共軛十八碳四烯酸的制備表征和生物活性研究

1、目目 錄錄一、共軛十八碳四烯酸的簡介二、共軛十八碳四烯酸的制備和表征三、共軛十八碳四烯酸甲基化過程中的內(nèi)異構(gòu)化四、CLA、CLN和PnA對腫瘤細(xì)胞的影響 五、共軛十八碳四烯酸與BSA和小牛胸腺DNA 相互作用 一、共軛十八碳四烯酸的簡介一、共軛十八碳四烯酸的簡介1.1 多烯不飽和脂肪酸的簡介1.2 共軛十八碳四烯酸的簡介1.3 共軛十八碳四烯酸的存在和生物活性1.4 共軛十八碳四烯酸的合成方法 1.1 多烯不飽和脂肪酸的簡介多烯不飽和脂肪酸的簡介 多烯不飽和脂肪酸是指分子中含有兩個或兩個以上雙鍵且碳原子數(shù)為1622的直鏈脂肪酸。常見的多烯不飽和脂肪酸有：亞油酸、亞麻酸(LN)、共軛亞油酸(CL

2、A)、共軛亞麻酸(CLN)、共軛十八碳四烯酸（PnA）、花生四烯酸(AA)以及二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸(DHA)等。 多烯不飽和脂肪酸是構(gòu)成體內(nèi)脂肪的一種脂肪酸，是人體必需的脂肪酸。研究發(fā)現(xiàn)，存在特殊共軛結(jié)構(gòu)的脂肪酸，如共軛亞油酸、共軛亞麻酸等都具有抗癌、抗動脈硬化、降血壓、降血脂、減肥等非常有益的功效。同時還發(fā)現(xiàn)活性和其結(jié)構(gòu)存在相關(guān)性，即共軛程度越高，活性越強。PnA分子具有四共軛結(jié)構(gòu)，和共軛亞油酸、共軛亞麻酸在結(jié)構(gòu)上具有高度的相似性，因此近年來PnA也引起了化學(xué)家、生物醫(yī)學(xué)專家等的極大興趣。 1.2 1.2 共軛十八碳四烯酸的簡介共軛十八碳四烯酸的簡介 共軛十八碳四烯酸(Pa

3、rinaric acid,簡稱為PnA)是指分子中含有十八個碳原子，四個共軛雙鍵的直鏈脂肪酸。四個共軛雙鍵所處的位置及幾何構(gòu)型的多樣性使得共軛十八碳四烯酸具有非常復(fù)雜的同分異構(gòu)體。主要的異構(gòu)體包括以下四種：9(c),11(t),13(t),15(c)-十八碳四烯酸(又稱-PnA或cis-PnA)，9(t),11(t),13(t),15(t)-十八碳四烯酸(又稱-PnA或trans-PnA), 9(c),11(t),13(t),15(t)-十八碳四烯酸,9(t),11(t),13(t),15(c)-十八碳四烯酸,(c代表順式；t代表反式)。幾種parinaric acid的分子式如下圖所示 9(

4、c),11(t),13(t),15(c)-18:4 9(c),11(t),13(t),15(t)- 18:4 9(t),11(t),13(t),15(c)- 18:4H O O CH O O CH O O CH O O C 9(t),11(t),13(t),15(t)- 18:41.3 1.3 共軛的十八碳四烯酸存在和生物活性共軛的十八碳四烯酸存在和生物活性 天然PnA存在于鳳仙花、等鞭金藻等植物中。 許多研究已表明十八碳多烯酸具有多種有益的生理活性，但是目前關(guān)于PnA生物活性的研究才剛剛興起。目前發(fā)現(xiàn)PnA具有抗腫瘤、治療皮膚病、抗動脈粥樣硬化等非常有益的生理活性。1.4 1.4 共軛十八碳

5、四烯酸的合成方法共軛十八碳四烯酸的合成方法 常見的共軛十八碳四烯酸的合成方法主要包括生物法 和化學(xué)法兩大類 。生物合成法：COOHO2H2O2COOH化學(xué)合成法：OHO1RBrBr+RBrBrRBr2;3;4RBrRROHO2b2c2a2d+5二、共軛十八碳四烯酸的制備和表征 2.1 天然產(chǎn)物提取法 2.2 表征鳳仙花籽的磨碎氯仿浸泡旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿皂化（5%的 KOH/CH3OH溶液）酸化（2M鹽酸）靜置分離得到FA低溫結(jié)晶白色晶體 低溫結(jié)晶法是根據(jù)不同脂肪酸雙鍵數(shù)目差別越大，其在有機溶劑中的溶解度差別就越大而且這種差別在低溫下會更加明顯的特點進(jìn)行脂肪酸純化的一種方法。因此可將混合脂肪酸溶于

