功能基因組-熒光實(shí)時(shí)定量PCR原理及應(yīng)用

1、熒光實(shí)時(shí)定量PCR原理及應(yīng)用 l 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)的原理 RQPCR技術(shù)是通過(guò)在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。Ct值(cycle threshold，Ct)，即PCR擴(kuò)增過(guò)程中擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)，它與模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，模板DNA量越多，熒光達(dá)閾值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

2、技術(shù)的分類 根據(jù)所使用的熒光化學(xué)物質(zhì)的不同，實(shí)時(shí)熒光定量PCR主要分為2類，分別是熒光探針和熒光染料。熒光探針又可分為水解探針、雙雜交探針、分子信標(biāo)和復(fù)合探針。熒光染料目前主要是以SYBR Green I為主的一種擴(kuò)增序列非特異性的檢測(cè)方法。2.1水解探針 以TaqMan探針為代表的水解探針，又叫外切核酸酶探針。其原理是應(yīng)用Taq酶天然的5-3核酸外切酶的活性。如圖所示。能夠使雙鏈DNA的5核苷酸裂解單核苷酸釋放。根據(jù)Taq酶這一特性，依照目的基因設(shè)計(jì)一個(gè)能與之的異性結(jié)合的探針，探針的5端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)如FAM，3端標(biāo)有熒光猝滅基團(tuán)如BHQ，兩者構(gòu)成能量傳遞。正常情況下兩者距離很近形成能量傳

3、遞，5端發(fā)出的熒光被3端熒光猝滅基團(tuán)所吸收或者抑制而不出現(xiàn)熒光信號(hào)的變化。 PCR擴(kuò)增時(shí)，引物和探針都結(jié)合在模板上，探針在引物的上下游之間。隨著反應(yīng)的進(jìn)行當(dāng)擴(kuò)增延伸到探針結(jié)合的位置時(shí)，利用Taq酶的5到3外切酶活性將探針切斷，破換了2個(gè)熒光分子之間的能量傳遞，使3端的猝滅作用解除，5端FAM的熒光信號(hào)被釋放出來(lái)。PCR每復(fù)制一個(gè)特異性核苷酸片段，就會(huì)有一個(gè)探針被切斷，同時(shí)一個(gè)5端的報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被檢測(cè)出。這樣PCR產(chǎn)物與熒光信號(hào)之間形成一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系。因?yàn)檠h(huán)參數(shù)Ct與起始模板數(shù)的對(duì)數(shù)成負(fù)相關(guān)，通過(guò)制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測(cè)樣品的Ct值就能確定起始模板的數(shù)量。因此，根據(jù)PCR反應(yīng)體系的

4、熒光強(qiáng)度就能準(zhǔn)確的計(jì)算出起始模板的拷貝數(shù)。圖圖2 TaqMan2 TaqMan探針熒光實(shí)時(shí)定量原理探針熒光實(shí)時(shí)定量原理 2.2 雙雜交探針 又稱Lightcycler技術(shù)，是Roche公司最近開(kāi)發(fā)的一種PCR定量技術(shù)。其原理如圖3所示。該技術(shù)需要設(shè)計(jì)兩條熒光標(biāo)記探針，將熒光分子和猝滅分子標(biāo)記分別標(biāo)記在兩個(gè)探針上。第1條探針的5端標(biāo)記熒光基團(tuán)，第2條探針的3端標(biāo)記猝滅基團(tuán)并且其3端必須被封閉以阻止DNA聚合酶以第2條探針為引物和成DNA。2條探針在目的基因上的互補(bǔ)序列是鄰近的。2條探針首尾相連且2條探針上熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光波長(zhǎng)不同，當(dāng)2條探針都已結(jié)合上目的基因時(shí)，探針上的熒光基團(tuán)被猝滅而猝滅基團(tuán)

