RACE原理及實驗步驟(精)

1、制備RACE產(chǎn)物鑒定R 陽照鏈的句3-RACE 和決幣cDNA 末基本原理端快速擴 j 增丿原理：在合成 CDNA 的反應中事先加進的 3末端帶 Oligo(dG)的 SMART 引物，由于逆轉(zhuǎn)錄酶以 mRNA 為模板合成 CDNA,在到達mRNA的5末端時碰到真核mRNA特有的“帽子結(jié)構(gòu)”，即甲基化的 G 時會連續(xù)在合成的 CDNA 末端加上幾個(dC),SMART 引物的 Oligo(dG)與合成 cDNA 末端突出的幾個 C 配對后形成 CDNA 的延伸模板，逆轉(zhuǎn)錄酶會自動轉(zhuǎn)換模板，以 SMART 引物作為延伸模板繼續(xù)延伸 CDNA 單鏈直到引物的末端，這樣得到的所有 cDNA單鏈的一端

2、有含 Oligo(dT)的起始引物序列，另一端有已知的SMART 引物序列，合成第二鏈后可以利用通用引物進行擴增。由千右 l 帽羋警.mRNA 才能利用這個反應得到能擴碧的增得到的CDNA 就是全長 CDNAOW保存條件：SMART 技術(shù)bu-hso一、成分及另備物品1ControlHumanPlacentalTotalRNA 和BDSMARTIIAOligonucleotide 在一70oCF 俁右-First-strancDNFirst-strandcDNA合成合成lOglBDSMARTIIAOligonucleotide(12pM)5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACG

3、CGGG-310ply-RACECDSPrimerA(3-CDS;12pM)S-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGTJSOVN-S1(N=A=CSG=orT;V=A:G:orC)10gl亍亍-RACECDSPrimer(5-CDS;12pM)5-(T)25VN-31(N=A;C=G=orT;V=A=G;orC)40|H5XFirst-StrandBuffer250mMTris-HCl(pH8.3)375mMKQ30mMMgC1220pl1mlDithiodireitol二硫蘇糖醇XA-V/kAAAAAAAAAAAAAAAAA/V=DeionizedH2O lOgl12jilR

4、NaseInhibitor(40U.ul)SAL1RTScribeReverseTranscriptase(lOOU.ul)J51 &3-RACEPCR于-&3-RACEPCR400pl10XUnhersalPrimerAMix(UPM)Long(0.4pM):5-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-350plShort(2|1M):5,-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3,NestedUnhersatPrimerA(NUP10pM)5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3ControlReagents5pl2

5、5pl25plControlHumanPlacental(胎盤)TotalRNA(1pigpl)Control勺-RACETFRPrimer(10pM)Control3-RACETFRPrimer(10pM)GeneralReagents70pl2X1mldNTPMix(dATP.dCTP.dGTP.anddTTP.eachat10mM)Tricine-EDTABuffer10mMTricine-KOH(pH8.5)LOmNlEDTA下列試劑需另外準備：由于 SMARTRACEcDNAAmplificationKit 沒有 PCRpolymerase,可以使用以下物品：Advantage2PC

6、RKit(Cat.Nos.639206/639207)Advantage2PolymeraseMix(Cat.Nos.639201/639202)降落PCR引物引物序列引物在基因上的位置巢式八引物設計A.引物序列特異引物(GSPs)應當： 23-28 個核昔酸 GC 含量為 50-70% Tm大于或等于65C,如果Tm7( (rC可獲得最好的結(jié)果(可使用降落PCR)。至少需要兩個特異引物才能進行完整的 BDSMARTRACE：即用于5-RACEPCR 的反義引物和用于 3-RACEPCR 的正義引物。如果只進行或3-RACE 則只需一個特異引物。弓 I 物長度在 23-28 個核昔酸，長于 3

7、0 個核昔酸沒有優(yōu)勢。模版、引物及 RACE 產(chǎn)物下圖所示。B.引物在基因上的位置BDSMARTRACEKit 得到的擴增產(chǎn)物大于 6 5kb對引物加以篩選，ffi5-W3-RACE 產(chǎn)物達到 2kbC.降落PCR明顯增加 BDSMARTRACE 擴增的特異性降落 PCR 的退火溫度符合首次 PCR 循環(huán)的 Tm 高于通用引物的 Tm。退火溫度在隨后降低到與通用引物相配合的程度，引起特異性基因模版的指數(shù)和高效率的擴增 o當引物的 Tm70C 時建議使用降落循環(huán)程序在首次試驗時，不要使用巢式 PCRo 混合的通用引物（探針在鑒定 RACE 產(chǎn)物的 Southernblotting 中使用。此外巢

