后，一旦發(fā)生副作用不易中止或逆轉(zhuǎn)的缺點(diǎn)；逆轉(zhuǎn)的缺點(diǎn)；p基因直接注射法可反復(fù)使用，而病毒載體則可能基因直接注射法可反復(fù)使用，而病毒載體則可能誘導(dǎo)體內(nèi)免疫應(yīng)答，致使反復(fù)治療效果下降。誘導(dǎo)體內(nèi)免疫應(yīng)答，致使反復(fù)治療效果下降。 33五、基因治療的應(yīng)用 治療惡性腫瘤 治療黑色素瘤-將已導(dǎo)入IL2基因的TIL細(xì)胞回輸給病人，啟動(dòng)自身免疫治療艾滋病-用射線照射已導(dǎo)入HIV 基因的成纖維細(xì)胞，細(xì)胞停止分化，但能產(chǎn)

19、生gp160，將細(xì)胞回輸給病人，能激活免疫系統(tǒng)，殺傷HIV 感染細(xì)胞。 治療家族性高膽固醇血癥（FH） 肝細(xì)胞低密度脂蛋白（LDL）受體基因混亂造成，將LDL基因?qū)氩∪穗x體培養(yǎng)的肝細(xì)胞，然后經(jīng)導(dǎo)管注入門脈循環(huán)，進(jìn)入肝細(xì)胞后表達(dá)相應(yīng)功能蛋白。34基因治療的應(yīng)用（續(xù)） 先天性免疫缺陷綜合癥 病人缺少腺苷脫氨酶基因（ADA）導(dǎo)致T、B淋巴細(xì)胞發(fā)育不完全，功能障礙,免疫缺陷。 將正常ADA 基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)入白細(xì)胞，輸患者體內(nèi)，患者ADA基因表達(dá)達(dá)正常值的25%。 治療B型血友?。?將人凝血因子的cDNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染到患者成纖維細(xì)胞，再植入患者腹腔中。患者凝血因子含量、活性均上升。病情好轉(zhuǎn)，

20、不需輸血35反義RNA技轉(zhuǎn)移術(shù) 受體介導(dǎo)的受體介導(dǎo)的RNA轉(zhuǎn)移十分專一，而且效率高；轉(zhuǎn)移十分專一，而且效率高；被轉(zhuǎn)移的被轉(zhuǎn)移的RNA是被保護(hù)的，與周圍環(huán)境之間是被保護(hù)的，與周圍環(huán)境之間存在多聚賴氨酸的保護(hù)層存在多聚賴氨酸的保護(hù)層, 可以抵抗環(huán)境中可以抵抗環(huán)境中的核酸酶的降解作用。的核酸酶的降解作用。 借助前述的受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移方法，可借助前述的受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移方法，可以實(shí)現(xiàn)受體介導(dǎo)的反義以實(shí)現(xiàn)受體介導(dǎo)的反義RNA轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移。36 2.RNA干擾的機(jī)制 RNA干擾過程主要有干擾過程主要有2個(gè)步驟：個(gè)步驟： （1）小干擾性）小干擾性RNA（siRNA）（2）siRNA與細(xì)胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，與細(xì)胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，稱為稱為RNA誘