生物技術(shù)之-基因工程載體(vector)

1、現(xiàn)代生物技術(shù)現(xiàn)代生物技術(shù)第二章第二章 基因工程基因工程王旻王旻中國藥科大學(xué)中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 參考書參考書1、基因工程原理 吳乃虎 科學(xué)出版社 第二版 19982、分子克隆實驗指南 第二版 J.薩姆布魯克等 科學(xué)出版社 19923、現(xiàn)代生物技術(shù)導(dǎo)論 瞿禮嘉等 高等教育出版社 19984、現(xiàn)代生物技術(shù)概論 何忠效等 北京師范大學(xué)出版社5、生物制藥技術(shù) 王旻等 化學(xué)工業(yè)出版社 20036、基因工程 樓士林等 科學(xué)出版社 20027、生物技術(shù)與生物藥物 王旻等譯 化學(xué)工業(yè)出版社 2006第一節(jié) 基因工程的發(fā)展歷史和基本概念一、基因工程的發(fā)展歷史基因工程發(fā)展史有關(guān)的重要事

2、件年份重要事件186919441953195819611965196619671970197219731974197519771982198519972000F.Miescher首次從鮭魚精子中分離到DNAO.T.Avery等人在肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實驗中發(fā)現(xiàn)遺傳信息的攜帶者是DNA而不是蛋白質(zhì)J.D.Watson和H.C.Creck提出了DNA分子結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型M.Meselson和F.W.Stahl提出了DNA半保留復(fù)制模型M.W.Nirenberg等人應(yīng)用合成的mRNA分子poly(U)破譯出了第一批遺傳密碼F.Jacob和J.Monod提出了調(diào)節(jié)基因表達的操縱子模型證明細菌的抗藥性通常有一

3、類叫”質(zhì)?！钡念~外染色體攜帶M.W.Nirenberg,S.Ochoa,H.G.Khorana共同破譯了全部的遺傳密碼發(fā)現(xiàn)了可將DNA連接起來的DNA連接酶H.O.Smith等分離到第一種核酸內(nèi)切限制酶,它可以在特定位點將DNA分子切割開來以H.Boyer,P.Berg等人為代表的一批美國科學(xué)家發(fā)展了重組DNA技術(shù),并于己于1972年得到第一個重組的DNA分子,1973年完成第一個細菌基因的克隆首次實現(xiàn)了異源真核生物基因在大腸桿菌中的表達F.Sanger及A.Maxam和W.Gilbert發(fā)明了快速的DNA序列測定技術(shù).1977年第一個全長5387bp的嗜菌體X174基因組測定完成第一個基因工

4、程藥物-胰島素在美國和英國獲準(zhǔn)使用第一批轉(zhuǎn)基因家畜(兔,豬和羊)誕生多莉羊誕生人類基因組草圖繪制完成基因工程歷史中的三個重要事件1、1972年，美國斯坦福大學(xué)的P. Berg博士率先完成了DNA體外重組試驗。（分享1982年諾貝爾化學(xué)獎）SV40DNA+嗜菌體DNA EcoR1 T4DNA連接酶 重組DNA2、具有性狀功能的基因能否重組？1973年，美國斯坦福大學(xué)的S.Cohen等人成功地進行了另一個體外DNA重組試驗。 R6-5 +pSC101 EcoR1 T4DNA連接酶 重組DNA轉(zhuǎn)入大腸桿菌重組菌 Kanr Tetr Kanr + Tetr 3、不同物種、尤其是真核基因能否在原核生物中

5、重組與表達？ 1974年，S.Cohen與H.Boyer合作進行了如下試驗，結(jié)果表明：動物基因的確進入到大腸桿菌細胞，并轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的RNA.以上試驗的重要意義有三點：以上試驗的重要意義有三點：1、說明像pSC101這樣的質(zhì)粒分子是可以作為基因克隆的載體，能夠?qū)⑼庠碊NA分子導(dǎo)入宿主細胞。2、說明像非洲爪蟾這樣真核動物的基因是可以被成功地轉(zhuǎn)移到原核細胞重并實現(xiàn)其功能表達。3、說明了質(zhì)粒-大腸桿菌不失為一種成功的基因克隆體系，可以作為基因克隆的模式系統(tǒng)進行深入研究。二、基本概念定義：基因工程是指按照人們的意愿，在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之轉(zhuǎn)入到原先沒有