8、式PCR在使用特異引物進行5-or3-RACE存在高背景或高非特異性擴增時有必要使用。在巢式 PCR 中，使用外側(cè)引物進行一個初步的擴增，如果擴增產(chǎn)物模糊不清，可以使用內(nèi)部引物重新擴增初步產(chǎn)物的一部分。BDSMARTRACE 指南包括了可選的步驟，指明了巢式引物能夠被使用的地方。本試劑盒提供的通用巢式引物A可用于5-and3-RACEo按照上D.蹤卿鸚儻鱉鱷轍舉非有限而必須重疊，其內(nèi)部弓唯一。述指南可以設計巢式特異引物。巢式引物與外側(cè)特異弓物盡可能不重疊，如果因序列中文名稱：巢式引物英文名稱：nestedprimer定義：為巢式聚合酶鏈反應所設計的引物，第二組引物是在第一組引物擴增得到的產(chǎn)物序

9、列范圍內(nèi)設計的。三、總?cè)?、總RNAIPolyA+RNA的制備的制備丿A.總的預B.RNAGRNA推薦使用變性甲醛瓊脂糖電泳檢測 RNA 樣品。哺乳動物的總RNA 展示為兩條 4 5 和 1 9kb 的帶，分別對應 28S 和18S 核糖體 RNA,它們之間的亮度比率約為 l-2:lo 哺乳動物的 PolyA+RNA 會產(chǎn)生 0.5-12kb 的彌散帶，亮度較核糖體RNA 帶弱。 race定義零CDNA末端快速擴增技術(shù)(rapidamplificationofcDNAends,RACE)是一種基于 PCR 從低豐度的轉(zhuǎn)錄本中快速擴增cDNA 的 5和 3末端的有效方法，以其簡單、快速、廉價等優(yōu)勢

10、而受到越來越多的重視。RACE經(jīng)典的 RACE 技術(shù)是 Fohman 等(丄 988)發(fā)明的一項技丕，主要通過 RT-PCR 技術(shù)由已知部分CDNA 由列來得到完整的 CDNA51和 3端，包括單邊 PCR 和錨定 PCRO該技術(shù)提出以來經(jīng)過不 Mf,克服了早期技術(shù)步驟多、L 差的缺點。一項技術(shù)，主要通過 RT-PCR 技術(shù)由已知部分四、3RACE、5RACE 基本原理對傳統(tǒng) RACE 技術(shù)的改進主要是引物設計及 RTPCR 技術(shù)的改進：采用 RNaseH-莫洛尼氏鼠白血病毒( (MMLV) )反轉(zhuǎn)錄酶3或選擇嗜熱 DNA 聚合酶可能在高溫( (60C-70C)有效地逆轉(zhuǎn)錄mRNA,從而消除了

11、5,端由于高CC含量導致的mRNA二級結(jié)構(gòu)對逆轉(zhuǎn)錄的影響；利用鎖定引物( (lockdockingpTimer)合成第一鏈 cDNA,即在 oligo(dT)引物的 3,端引入兩個簡并的核昔酸5*-Oligo(dT)16-30MN-3*,M=A/G/C；N=A/G/C/T,使引物定位在 poly(A)尾的起始點，從而消除了在合成第一條cDNA 鏈時 oligo(dT)與 poly(A)尾的任何部位的結(jié)合所帶來的影響；在5,端加尾時，采用poly(C),而不是poly(A)采用熱啟動 PCR(hotstartPCR)技術(shù)和降落 PCR(touchdownPCR)提高 PCR 反應的特異性。利用m

12、RNA的3末端的poly(A)尾巴作為一竺I物結(jié)合位點，以連有SMART寡核昔酸序列通用接頭引物的Oligo(dT)30MN作為鎖定引物反轉(zhuǎn)錄合成標準第一鏈cDNA.然后用一個基因特異引物GSP1(genespecificprimer,GSP)作為上游引物，用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM(universalprimer,UPM)作為卜游引物，以cDNA第一鏈為模板，進行PCR循環(huán)，把目的基因3末端的DNA片段擴增出來。才-一pMTTTTTarrSlandardiirsl-%tr-andrinthesiu-BDSMARTIIAseqj&nce3RACEPCRusraupWTTTTTsrF