6、適當(dāng)?shù)娜軇?，進(jìn)行低溫冷藏過濾即可除去大量的飽和脂肪酸以及低不飽和脂肪酸。2.2 表 征圖2-1 鳳仙花籽油的氣相色譜圖圖2-2 cis-PnA的紫外光譜圖圖2-3 trans-PnA的紫外光譜圖圖2-5 trans-PnA甲基酯的 Ag+-HPLC 圖2-4 cis-PnA甲基酯的Ag+-HPLC 本研究結(jié)果表明，低溫結(jié)晶法操作簡便，成本低，提純產(chǎn)物純度高。在4低溫下經(jīng)三次結(jié)晶可以大幅度提高鳳仙花籽油中的PnA純度，其純度達(dá)到了95以上。更為重要的是，通過簡便的異構(gòu)化方法，我們得到了異構(gòu)體的純品。此外，我們采用氣相色譜、紫外光譜、 Ag+-HPLC色譜技術(shù)對制備出的兩種異構(gòu)體進(jìn)行了 表征。 在

7、PnA的Ag+-HPLC分析中我們發(fā)現(xiàn)，在甲基化過程中PnA出現(xiàn)了嚴(yán)重的內(nèi)異構(gòu)化，這種內(nèi)異構(gòu)化現(xiàn)象使無法認(rèn)識到真實的PnA組成情況。由于不同PnA異構(gòu)體的化學(xué)性質(zhì)、生物活性等存在較大差別，因此除非能避免甲基化過程的內(nèi)異構(gòu)化，否則就不能準(zhǔn)確、深入的開展其穩(wěn)定性、活性機理等方面的后續(xù)研究。本實驗利用Ag+-HPLC分析異構(gòu)體組成，以便優(yōu)化甲基化條件，使得內(nèi)異構(gòu)化程度最小。 3.1 trans-PnA在1.5M硫酸/甲醇溶液中的內(nèi)異構(gòu)化3.2 鳳仙花籽油中五種異構(gòu)體的Ag+-HPLC表征3.3 鳳仙花籽油中十二種異構(gòu)體確定3.4 異構(gòu)化時間和溫度對鳳仙花籽油內(nèi)異構(gòu)化的影響3.1 trans-PnA3

8、.1 trans-PnA在在1.5M1.5M硫酸硫酸/ /甲醇溶液中的內(nèi)異構(gòu)化甲醇溶液中的內(nèi)異構(gòu)化圖3-1 trans-PnA甲基化后的Ag+-HPLC圖譜分析，(a)在25下反應(yīng)10min, (b)在80下反應(yīng)60min圖3-2 鳳仙花籽油在25下反應(yīng)10min的Ag+-HPLC圖譜 3.2 3.2 鳳仙花籽油中五種異構(gòu)體的鳳仙花籽油中五種異構(gòu)體的Ag+-HPLCAg+-HPLC表征表征圖3-3 在25下反應(yīng)10min trans-PnA和cis-PnA兩種內(nèi)標(biāo)的Ag+-HPLC圖譜 浸漬層析柱屬于一種極性硅膠柱，能夠基于極性的不同分離有機化合物。有機物的極性越弱，其保留時間越短，越早被洗脫

9、。共軛十八碳四烯酸異構(gòu)體中，,t,t,t t極性最弱，然后依次為 c,t,t,t；c,t,t,c；c,t,c,c；c,c,c,c。同時由于以前的研究表明鳳仙花籽油中只含有9, 11, 13, 15位置異構(gòu)體，圖中的峰1和峰3分別為trans-PnA(t9,t11,t13,t15-18:4)和cis-PnA(c9,t11,t13,c15-18:4)，因此我們可以斷定峰2，4，5分別為c9,t11,t13,t15-18:4; c9,t11,c13,c15-18:4 和c9,c11,c13,c15-18:4。3.3 3.3 鳳仙花籽油中十二種異構(gòu)體確定鳳仙花籽油中十二種異構(gòu)體確定 Ag+-HPLC可