6、這類分子的宿主細胞內(nèi)，形成能持續(xù)穩(wěn)定繁殖的新物種。其目的是為人類提供有用產(chǎn)品及服務(wù)。三、主要步驟與內(nèi)容：1 1、獲得目的基因、獲得目的基因2 2、在體外，將帶有目的基因的外源、在體外，將帶有目的基因的外源DNADNA片段連接到能自我片段連接到能自我復(fù)制并具有選擇記號的載體分子上，形成重組復(fù)制并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNADNA分子。分子。3 3、將重組、將重組DNADNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷毎?，并與之一起分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷毎?，并與之一起增殖。增殖。4、從大量細胞繁殖群體中，篩選出獲得重組、從大量細胞繁殖群體中，篩選出獲得重組DNA分子的分子的宿主細胞克隆。宿主細胞克隆。5

7、、從這些篩選出來的宿主細胞克隆中，提取出已經(jīng)得到、從這些篩選出來的宿主細胞克隆中，提取出已經(jīng)得到擴增的目的基因，供進一步分析研究用。擴增的目的基因，供進一步分析研究用。6、將目的基因克隆到表達載體上，導(dǎo)入宿主細胞，使之、將目的基因克隆到表達載體上，導(dǎo)入宿主細胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達，產(chǎn)生出人類所需要的在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。物質(zhì)。第二節(jié) 基因工程的工具酶 定義：凡在基因工程中應(yīng)用的酶統(tǒng)稱為工具酶。 一、限制酶 (restrict enzymes) （一）限制與修飾現(xiàn)象 大多數(shù)的細菌對于噬菌體的感染都存在一些功能性障礙，即所謂的寄主控制的限制(restr

8、iction)和修飾(modification)現(xiàn)象，簡稱R/M體系。作用：一是保護自身的DNA不受限制，而是破壞外源DNA使之迅速降解。 （二）限制酶的命名和分類（二）限制酶的命名和分類 定義：凡在識別并切割雙螺旋DNA分子內(nèi)特定核苷酸順序的酶統(tǒng)稱為限制酶。（1）限制酶命名：）限制酶命名： （2）限制酶分類：）限制酶分類：根據(jù)酶的性質(zhì)，可分為三類（三）第型限制酶的作用性質(zhì) 1、基本特性：（1）識別位點為48個核苷酸序列；（2）識別位點即為切割位點；（3）位點上核苷酸順序通常呈雙重旋轉(zhuǎn)對稱結(jié)構(gòu)，即呈回文結(jié)構(gòu)。5 G C T G A A T T C G A G 33 C G A C T T A

9、A G C T C 5EcoR I的識別序列的識別序列EcoR I的切割位點的切割位點切割方式通常有三種：在識別順序兩條鏈對稱軸上同時切斷磷酸二酯鍵，形成齊平末端。如Hae， PvuII。在識別順序兩條鏈對稱軸上兩側(cè)同時從5 端切斷磷酸二酯鍵，形成5 磷?；?5個核苷酸單鏈粘性末端。如EcoR。在識別順序兩條鏈對稱軸上兩側(cè)同時從3 端切斷磷酸二酯鍵，形成3羥羥基端25個核苷酸單鏈粘性末端。入Pst。PvuII等產(chǎn)生的平頭末端等產(chǎn)生的平頭末端5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5PvuII 37 5 G-C-T-C-A-G-

10、OH P-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 EcoRI等產(chǎn)生的等產(chǎn)生的5粘性末端粘性末端5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5EcoRI 37 5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3 C-G-A-C-T-T-A-A-P Ho-G-C-T-C 5 退火退火 4-7 5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5OH POHPPstI等產(chǎn)生的等產(chǎn)生的3粘性末端粘性末端5 G-C-T

11、-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5PstI 37 PstI 37 5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5 退火退火 4-7 4-7 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OH POHP2、同裂酶識別順序與切割方式均相同者，為之同裂酶。例如HpaII和和MspI識別順序都是CCGG,切割方式亦相同。C CGGGGC C3、同尾酶 它是與同裂酶對應(yīng)的一類限制酶，它們雖來源各異，識別