13、irstloundofPC-R6Bne-.pecifics*nthe&i&NexrroundiofPCRkicorporaciorofsuppzwicmPCRiiwBrtedr&pstelanientG：Tflheii3.對于 5*-RACE:按表 m 準備 PCR 反應；在 0.5-mlPCR 管中按順序加入所有成份，輕柔混合。Component15-RACESample2S.TFR*(+Control)3GSP1+2*(+Control)4UPMonly(-Control)5GSP1only(-Control)5-RACE-ReadycDNA2.5pl2602.5pJ25皿25E(expe

14、rimental)UPM(10X)5詛5pj5p.1GSP1(10HM)1M一1Lil一1|1;|GSP2(10川)1pl一一Control5-RACETFR1HlPrimer(10M)H2O一一4詛1jilMasterMix41.5皿41.5pl41.5山41.6W41.5XFinalvolume50訓50pl50皿50W50詡|*如果RNA是非人類的，可以跳過此步+如果特異引物不產(chǎn)生重疊可以跳過此步。五、CDNA 末端的快速擴增(RACE)主要步驟：1、PCR 反應混合液的準備：確?；旌弦后w積足夠所有的 PCR 反應和一次額外的反應。該混合液用于 51-和 31-RACE 反應。對于 50

15、-plPCR 反應，所混合的成份如下：34.5卜1PCR-GradeWater5pJ10XBDAdvantage2PCRBuffer1MdNTPMix(10mM)1M50XBDAdvantage2PolymeraseMix41.5JAITotalvolume2、漩渦混合(不要產(chǎn)生氣泡)，短暫離心。4每管內(nèi)覆蓋 2 滴礦物油，加蓋。Note:.如使用熱蓋循環(huán)儀則不必加礦物油。5.使用下列程序之一啟動循環(huán)儀，（programs1 和 2 用于5 一和 3-RACETFR 和UPMPrimers 的陽性對照） 。依據(jù)所使用的是 polyA+還是總RNA來選擇正確的循環(huán)次數(shù)。5cycles:94DC7

16、2CC5cycles:94BC3070C3072C3secmin*ccneenlssrr20cycles(PolyA+RNA):OR25cycles(TotalRNA):94C30sec68CC30sec72C3min*Iffragments3kbareexpected,add1minforeachadditional1kb.Program2(ifGSPTm=60-70C):*20cycles(PolyA+RNA):OR25cycles(TotalRNA):94C30sec68C30sec72C3min*對于 3-RACE:按表 IV 準備 PCR 反應在 0.5-mlPCR 管中按順序加入所

17、有成份，輕柔混合。TABLEIV:SETTINGUP3-RACEPCRREACTIONSComponent13RACESample23-TFR*(+Control)3GSP1+Control)4UPMonly(-Control)5GSP2only(-Control)3-RACE-ReadycDNA25皿2.5M25pJ2.5皿2.5皿(experimental)UPM(10X)5p.l5pd一詛一GSP1(10pM)AjdGSP2(10nM)1M一1M一1皿Control3-RACETFR1訕Primer(10|iM)H2O一一4討1閨5訓MasterMix415皿415由415皿415415

18、皿Finalvolume50皿50訓50皿50皿50皿*如果RNA是非人類的，可以跳過此步+如果特異引物不產(chǎn)生重疊可以跳過此步。Program1(preferred;useifGSPTm70BC)六、RACE 產(chǎn)物的鑒定RACE 產(chǎn)物的鑒定使用 3 種方法：(A)對比用 GSPs 和 NGSPs 得到的 RACE 產(chǎn)物;(B)Southernblottina：(C)克隆和測序。A 和 B 需要巢式引物。A.對比用 GSPs 和 NGSPs 得到的 RACE 產(chǎn)物：對于5-RACE 反應，將 UPMMix 和 GSP1 得到的初級擴增產(chǎn)物與UPM 和 NGSP1 得到的擴增產(chǎn)物進行對比(對于 3

19、-RACE,將UPM 和 GSP2 與 UPM 和翩瞬飆巢式Southernblotting：Southern印跡雜交是進行基因組DNA特定序列定位的通用方法。一般利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的 DNA 片段，將膠上的 DNA 變性并在原位將單鏈 DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對應結(jié)構(gòu)的標記探針進行雜交，用放射自顯影或酶反應顯色，從而檢測特定 DNA 分子的含量。BSouthernBlotAnalysis當 RACE 產(chǎn)物有多條帶時，用 GSPs 或 NGSPs 制作探針進行Southernblot 可以有把握地確認真正的 RACE 產(chǎn)物