10、以將幾何構(gòu)型相同而位置構(gòu)型不同的異構(gòu)體分開，它的分離的原理是雙鍵距離-COOCH3越遠(yuǎn)，異構(gòu)體越先流出。 按照這個規(guī)律，共軛十八碳四烯酸異構(gòu)體分別是， 在A組中，異構(gòu)體1，2，3分別為t11,t13,t15,t17-18:4 ； t10,t12,t14,t16-18:4 ；t9,t11,t13,t15-18:4 ； 在B組中，異構(gòu)體4，5，6分別為c11,t13,t15,t17-18:4； c10,t12,t14,t16-18:4；c9,t11,t13,t15-18:4； 在C組中，7，8分別c10,t12,t14,c16-18:4; c9,t11,t13,c15-18:4； 在D組中, 9,

11、10分別為c9,t11,c13,c15-18:4； c8,t10,c12,c14-18:4； 在E組中,11,12分別為,c11,c13,c15-18:4 ； c8,c10,c12,c14-18:4 。3.4 3.4 異構(gòu)化時間和溫度對鳳仙花籽油異構(gòu)化時間和溫度對鳳仙花籽油 內(nèi)異構(gòu)化的影響內(nèi)異構(gòu)化的影響MethylationIsomeric composition of parinari glaberrimum seeds oil TempTimeI1I2I3I4I5I 6I7I8I 9I10I11I1225 10 min0.000.007.050.000.0014.330.0074.853.

12、010.000.760.0020 min0.960.006.930.361.2215.200.9770.703.000.000.670.0040 min1.130.007.750.431.4315.850.9769.162.770.000.510.0060 min1.280.676.830.351.5115.140.8870.682.170.040.460.0040 10 min1.340.009.020.501.6314.810.8768.942.490.000.400.0020 min2.500.0013.520.752.7617.121.1159.612.280.070.270.0040

13、 min4.240.0021.971.434.3219.131.3144.842.350.180.230.0060 min5.990.0029.572.115.5619.791.5232.482.220.490.260.0060 10 min6.9114.1716.713.286.1020.612.3924.613.460.720.690.3620 min10.2318.5421.315.856.7920.361.9010.382.930.920.480.3040 min12.8718.1122.1610.226.4418.395.253.651.291.110.350.1660 min13.

14、7121.3320.9713.676.6612.835.682.551.191.020.250.1580 10 min9.4521.5817.9419.0611.718.227.151.501.401.260.470.2620 min10.3025.4016.5418.1610.858.375.391.711.461.180.460.1840 min12.9820.7621.7812.496.5313.875.653.001.391.230.200.1260 min11.7626.9419.9112.575.6913.105.412.041.120.870.310.27實心方塊、實實心方塊、實

15、心圓、心圓、 實心實心三角、實心反三角、實心反三角標(biāo)三角標(biāo) 記曲記曲線分別代表線分別代表25， 40、 60、 80。這12種，即5組異構(gòu)體，發(fā)生了位置異構(gòu)：在A組中(t,t,t,t，)異構(gòu)體3被異構(gòu)化為了1和2，即由9,11,13,15-18:4 異構(gòu)化為10,12,14,16-18:4 和11,13,15,17-18:4 兩種位置異構(gòu)體。在組B、C、D、E中也發(fā)生了類似的位置異構(gòu)體的轉(zhuǎn)變從圖中可以看出，甲基化反應(yīng)的溫度越高，時間越長，t,t,t,t-的含量也越大。在組B中c,t,t,t-異構(gòu)體情況類似，與A組不同的是，當(dāng)溫度為80 ，反應(yīng)時間達(dá)到40分鐘和60分鐘時，c,t,t,t-異構(gòu)體

16、的含量降低，也就是說80 ，40分鐘是c,t,t,t-異構(gòu)體含量發(fā)生變化的拐點，這個拐點表明在這個反應(yīng)條件下c,t,t,t-異構(gòu)體轉(zhuǎn)變?yōu)榱藅,t,t,t-異構(gòu)體。在組C，組D和組E中， 隨著溫度的升高，對應(yīng)的各個異構(gòu)體的含量都下降了。因此我們可以斷定，在甲基化過程中c,t,t,c-, c,t,c,c-, 和 c,c,c,c- 都被異構(gòu)化為了 t,t,t,t 和c,t,t,t。也就是說，在甲基化過程中順式構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榱朔词綐?gòu)象。 本研究揭示了異構(gòu)化過程中的兩個規(guī)律，一個是，異構(gòu)化是和反應(yīng)的溫度，時間有關(guān)的過程，溫度越高，時間越長，異構(gòu)化越嚴(yán)重。 另外一個是，不同異構(gòu)體之間的相互轉(zhuǎn)化與它們的位置，順