12、的靶子序列也各不相同，但都產(chǎn)生出相同的粘性末端，稱為同尾酶。例如BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一組同尾酶。他們切割后都形成GATC4個核苷酸組成的粘性末端。BamHI GGATCC CCTAGG BclI TGATCA ACTAGT 顯然，由同尾酶所產(chǎn)生DNA片斷，是能夠通過其粘性末段之間的互補作用而彼此連接起來。因此，在基因克隆實驗中很有用處。有一對同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端結(jié)合形成的位點，稱之為“雜種位點”。必須指出，這類雜種位點的結(jié)構(gòu)，一般是不能夠在被原來任何一種同尾酶所識別和切割的。同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接BamHI5 5GGA

13、TCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 TACTAG 55 GATCAT5 退火GCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATT4-DNA ligaseTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT5 TGATCAACTAGT5 BclIGCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT二、二、DNA連接酶（連接酶（ligase）及）及DNA分子體外連接分子體外連接（一）（一） DNA連接酶和連接酶和T4DNA連接酶連接酶1976年發(fā)現(xiàn)，廣泛存在于細胞內(nèi)。目前應(yīng)用的多數(shù)來自于大

14、腸桿菌，稱為E.coliDNA連接酶。分子量74000dal,輔因子NAD+,其作用是封閉雙螺旋骨架上具有5-磷酰基和3-羥基的缺口，形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶連接酶5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OH POHP5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5nicknick（T4DNA連接酶）連接酶）T4DNA連接酶連接酶T4DNA連接酶來自于連接酶來自于T4噬菌體感染的噬菌體感染的E.coli，為，為T4噬菌體自噬菌體自身的表達產(chǎn)物。分子量身的表達產(chǎn)物。

15、分子量6.8萬萬dal，輔因子位，輔因子位ATP，該酶既能，該酶既能連接粘性末端，亦能連接齊平末端。連接粘性末端，亦能連接齊平末端。修復(fù)與修復(fù)與RNA鏈結(jié)合的鏈結(jié)合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵鏈上缺口處的磷酸二酯鍵T4-DNA連接酶5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C 5OHPnick5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C 5連接多個平頭雙鏈連接多個平頭雙鏈DNA分子：分子：5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-

16、A-C-C-T-C 55 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 T4-DNA連接酶連接酶（二）粘性末端（二）粘性末端DNA片段的連接（連接酶的作用）片段的連接（連接酶的作用） 用DNA連接酶，可催化外源DNA和載體分子之間發(fā)生連接作用，形成重組分子。 具體做法是，在體外將具有粘性末端的DNA限制片斷，插入到適當(dāng)載體分子上，再用DNA連接酶連接，從而可以按照人們的意圖構(gòu)建出新的DNA雜種分子。同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEc

17、oRI5GCTTAAAATTCG5 5 GCTTAA 55 AATTCG5 退火GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAG用粘性末端構(gòu)建重組體用粘性末端構(gòu)建重組體DNA的最主要缺點：的最主要缺點：1、無法控制外源基因的插入方向；2、由限制酶產(chǎn)生的具有粘性末端的載體DNA分子，在連接反應(yīng)混合物中會發(fā)生自我環(huán)化作用，經(jīng)連接酶作用，形成共價閉環(huán)的穩(wěn)定環(huán)形結(jié)構(gòu)?？朔撊秉c的方法是，用堿性磷酸酶預(yù)先

18、處理線性的載體DNA分子，以移去末端的5磷酸基團，于是在連接反應(yīng)中，它自身的兩個末端之間就再也不能被連接酶共價連接起來了。（三）平末端（三）平末端DNA片段的連接片段的連接1、同聚物加尾法、同聚物加尾法 是由美國斯坦福大學(xué)的P.Labban和D.Kaiser1972年發(fā)展起來的，可以連接任何兩段DNA分子的普遍性方法。原理：利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)轉(zhuǎn)移核苷酸的特殊功能，將同種核苷酸（dNTP)加到DNA分子單鏈延伸末端的3-OH上。如果在目的基因兩側(cè)加polydA，則在載體兩側(cè)加polydT。長度一般1040個殘基。 缺點：插入的片段難以回收。無法控制外源基因插入方向。人工粘性末端的

