微生物檢驗常見問題解答

1、微生物檢驗常見問題解答一、方法驗證1.做過驗證的樣品微生物檢驗方法是否都需要按照新的方法進行重新驗證?答：對于微生物限度檢查的產(chǎn)品而言，由于培養(yǎng)時間調(diào)整，應(yīng)重新進行驗證。對于無菌檢查的產(chǎn)品而言，如果方法未作實質(zhì)性調(diào)整，可以不必重新驗證。個別產(chǎn)品在各論中收載了新的無菌檢查方法，對這些品種，應(yīng)對收載方法的適用性進行驗證。2. 以前做過無菌驗證的品種是否需要重新按照新的標準再驗證?答：參見問題1。3. “新增抗生素供試品應(yīng)選擇低吸附的濾器及濾膜” 比如注射用克林霉素磷酸酯屬于抗生素，是否需要重新選取濾膜再驗證?答：目前采用的方法如果經(jīng)驗證表明可行，則可以繼續(xù)使用該方法。4. 微生物方法學(xué)驗證時，培養(yǎng)

2、時間是否跟樣品日常檢驗所培養(yǎng)時間一致?答：應(yīng)該一致。5. 微生物限度驗證時，如果一個方法只有金葡回收率達不到要求，該方法時是否可以用來做細菌霉菌的檢測方法?答：按藥典的規(guī)定，一個計數(shù)方法通過驗證，是指所有試驗菌的回收率均達到要求。如果采用各種方法以及方法的組合仍無法使金葡回收率達標，則可以采用使金葡回收率最高的方法作為計數(shù)方法。6. 薄膜過濾的沖洗量不能超過1000ml，我公司的喹諾酮類產(chǎn)品原來的方法是每張膜沖洗量為1500和2000ml，請問有沒有合適的方法將沖洗量降至1000，各菌的回收率仍能符合規(guī)定?答：有幾種辦法可以降低沖洗劑的用量：1)降低接觸濾膜的供試品的濃度;2)改進沖洗的方式，

3、如少量多次地沖洗、降低蠕動泵的轉(zhuǎn)速等;3)添加中和劑，如高價金屬離子。7. 微生物限度檢查法規(guī)定，技術(shù)方法驗證時，采用上述方法若還存在一株或多株試驗菌的回收率達不到要求，那么選擇回收率最接近要求的方法和試驗條件進行供試品檢驗。請問，上述方法是指僅通過一種方法還是一定要通過幾種方法聯(lián)用的?答：應(yīng)該要把可能采用的所有方法包括方法聯(lián)用都進行驗證。8. 供試品不溶于稀釋劑，同時又有抑菌性，限度檢查時應(yīng)如何消除抑菌性?答：采用低速離心的方式，盡可能把供試品去除干凈，取離心后的上層液，進行薄膜過濾。9. 不溶于水的固體產(chǎn)品，加表面活性劑后，如何操作才能在方法驗證中得到較好的回收率?答：同問題8。10. 有

4、些品種2010年藥典與2005年比較檢驗方法變了，是否需要驗證或確認?答：同問題1。二、菌種管理1. 濃菌液的有效期該如何確定?答：藥典沒有規(guī)定?？梢酝ㄟ^實驗確定有效期。例如，在不同的時間點測定濃菌液的濃度，從而判斷其有效期。2. 藥典要求菌液在制備后2小時內(nèi)使用，若保存在2-8的菌懸液可在在24小時內(nèi)使用，那我們在做驗證或陽性對照是要加一定量的菌就沒有時間進行平板計數(shù)了，該如何確保所加菌量準確?答：藥典對稀釋菌液的使用期限作出規(guī)定，并不會影響操作過程中稀釋菌液的加入。即便不規(guī)定，也無法在準確知道菌液濃度的情況下加入試驗菌。菌液稀釋的實驗操作和加入菌液的實驗操作應(yīng)該是在同一次實驗中完成的，要使