5、被激發(fā)。熒光猝滅的程度與起始模板量成正比，從而進(jìn)行定量分析。圖圖3 3 雙雜交探針實(shí)時(shí)定量雙雜交探針實(shí)時(shí)定量PCRPCR原理原理2.3分子信標(biāo) 又稱分子燈塔法，是一種根據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理建立起來(lái)的熒光定量技術(shù)。其原理如圖4所示。分子信標(biāo)長(zhǎng)約25 nt，是一段能夠與靶標(biāo)核苷酸序列互補(bǔ)的探針。它的空間結(jié)構(gòu)成頸環(huán)結(jié)構(gòu)，頸長(zhǎng)約5-7 nt，由與目標(biāo)序列無(wú)關(guān)的互補(bǔ)序列構(gòu)成，其另一端連有熒光基團(tuán)另一端連有猝滅基團(tuán)。環(huán)序列是與靶標(biāo)序列互補(bǔ)的探針；當(dāng)沒(méi)有靶標(biāo)序列時(shí)，分子信標(biāo)呈現(xiàn)頸環(huán)結(jié)構(gòu)，頸部的熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)十分接近可以發(fā)生RFRET；熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光被猝滅基團(tuán)所吸收，此時(shí)并不能檢測(cè)到熒光信號(hào)。 當(dāng)靶

6、標(biāo)序列存在時(shí)，環(huán)序列與靶標(biāo)序列結(jié)合形成雙鏈結(jié)構(gòu)比無(wú)靶標(biāo)序列的頸環(huán)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，這種結(jié)構(gòu)使熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)分開(kāi)，熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光并不能被猝滅基團(tuán)所吸收，因此可以檢測(cè)到熒光信號(hào)。圖圖4 4 分子信標(biāo)實(shí)時(shí)熒光定量分子信標(biāo)實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR原理原理 2.4 復(fù)合探針 這種探針結(jié)合了雙雜交探針和分子信標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)，同樣需要合成2條探針，第1條探針的5”端連人熒光基團(tuán)，第2條探針的3端連入一個(gè)熒光猝滅基團(tuán)，第1條探針的熒光基團(tuán)可以和第2條探針的猝滅基團(tuán)雜交。其原理如圖5所示。當(dāng)2個(gè)探針結(jié)合時(shí)熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被猝滅基團(tuán)所吸收因此不能檢測(cè)到熒光信號(hào)。當(dāng)2個(gè)探針?lè)珠_(kāi)時(shí)，熒光探針發(fā)出的熒光信號(hào)就不能夠被

7、猝滅探針的猝滅基團(tuán)吸收，因而能夠檢測(cè)到熒光信號(hào)。當(dāng)反應(yīng)體系中沒(méi)有與之結(jié)合的模板時(shí)，2個(gè)探針發(fā)生雜交，無(wú)熒光檢測(cè)信號(hào)。 當(dāng)PCR反應(yīng)體系中存在模板時(shí)，探針與模板結(jié)合而分開(kāi)，從而有熒光信號(hào)產(chǎn)生。熒光信號(hào)的強(qiáng)度與模板的數(shù)量成正比，因而可以進(jìn)行PCR定。 圖圖5 5 復(fù)合探針熒光實(shí)時(shí)定量復(fù)合探針熒光實(shí)時(shí)定量PCRPCR原理原理2.5 SYBR熒光染料 SYBR是一種特異的結(jié)合小溝的雙鏈DNA的染料，當(dāng)其與雙鏈DNA結(jié)合后能發(fā)出熒光信號(hào)。而不與雙鏈DNA結(jié)合的SYBR GreenI染料不會(huì)發(fā)出熒光。使熒光信號(hào)的強(qiáng)度與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的增加同步。其原理如圖6所示。SYBR GreenI在實(shí)時(shí)定量檢測(cè)方面有很

8、多優(yōu)點(diǎn)，由于它與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，僅需2個(gè)用于擴(kuò)增的引物，不需設(shè)計(jì)探針對(duì)其標(biāo)記。成本更低廉。不必因模板不同而特別定制，設(shè)計(jì)的程序通用性比較好。圖圖6 SYBR Green 16 SYBR Green 1熒光實(shí)時(shí)定量熒光實(shí)時(shí)定量PCR PCR 原理原理3 應(yīng)用（1）轉(zhuǎn)基因植物的定量檢測(cè) 轉(zhuǎn)基因作物中外源基因拷貝數(shù)是影響目的基因表達(dá)水平的一個(gè)重要因素，對(duì)外源基因拷貝數(shù)的檢測(cè)成為轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的關(guān)鍵。王育花等利用SYBR Green熒光染料對(duì)轉(zhuǎn)大麥煙酰胺合成酶基因(NAS 1)水稻中的外源基因拷貝數(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。以蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)作為水稻的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，分別獲得了外源目的基因和內(nèi)標(biāo)