19、連接人工粘性末端的連接 平頭末端平頭末端C 3 GG5 G 3C5C3GT4-DNA ligaseTdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT 3C退火C3 TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA 3 GG3 AAAAAAAAAAC5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1C3 5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG加熱加熱GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT人工粘性末端的連接人工

20、粘性末端的連接 3突出末端突出末端CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGT4-DNA ligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC 3C退火Pst IPst IC3 CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAG

21、GGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowPst ISph I人工粘性末端的連接人工粘性末端的連接 5突出末端突出末端5GCCTAGGATCCG5 5 GCTTAA 555 AATTCGT4-DNA ligase5 5Klenow補平Klenow補平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGG5 GAATTCTTAA 555 AATTCTTAAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAA AATTCGGGGGGTTAAG

22、GGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5 5GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火B(yǎng)amH IBamH IEcoR IBamH I2、銜接物（、銜接物（linker)連接法連接法所謂銜接物是指用化學(xué)方法合成的一段由1012個核苷酸組成，具有一個或數(shù)個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸段片斷。將銜接物的5末段和待克隆的DNA片段的5末端用多核苷酸激酶

23、處理使之磷酸化，然后通過T4DNA連接酶的作用是兩者連接起來，接著用適當(dāng)?shù)南拗泼赶咩暯游锏腄NA分子和載體分子，由此使兩者都產(chǎn)生出彼此互補的粘性末端。優(yōu)點：克隆后還可回收原插入片斷。BamHI5 5GGATCCCCTAGGT4-DNA ligaseKlenow補平GATCC5 G5GCCTAG55 5GGATCCCTAG5 GATCCCTAGG55GGATCGGAATTCCCCTAGCCTTAAGG5 5EcoR IGGAATTCCCCTTAAGGEcoR I linkerGGAATTCCGATCCCCTTAAGGCTAGGEcoR I DNA銜接物連接法盡管有諸多優(yōu)點，但明顯的銜接物連接

24、法盡管有諸多優(yōu)點，但明顯的缺點缺點是，是，如果待克隆的如果待克隆的DNA片段或基因的內(nèi)部也含有與所加的銜接物片段或基因的內(nèi)部也含有與所加的銜接物相同的限制位點，這樣在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同相同的限制位點，這樣在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時，也會把所克隆的基因切成不同的片段，從而對后繼的亞時，也會把所克隆的基因切成不同的片段，從而對后繼的亞克隆及其他操作造成麻煩?？寺〖捌渌僮髟斐陕闊?、DNA接頭接頭(adaptor)連接法連接法 DNA接頭接頭是由美國康奈爾大學(xué)吳瑞博士于1977年發(fā)明的，它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端，

25、另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。當(dāng)它的平末端與平末端的外源DNA片段連接后，便會使后者成為具有粘性末端的新的DNA分子，而易于連接重組。問題：各個DNA接頭分子的粘性末端之間，會通過互補堿基間的配對作用，形成如同DNA銜接物一樣的二聚體分子，失去接頭的本來意義?？朔姆椒ㄊ菍?末端的磷酸修飾移去，其結(jié)果為暴露出的5-OH所取代。如此一來，雖然兩個接頭分子粘性末端之間仍具有互補堿基配對的能力，但終因DNA連接酶無法在5-OH和3 OH之間形成磷酸二酯鍵而不會產(chǎn)生出穩(wěn)定的二聚體分子。NoImage第三節(jié)第三節(jié) 基因工程載體（基因工程載體（vec

26、tor）能將目的基因攜帶至宿主細胞并可在其中自主復(fù)制的遺傳因子謂之為基因工程載體相關(guān)概念相關(guān)概念 有用基因亦稱為目的基因或插入物 用于接受重組DNA的擴增載體及其插入物或表達目的基因的受體細胞謂之宿主 插入物的擴增過程稱為分子克隆 攜帶重組DNA分子的宿主為基因工程細胞（菌）或重組細胞（菌）基因工程載體的必備條件基因工程載體的必備條件1、具有有效運載能力2、攜帶外源性目的基因前后在宿主內(nèi)功能自主復(fù)制3、在宿主內(nèi)能控制外源基因表達活動4、堅定方便，裝卸手續(xù)簡單5、能攜帶大小不同的外源性目的基因、載體分子量要小, 載力要大6、容易控制、安全可靠、穩(wěn)定性好三大類基因工程載體 細菌質(zhì)粒 病 毒DNA

