siRNA用于腫瘤抑制的生物學(xué)原理PPT學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1siRNA用于腫瘤抑制的生物學(xué)原理用于腫瘤抑制的生物學(xué)原理腫瘤腫瘤良性腫瘤良性腫瘤惡性腫瘤惡性腫瘤 (原發(fā)灶)“轉(zhuǎn)移灶 “癌癥（cancer） 無浸潤和轉(zhuǎn)移能力，對(duì)機(jī)體危害較小 侵襲和擴(kuò)散轉(zhuǎn)移全身擴(kuò)散，嚴(yán)重危害機(jī)體 How to solve it ？第1頁/共19頁常規(guī)治療方法：常規(guī)治療方法：l根治性手術(shù)：晚期腫瘤切除率低，術(shù)后易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、效果不理想l藥物治療：很難只作用于癌基因本身而不影響相對(duì)應(yīng)的未發(fā)生突變的原癌基因及其相關(guān)因子l化學(xué)治療：將藥物經(jīng)血管帶到全身，對(duì)身體所有細(xì)胞都有影響。毒副作用強(qiáng) l放射治療：利用高能電磁輻射線作用于生命體，使生物分子結(jié)構(gòu)改變，達(dá)到破壞癌細(xì)胞目的的一

2、種治療方法，難于根治參考文獻(xiàn)（1）siRNA特異性沉默hTERT mRNA對(duì)人舌癌Tca8113細(xì)胞體內(nèi)外生長(zhǎng)的影響（2）siRNA為基礎(chǔ)的RNAi在腫瘤基因治療中的應(yīng)用進(jìn)展 （3）靶向survivin基因不同位點(diǎn)的siRNA對(duì)PC-3細(xì)胞增殖和凋亡的影響 （4）Nanoparticles Modified With Tumor-targeting scFv Deliver siRNA and miRNA for Cancer Therapy 以以siRNA為基礎(chǔ)的為基礎(chǔ)的RNAi對(duì)惡性腫瘤對(duì)惡性腫瘤研研究進(jìn)展開創(chuàng)了腫瘤基因治療的新天地究進(jìn)展開創(chuàng)了腫瘤基因治療的新天地Two daily int

3、ravenous injections of the combined siRNAs in the GC4-targeted nanoparticles significantly reduced the tumor load in the lung. From：Nature Molecular Therapy , (22 June 2010) 第2頁/共19頁安德魯法爾 克雷格梅洛RNA干擾機(jī)制雙鏈RNA沉默基因 第3頁/共19頁參考文獻(xiàn)：（1）RNA干擾在婦科惡性腫瘤的研究進(jìn)展（2）siRNA表達(dá)載體對(duì)肝素酶基因的沉默作用 siRNA(short interfering RNA) 即小分子

4、干擾即小分子干擾RNAl 是由RNase家族中的Dicer核酸內(nèi)切酶在細(xì)胞中剪切自然存在的dsRNA過程中產(chǎn)生的，它是RNA干涉的關(guān)鍵調(diào)控因子，其為2123nt的雙鏈RNA，該雙鏈的3端有2個(gè)突的堿基，此結(jié)構(gòu)對(duì)基因沉默效應(yīng)十分關(guān)鍵，5端則具有磷酸基。l siRNA具有穩(wěn)定、持久、安全、特異性，作用強(qiáng)大等特點(diǎn)通過制備特定的siRNA導(dǎo)人生物體內(nèi)可以有目的地抑制靶基因的表達(dá)l 現(xiàn)已逐漸應(yīng)用于醫(yī)療、預(yù)防等領(lǐng)域，尤其是siRNA對(duì)惡性腫瘤的作用已成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。且可以針對(duì)多個(gè)基因或基因族的共有序列來抑制多個(gè)基因的表達(dá)!從而能更有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)。第4頁/共19頁siRNA干擾干擾STAT3基因?qū)κ?/p>

5、管癌基因?qū)κ彻馨〦ca-109細(xì)胞生物學(xué)特征研究細(xì)胞生物學(xué)特征研究選自中國腫瘤臨床2009年第36 卷24期siRNA1：CTGCTAAGATTCAGTGAAA；siRNA2：GCGTCCAGTTCACTACTAA；siRNA3：TCAGCACAATCTACGAAGA； Negative（陰性對(duì)照）：TTCTCCGAACGTGTCACGT （1）針對(duì)人STAT3 基因mRNA 序列設(shè)計(jì)合成3 對(duì)編碼小干擾RNA（siRNA）的DNA 模板（2）將其連入質(zhì)粒中，構(gòu)建STAT3-siRNA表達(dá)載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人食管癌Eca-109細(xì)胞（3）利用RT-PCR、Western blot技術(shù)分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)

6、胞中STAT3基因mRNA和蛋白的表達(dá)，MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期和凋亡變化情況第5頁/共19頁siRNA3 實(shí)驗(yàn)組STAT3 mRNA 的表達(dá)較對(duì)照組明顯減少，siRNA1 和siRNA2 實(shí)驗(yàn)組STAT3 mRNA 的表達(dá)與對(duì)照組無明顯差異。結(jié)論：結(jié)論：STAT3-siRNA 抑制抑制STAT3 基因基因mRNA表達(dá)表達(dá)第6頁/共19頁結(jié)論結(jié)論：siRNA3明顯抑制了Eca-109 細(xì)胞中STAT3 基因mRNA 和蛋白的表達(dá)。同時(shí)說明RNAi 序列設(shè)計(jì)時(shí)靶位點(diǎn)的選擇很關(guān)鍵。第7頁/共19頁siRNA3 實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞的增殖能力明顯下降，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為35.68