9、準(zhǔn)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)性和擴(kuò)增效率十分理想。陳穎等采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，應(yīng)用特異的引物和探針，對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆中的外源基因EPSPS和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin進(jìn)行了定量檢測(cè)，建立了商業(yè)化轉(zhuǎn)基因大豆RoundupRead的定量PCR檢測(cè)方法。黃文勝等1使用反向PCR的方法克隆了轉(zhuǎn)基因延熟番茄“華番一號(hào)”的外源基因和番茄基因組之間的一段邊界序列，并設(shè)計(jì)了具有品系特異性的熒光探針和引物，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)建立了華番一號(hào)的品系特異性檢測(cè)方法。在檢測(cè)華番一號(hào)番茄時(shí)，相對(duì)檢測(cè)靈敏度可達(dá)到01，絕對(duì)靈敏度達(dá)到20個(gè)拷貝?？梢?jiàn)該方法檢測(cè)的靈敏度非常高。（2）動(dòng)物檢疫中常見(jiàn)病原體的檢測(cè) 豬瘟是

10、A類傳染病對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害十分嚴(yán)重。溫國(guó)元等u引應(yīng)用TaqMan探針實(shí)時(shí)定量PCR法建了快速檢測(cè)豬瘟病毒技術(shù)。 沙門氏菌是人畜共患病的病原體，也是食源性疾病最常見(jiàn)的病原體。目前對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)主要常規(guī)微應(yīng)用生物學(xué)方法，但是常規(guī)的檢測(cè)比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力?？追钡碌葢?yīng)用TaqMan探針定量PCR檢測(cè)方法，建立了快速檢測(cè)沙門氏菌的RT-PCR方法，其檢測(cè)靈敏度比常規(guī)PCR方法高100倍，為沙門氏菌的檢測(cè)提供一種更加快速和靈敏的檢測(cè)方法。羊痘也是動(dòng)物病中最為嚴(yán)重的一種，常規(guī)診斷羊痘感染的方法費(fèi)時(shí)又費(fèi)力并且特異性和敏感性不高。不能滿足快速準(zhǔn)確診斷的要求?？滴挠竦葏⒔⒌腡aqManPCR技術(shù)，該法檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定、特

11、異性和敏感性較高。（3）基因表達(dá)研究中的應(yīng)用 賈聰聰?shù)葹榱私獍唏R魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中FGF-3基因的時(shí)空表達(dá)情況，探討FGF-3基因?qū)ε咛グl(fā)育的調(diào)控作用。該研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)FGF-3基因mRNA表達(dá)量，擴(kuò)增FGF3基因特異性片段，構(gòu)建了基因片段重組質(zhì)粒pGEMTFGF-3。通過(guò)實(shí)時(shí)定量檢測(cè)得知FGF-3主要在胚胎發(fā)育早期表達(dá)。表達(dá)可能與胚胎腦、眼、耳、咽弓及尾部器官的發(fā)育調(diào)控有關(guān)。 總結(jié)總結(jié) 實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)可以對(duì)不同組織、不同處理、不同發(fā)育階段的基因表達(dá)差異進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，檢測(cè)不同基因在細(xì)胞表達(dá)中的豐度、mRNA分析表達(dá)和分析基因的表達(dá)等研究。 總之，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和快速等特點(diǎn)。這種檢測(cè)方法是的計(jì)算核酸拷貝數(shù)的有效的方法。雖然定量PCR與傳統(tǒng)PCR相比有很多優(yōu)點(diǎn)，但是也有許多不足之處，如：應(yīng)用封閉的檢測(cè)，雖然減少了擴(kuò)增后電泳的檢測(cè)，但是不