27、基因真核表達 植物表達（煙草花葉病毒） 動物表達（腺病毒） 噬菌體DNA一、細菌質(zhì)粒 、質(zhì)粒的生物學(xué)性質(zhì)、質(zhì)粒的生物學(xué)性質(zhì) 細菌質(zhì)粒是存在于細胞質(zhì)中的一類獨立于染色體的自主復(fù)制的遺傳物質(zhì)。 絕大多數(shù)的質(zhì)粒都是由環(huán)形雙鏈DNA組成的復(fù)制子。（現(xiàn)發(fā)現(xiàn)有線性質(zhì)粒，酵母的殺傷質(zhì)粒是一種RNA質(zhì)粒）環(huán)形雙鏈質(zhì)粒分子具有三種不同構(gòu)型1、共價閉合環(huán)形DNA（SCDNA）：兩條多核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu);2、開環(huán)DNA（OCDNA）：兩條鏈中只有一條保持完整環(huán)形結(jié)構(gòu)，另一條鏈出現(xiàn)一至數(shù)個缺口;3、線性分子DNA（LDNA）通稱L構(gòu)型：質(zhì)粒DNA經(jīng)過適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶切割后，發(fā)生雙鏈斷裂而形成; 以上三種不

28、同的構(gòu)型的同一種質(zhì)粒，盡管分子量相同，但在瓊脂糖凝膠電泳中，電泳遷移率不同，順序是SCDNA、LDNA、OCDNA質(zhì)粒的生物學(xué)性質(zhì)分子量小，差異顯著，小的分子量為106dal,大的可達108dal。易于在宿主間轉(zhuǎn)移和遷移。在宿主內(nèi)可伴隨宿主染色體復(fù)制而復(fù)制，與宿主呈共生關(guān)系。 且其存在與否與宿主生死無關(guān)。 編碼宿主染色體不具有的基因，賦予宿主細胞額外遺傳特性 （如抗生素抗性）、質(zhì)粒的分類、質(zhì)粒的分類迄今為止，人們已在大腸桿菌的各種菌株中找到了許多種不同類型的質(zhì)粒，其中已經(jīng)作了較詳盡研究，了解比較透徹的主要有F質(zhì)粒、R質(zhì)粒和Col質(zhì)粒。由于這些質(zhì)粒的存在，寄主細胞便獲得了各自不同的性狀特征，我們

29、可以依據(jù)這些特征來鑒別這三種不同類型的質(zhì)粒。1、F質(zhì)粒質(zhì)粒 又叫F因子(fertility factor)或性質(zhì)粒(sex plasmid), 這是由于它能夠使寄主染色體上的基因和F質(zhì)粒一道 轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的受體胞中去而得名。 是在某些大腸桿菌細胞中發(fā)現(xiàn)的一種具有代表性的單 拷貝的接合型質(zhì)粒，其大小約為 94kb左右，總共編碼 19個轉(zhuǎn)移基因（tra)。在寄主中，在寄主中，F(xiàn)質(zhì)粒有三種不同的存在方式質(zhì)粒有三種不同的存在方式1、以染色體外環(huán)形雙鏈質(zhì)粒DNA形式存在，其上不帶有 任何來自寄主染色體的基因或DNA區(qū)段。這樣的細胞 叫F+細胞2、以染色體外環(huán)形雙鏈質(zhì)粒DNA形式存在，同時在其上

30、 還攜帶著細菌的染色體基因或DNA區(qū)段。這樣的細胞 叫F細胞3、以線性DNA形式從不同位點整合到寄主染色體上，這 樣的細胞叫做Hfr(High frequential recomhimant) 高頻重組細胞2、R質(zhì)粒質(zhì)粒通稱抗藥性因子。在其結(jié)構(gòu)中編碼有一種或數(shù)種抗菌素抗性基因，并且通常能夠?qū)⒋朔N抗性轉(zhuǎn)移到缺乏該質(zhì)粒的適宜的受體細胞，使后者也獲得同樣的抗菌素抗性能力。3、Col質(zhì)粒質(zhì)粒即所謂產(chǎn)生大腸桿菌素因子。它們編碼有控制大腸桿菌素合成的基因。大腸桿菌素是一類可以使不帶有Col質(zhì)粒的親緣關(guān)系密切的細菌菌株致死的蛋白質(zhì)。革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾焊锾m氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾航雍闲唾|(zhì)粒