20、帶。 通常 5-RACE比 3-RACE 易出現(xiàn)多條帶。1-瓊脂糖凝膠電泳檢測 RACE 產(chǎn)物。2 照相、轉(zhuǎn)尼龍膜。5. 與瓊脂糖凝膠電泳照片進行對比。6. 一旦得到了目的條帶，使用 NucleoTrapGelExtractionKit 進行膠回收，分離 DNAo3準備探針，探針內(nèi)不能有 GSP1（oGSP2）的序列?？梢詫?NGSP1（orNGSP2）進行末端標記。如果 GSPs 的 51和 3產(chǎn)物有重疊，則可以用 GSP2 做探針鑒定 5-RACE 產(chǎn)物， 用 （5巴 3-RACE 產(chǎn)物。 使用 cDNA進行缺口翻譯或隨機弓 I 物擴増?zhí)结槨?雜交、曝光、顯影。 C.RACE 產(chǎn)物的克隆和

21、測序:1.使用 NucleoTrapGelExtractionKit 進行 RACE 產(chǎn)物的回收和純化，直接克隆到 T/A 類型的 PCR 克隆載體上2.使用 32P-標記的 NGSP 進行菌落雜交或從 GSP 處開始測序，驗證克隆的插入。對于 5-RACE 產(chǎn)物，推薦至少挑取 8-10 單克隆，以便在 5,末端獲得最大量的序列。一旦確認克隆內(nèi)含有最大的特異基因的插入子，就盡可能獲取較多的序列數(shù)據(jù)?？梢缘玫酵暾?ORF 以及h 和 3UTRO注意事項主要步驟:3Forpreparationof5-RACE-ReadycDNA1-3pl1pl1HlRNAsample5-CDSprimerBDSM

22、ARTIIAoligo3.混合并在小型離心機上短暫離心。的ControlHumanPlacentalTotalForpreparationof3-RACE-ReadycDNA1-3 訓 RNAsample*1pl3*-CDSprimerA4. 70C下溫育2min05.迅速在冰上冷卻2min.6.短暫離心使成份聚集管底。廠 7.在每個反應管中再加入下列試劑(已有 5 山體積)2pl5XFirst-StrandBuffer1plDTT(20mM)1pldNTPMix(lOmM)1plBDPowerScriptReverseTranscriptase總體積為 10pl9.短暫離心使成份聚集管底。1

23、0.42C 下溫育丄 5hr。注意：使用水浴或熱循環(huán)儀會由于蒸發(fā)作用而降低反應液的體積，由此降低第一鏈的合成效率。&小心混合管內(nèi)組分。11.使用 Tricine-EDTA 緩沖液來稀釋反應產(chǎn)物：如果以 V200ng 的總 RNA 開始反應，可加入 20 川來稀釋如果以200ng 的總 RNA 開始反應，可加入 100pl 來稀釋如果以 polyA+RNA 開始反應，可加入 250pl 來稀釋12.72C 下加熱管 7mine丄 3所得產(chǎn)品可以在-20。下保存 3 個月。到此已經(jīng)得到了用于 31和 5-RACE 的 cDNA 樣品。這些產(chǎn)物的量足以用于后期的 RACE 反應，如果使用 LDPCR

24、 構(gòu)壷請在此留出足夠的產(chǎn)物用作膜板。注意事項主要步驟：1.為所有的 PCR 反應和 1.個額外的反應準備足夠的主混合液。對于每個50-plPCR 反應，混合下列試劑：34.5plPCR 純度的水5pl10XBDAdvantage2PCRBuffer1uldNTPMix(10mM;inBDSMARTRACE 或BDAdvantage2PCRKit)1pl50XBDAdvantage2PolymeraseMix 總體積為 41.5pl2.旋渦混合（無泡沫產(chǎn)生） 短暫離心。3.按下表進行 PCR 反應的準備，按順序在 0.5-mlPCR 管中加入各種成份，輕柔混合。TABLEII:SETTINGUPTHEPOSITIVECONTROLRACEEXPERIMENTTubeNo.:Description:Component151RACEControl2y-RACEControl3InternalControl(51cDNA)4InternalControl(TcDNA)Control5-RACE-ReadycDNA2.5川2.5川Control3-RA