7、%，與轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組和陰性質(zhì)粒對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（）；而后兩者差異無顯著性第8頁/共19頁siRNA3 實(shí)驗(yàn)組G0/G1期細(xì)胞占79.51%，S 期細(xì)胞占13.85%，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（）；兩個(gè)對(duì)照組間G0/G1期與S 期細(xì)胞分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（），表明STAT3-siRNA 將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。第9頁/共19頁 siRNA3 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率為13.26%，明顯高于陰性質(zhì)粒對(duì)照組與轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（）；兩個(gè)對(duì)照組間凋亡率無顯著性差異（）第10頁/共19頁結(jié)論：結(jié)論：RNA干擾技術(shù)沉默STAT3基因可以有效地抑制STAT3基因的表達(dá)，進(jìn)而抑

8、制人食管癌Eca-109細(xì)胞的增殖，引起細(xì)胞周期G0/G1期阻滯，促進(jìn)其凋亡第11頁/共19頁參考文獻(xiàn)：（1）Genes IX；（2）siRNA抗癌國內(nèi)研究進(jìn)展（3）基因工程及其分子生物學(xué)基礎(chǔ)分子生物學(xué)基礎(chǔ)分冊(cè)(第2版) 靜國忠編著siRNA為基礎(chǔ)的為基礎(chǔ)的RNAi分子機(jī)制分子機(jī)制正義鏈RNA被RISC很快降解，只利用siRNA反義鏈在靶mRNA上尋找與其互補(bǔ)堿基序列并封閉基因表達(dá)，使得待定基因沉默 只有特定長(zhǎng)度的siRNA才能引發(fā)特異性的基因沉默第12頁/共19頁siRNA RISC復(fù)合體抑制腫瘤基因的三種方式復(fù)合體抑制腫瘤基因的三種方式：（轉(zhuǎn)錄水平上的基因沉默）（轉(zhuǎn)錄水平上的基因沉默）（1

9、）攻擊并降解與siRNA同源的mRNA （2）干擾mRNA的翻譯擇選參考文獻(xiàn)：基因工程及其分子生物學(xué)基礎(chǔ)分子生物學(xué)基礎(chǔ)分冊(cè)(第2版) 靜國忠編著siRNA與靶mRNA之間序列的互補(bǔ)程度（3）通過RISC復(fù)合體引導(dǎo)siRNA進(jìn)入細(xì)胞核，在核內(nèi)RISC中的siRNA與基因組中相互補(bǔ)的序列結(jié)合，通過對(duì)基因啟動(dòng)子周圍的染色質(zhì)蛋白的修飾導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄沉默第13頁/共19頁l用于病毒的感染，如利用RNA干涉技術(shù)抑制人后天免疫缺陷病毒（HIV-1）的主要調(diào)控基因如tat，rev，nef和vif等的表達(dá)；l抑制人丙肝病毒及乳頭癌病毒，從而控制這些病毒的復(fù)制；l對(duì)模式生物線蟲17000個(gè)基因進(jìn)行篩選和研究，鑒別出17

10、22個(gè)基因突變所產(chǎn)生的表性改變，為研究特定基因的功能奠定了基礎(chǔ)；l用于治療黑色素瘤、肝癌、白血病、卵巢癌、前列腺癌、人舌癌、食管癌、大腸癌、婦科惡性腫瘤、乳腺癌、胃癌；l運(yùn)用siRNA特異性沉默hTERT mRNA對(duì)人舌癌Tca8113細(xì)胞；l運(yùn)用siRNA表達(dá)載體沉默肝素酶基因的；l抑制SARS復(fù)制和感染、乙肝病毒感染；lsiRNA具有明顯的特異性和抑制腫瘤生長(zhǎng)作用；lsiRNA能夠減少喉癌細(xì)胞(Hep2細(xì)胞)中STAT3基因的表達(dá)并能抑制Hep2細(xì)胞生長(zhǎng)及誘導(dǎo)其凋亡；lsiRNA抑制nm23H1基因表達(dá)可用于治療鼻咽癌；l在將來的多谷氨酸鏈延伸疾病，包括脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)(spinocerebel-laratacias)和亨廷頓氏舞蹈病以及糖尿病的治療中將發(fā)揮越來越重要的作用；重要研究成果：重要研究成果：第14頁/共19頁第15頁/共19頁siRNA技術(shù)作為一項(xiàng)即將應(yīng)用于臨床的新技術(shù)技術(shù)作為一項(xiàng)即將應(yīng)用于臨床的新技術(shù)仍存在許多問題：仍存在許多問題：主要障礙：主要障礙：缺乏有效而安全的靶向傳輸系統(tǒng)缺乏有效而安全的靶向傳輸系統(tǒng)參考文獻(xiàn)：（1）RNAi技術(shù)在腫瘤基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用；（2） siRNA為基礎(chǔ)的RNAi在腫瘤基因治療中的應(yīng)用進(jìn)展 ；（