5、加入的菌量符合藥典的規(guī)定，可以從濃菌液的制備方法、菌液稀釋的方法等方面進行規(guī)范，也可以引入濁度比較的方法。3. 菌懸液能否在倒平板之前確定菌含量?答：活菌含量是無法確定的'?？偩靠梢酝ㄟ^比濁的方式確定。4. 具體從哪些方面進行菌種菌株的特性和純度確認?如何操作?答：基層的微生物實驗室進行菌種純度確認可以考慮以下一些方面：1)形態(tài)學(xué)鑒定，包括菌落形態(tài)和染色形態(tài);2)生化鑒定，可以考慮使用API鑒定系統(tǒng)。5. 黑曲霉凍干菌種如何轉(zhuǎn)種，傳代?答：與其他菌種一樣，所不同的是使用的培養(yǎng)基應(yīng)改為改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基。6. 干粉狀的是否可做第0代使用?答：只要是菌種保藏機構(gòu)提供的凍干保藏的菌種，可以

6、確定為第0代。7. 菌種每次傳代都要做純度、特性等的確認嗎?答：從外部購入的菌種，在進入本實驗室的菌種保藏體系時，需要進行純度和特性的確認。以后的每次傳代，可以通過顯色培養(yǎng)基做簡單的確認即可。8. 如采用低溫保存菌種，需購買哪些設(shè)備?能夠到省所進行實際操作培訓(xùn)?答：低溫冰箱，應(yīng)能夠提供-70的低溫?？梢缘绞∷鶃砼嘤?xùn)。9. 做方法驗證時，工作用菌種能否同時操作，如何防止交叉污染?答：可以同時操作。避免交叉污染的關(guān)鍵是無菌操作技術(shù)。10. 是否等菌懸液的含菌數(shù)出結(jié)果后再做適用性等檢查?答：沒有必要?？蓞⒁妴栴}2。11. 菌液制備中菌液是否都要驗證儲存期?答：稀釋菌液可參考藥典規(guī)定。如要保存濃菌液，

7、則需要驗證有效期。12. 菌種CMCC是否可以用ATCC替代，從省所或中檢所購買的菌種是否每次都可以出具規(guī)范的COA?答：中國藥典使用CMCC的菌種，并沒有規(guī)定可以使用其他等效的菌種。省所提供的菌種嚴格講屬于標準貯備菌種，無法提供ATCC這樣的COA。CMCC至今也無法提供這類證明。13. 銅綠假單胞如何保藏?答：可以使用低溫冷凍保存的方法。14. 工作用菌液是否屬于亞培養(yǎng)或傳代一次?答：工作用菌液應(yīng)屬于一次傳代。三、微生物限度1. 包裝材料的大腸埃希菌檢查?答：根據(jù)包裝材料的不同，大腸埃希菌的檢查方法大致有兩種，一種是將浸提液合并后，取一部分，接種膽鹽乳糖培養(yǎng)基進行檢查;另一種是將浸提液合并

8、后，薄膜過濾，然后按規(guī)定的方法檢驗。2. 抗真菌藥品的微生物限度檢查法答：這類產(chǎn)品的霉菌和酵母菌計數(shù)方法需要進行調(diào)整，可以根據(jù)產(chǎn)品劑型的不同，選擇薄膜過濾法或培養(yǎng)基稀釋法等方法。3. 為什么在日常樣品檢測中還需要做陽性對照(國外不需要)?答：為了確保每一次檢測對可能存在的微生物都是有效的。4. 對于同一個品種，藥典為什么不規(guī)定統(tǒng)一的檢測方法?答：本版藥典進行過這樣的嘗試，也有某些品種已經(jīng)收載了統(tǒng)一的檢測方法，如注射用頭孢類抗生素的無菌檢查。之所以沒有大量收載，主要是由于檢測方法還沒有經(jīng)過必要的復(fù)核。將微生物檢驗的統(tǒng)一方法收載在品種的各論項下，始終是努力的方向。5. 梭菌檢查中需置厭氧條件下培養(yǎng)