17、反構(gòu)型有關(guān)的。從表中得出下面的結(jié)論： 9,11,13,15-18:4異構(gòu)化為 10,12,14,16-18:4, 11,13,15,17-18:4 或者8,10,12,14-18:4位置異構(gòu)體，得出的另外一個結(jié)論： c,t,t,c-, c,t,c,c-, 和c,c,c,c-異構(gòu)化為 t,t,t,t 和 c,t,t,t。 4.1 CLA對腫瘤細(xì)胞 BEL-7402 的抑制作用4.2 CLN 對腫瘤細(xì)胞BEL-7402的抑制作用4.3 PnA對腫瘤細(xì)胞BEL-7402的抑制作用 MTT又叫噻唑藍(lán)，是一種黃顏色的染料， MTT法是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶

18、能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。 4.1 CLA4.1 CLA對腫瘤細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞 BEL-7402 BEL-7402 的抑制作用的抑制作用組別藥物濃度（M）A（吸光度值）抑制率（%）對照組0.05850CLA 組110501005000.046670.038170.041170.044830.0185020.2334.7629.6323.3668.384.2 CLN 4.2 CLN 對腫瘤細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞BEL-7402BEL-7402的抑制作用

19、的抑制作用組別藥物濃度（M）A（吸光度值）抑制率（%）對照組0.05850CLN 組110501005000.048670.047170.055170.053670.0163316.8119.375.6988.26272.084.3 PnA4.3 PnA對腫瘤細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞BEL-7402BEL-7402的抑制作用的抑制作用組別藥物濃度（M）A（吸光度值）抑制率（%）對照組0.05850PnA組110501005000.048690.043970.029840.020410.00942311.7413.4235.2331.7476.511. 脂肪酸的濃度越大，吸光度越小，對腫瘤細(xì)胞生 長的抑制

20、作用也越大。 結(jié) 論2. 三種脂肪酸對腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用為CLACLNPnA。即：共軛雙鍵的數(shù)目越多，對腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用越大。 5.1 與與BSA作用作用 5.2 與與CTDNA相互作用相互作用5.1 5.1 與與BSABSA作用作用(1) 熒光光譜熒光光譜 30032034036038040042044046002004006008001000anIntensity(a.u.)W avelength(nm )(2) 猝滅機理的推斷猝滅機理的推斷熒光猝滅機理包括動態(tài)淬滅和靜態(tài)淬滅兩種。以上這些不同的淬滅機理我們可以通過對SternVolmer淬滅方程， 即即 F0/F = 1 + K

21、q 0Q = 1 + KsvQ 的回歸分析來加以判定。0510152025303540451.01.52.02.53.03.5370C270C200CF0/FQ/(10-5mol.L-1)在不同溫度下在不同溫度下PnAMe對對BSA熒光熒光淬滅的滅的Stern-Volmer圖圖結(jié)論：PnAMe和BSA的淬滅反應(yīng)為動態(tài)猝滅機理。(3) 作用力類型的確定作用力類型的確定 藥物和生物大分子之間的相互作用力包括氫鍵、靜電作用、范德華力、疏水力四種。根據(jù)反應(yīng)前后熱力學(xué)焓變H 和熵變S的大小，可以判斷藥物與生物大分子之問的主要作用力類型：H0、S0為疏水作用力；H0、S0為靜電引力。 T/kKsv/(10

22、3L.mol-1)rSDH/(KJ.mol-1)G/(KJ.mol-1)S/(J.mol-1.K-1)2933003103.5014.8085.4230.99350.99560.99630.01240.01430.010518.865-20.00-20.93-22.26132.65 PnAMe與與BSA結(jié)合的結(jié)合的Stem-Volmer淬滅常數(shù)及相關(guān)的熱力學(xué)常數(shù)滅常數(shù)及相關(guān)的熱力學(xué)常數(shù) 結(jié)論： PnAMe與BSA的結(jié)合的主要作用力為疏水作用力。(4) 表觀結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點數(shù)表觀結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點數(shù)復(fù)合物的表觀結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點數(shù)可由下式求出：lg(F0-F)F = lgKb + n lgQ 0.40.60.81.01.21.41.61.8-1.6-1.4-1.2-1.0-0.8-0.6-0.4-0.20.00.20.4Lg(F0-F)/FLgQ結(jié)論：結(jié)合位點數(shù)n為1，表觀結(jié)合常數(shù)為1.84210-2L.mol-1 (5) 同步熒光光譜同步熒光光譜260280300320340360020406080100120140 FWavelength(nm)61BSA的同步熒光光譜的同步熒光光譜(T=310K，=15nm) 2402602803003203403600200400600800 61FWavelength(nm)BSA的同步熒