9、48小時，是否指在厭氧培養(yǎng)箱中?答：需要在厭氧培養(yǎng)裝置中進行培養(yǎng)，未必一定是厭氧培養(yǎng)箱。6. 控制菌檢查方法驗證時，采用多種方法均未檢出控制菌，如何處理?答：在確保所使用的各種方法都沒有錯誤的情況下，如果仍無法使試驗菌生長，則應(yīng)該采用薄膜過濾法進行檢查。理由是該方法能夠最大程度地去除產(chǎn)品的抑菌作用。7.常規(guī)的監(jiān)督抽樣檢品(包括原料)在進行微生物限度檢查時，是否一定要進行活螨檢查并在原始記錄與報告書中體現(xiàn)?答：需要進行檢查?？梢栽谠加涗浿畜w現(xiàn)，報告書上可以不出現(xiàn)，除非當發(fā)現(xiàn)有活螨檢出。8. 藥包材微生物限度檢查規(guī)定了合格質(zhì)量水平，通常產(chǎn)量下取樣8個，要求8個瓶子均符合規(guī)定，如何進行?答：每個瓶

10、子分別進行實驗。9. 大腸埃希菌具體操作規(guī)程?答：參見中國藥品檢驗標準操作規(guī)程。10. 動物組織及動物類原藥材的提取物入藥，是否需要檢沙門菌?答：需要進行沙門菌檢查。11. 關(guān)于中國藥典菌落計數(shù)結(jié)果的判斷還存在疑義，望能舉例說明。答：不清楚所指的存在疑義是指哪方面。2010年版對結(jié)果報告進行了較大篇幅的修訂，目前的規(guī)定應(yīng)該比05版更為清晰、明確。12. 需做沙門菌檢驗樣品量的確定?答：10g(ml)用于樣品計數(shù)檢驗和其他控制菌檢查，10g(ml)用于沙門菌檢查，10g(ml)用于沙門菌檢查的陽性對照。需要進行沙門菌檢查的樣品，檢驗用量應(yīng)為30g(ml)。13. 日常的實驗室裝備能否達到梭菌無氧

11、的培養(yǎng)要求?答：完全可以?？梢圆捎脜捬跖囵B(yǎng)盒(罐)。14. 如果一個產(chǎn)品有兩個規(guī)格，是否可以取其中之一做陽性對照?答：每個規(guī)格均需進行陽性對照。15. 細菌數(shù)為100g/g的，樣品稀釋級只做1:10,1:100的倍數(shù)就可以了嗎?答：可以。16. 培養(yǎng)時間3天，5天，可理解為72小時，120小時嗎?答：可以。這樣更為嚴謹。17.中國藥品檢驗標準操作規(guī)范“已做驗證試驗的供試品，在檢查時刻不必再做陽性對照”如何理解?答：該標準操作規(guī)范中在無菌檢查法中規(guī)定“供試品無菌檢查應(yīng)進行陽性對照試驗”，表明不論是否進行了方法驗證，在產(chǎn)品的每一次檢驗過程中，還必須進行陽性對照。在控制菌檢查的大腸埃希菌項下，指出“

12、已做驗證試驗的供試品，在該供試品檢查時不必再作陽性對照”。該規(guī)定僅適用方法驗證與供試品檢查同時開展的情況。2005年版藥典和2010年版藥典在控制菌檢查中均對陽性對照試驗有明確規(guī)定，“進行供試品控制菌檢查時，應(yīng)做陽性對照試驗?！碑a(chǎn)品檢驗中應(yīng)以藥典規(guī)定為準。18. 無菌檢查和微生物限度檢查中，產(chǎn)品中規(guī)定的溶解液是否可以換成其他的溶液?答：可以。19. 制劑通則中，沒有微生物檢查項目的，是否可不進行微生物項目檢測?答：可以。主要是二部制劑通則中口服片劑、膠囊劑、丸劑和顆粒劑。20. 在細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)中，適用性檢查細菌是培養(yǎng)48小時，霉菌和酵母菌是培養(yǎng)72小時，供試品檢查中細菌是培養(yǎng)3天，霉菌和酵母菌是培養(yǎng)5天，那方法驗證中應(yīng)參照哪個時間進行培養(yǎng)。答：應(yīng)按照供試品檢驗時的條件，即細菌3天，霉菌和酵母菌5天。21. 測定純化水微生物限度時，每張濾膜過濾量是多少合適?需要先稀釋嗎?過濾完后需不需要沖洗?假如我取10ml純化水通過雙杯體封閉式薄膜過濾器過濾，每張濾膜上的計數(shù)是以5ml為單位還是10ml為單位?答：過濾量應(yīng)以培養(yǎng)后出現(xiàn)的微生物數(shù)不超過100cfu/膜為標準。