31、能在天然條件下自發(fā)地從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒等非接合型質(zhì)粒 不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用如Col、R的其他成員F因子屬接合型質(zhì)粒，而Col質(zhì)粒和R質(zhì)粒中，既有屬于接合型的，也有屬于非接合型的。從基因工程的角度考慮，感興趣的主要是非接合型質(zhì)粒，這是因為接合型的質(zhì)粒不僅能夠自我從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一細胞，而是還能夠轉(zhuǎn)移染色體記號。因此，如果使用接合型質(zhì)粒作載體，在理論上存在著發(fā)生使DNA跨越生物種間遺傳屏障的潛在危險性。、重要的質(zhì)粒載體、重要的質(zhì)粒載體目前常用于基因克隆的質(zhì)粒載體均為人工構(gòu)建。經(jīng)改造后達到這些要求：其分子結(jié)構(gòu)中必須具有多個單一限制酶切割位點，

32、且切點最好位于選擇性標(biāo)記上構(gòu)建重組質(zhì)粒后必須具有轉(zhuǎn)化功能最好帶有兩個以上強選擇性標(biāo)記分子量較小，為松弛型復(fù)制控制，易于操作宿主范圍小，無感染性，不受其他質(zhì)粒誘動。1、Col E1質(zhì)粒載體 Col E1質(zhì)粒屬大腸桿菌Col類質(zhì)粒中的一種，由于攜 帶Col質(zhì)粒的許多細菌都能產(chǎn)生一類叫做細菌素的物 質(zhì)，故Col質(zhì)粒又被稱作細菌素質(zhì)粒。細菌素是一類特殊蛋白質(zhì)，它通過同敏感細胞細胞壁的融合作用，而抑制一種或數(shù)種在細胞內(nèi)進行的生命過程，如DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯以及能量代謝等，從而使這些細胞停止生長。總結(jié)：總結(jié)：分子量4.2106dal，攜帶Col質(zhì)粒的許多菌能產(chǎn)生細菌素 Col E1 編碼大腸桿菌素E1基

33、因和大腸桿菌素E1 免疫基因。有單一EcoR切點，切開接入外源 基因后，雖失去大腸桿菌素E1能力，但卻不影 響DNA復(fù)制能力屬松弛型復(fù)制，多拷貝，拷貝數(shù)可大1000-30002、pSC101質(zhì)粒載體 pSC101是一種嚴緊型復(fù)制控制的低拷貝數(shù)的大腸桿菌 質(zhì)粒載體，平均每個寄主細胞僅有1-2個拷貝。 其分子大小為9.09kb，編碼一個四環(huán)素極性基因(tetr), 該質(zhì)粒對EcoR、Hind、BamH、Sal、Xho、 Pvu和Sma等7種限制酶有單一識別位點。 其中Hind、 BamH和Sal等3個位點克隆外源DNA 都會使tetr失活。（插入失活效應(yīng)） pSC101質(zhì)粒載體性質(zhì)：質(zhì)粒載體性質(zhì)：

34、嚴緊型復(fù)制控制 低拷貝 1-2個拷貝/細胞9.09kb 編碼一個tetr， 有EcoR、 Hind、BamH等7個 酶切單一位點，可插入失活。非洲爪蟾核糖體基因即是用該質(zhì)?？寺∪秉c：低拷貝，表達效率低。pSC101是第一個成為用于克隆真核DNA的大腸桿菌質(zhì)粒載體，1973年成功地將帶有非洲爪蟾核糖體基因的EcoRI DNA片段，連接到pSC101復(fù)制子上。應(yīng)用pSC101質(zhì)粒載體在大腸桿菌細胞中克隆非洲爪蟾的基因3、pBR322 是一種人工構(gòu)建的重要質(zhì)粒 特點：帶有多種抗藥性的強選擇記號 具有低分子量，高拷貝 外源DNA插入不影響復(fù)制功能 有多種核酸內(nèi)切限制酶單切割位點命名: p：表示質(zhì)粒 B

35、R:分別取自兩位主要構(gòu)建者F.Bolioax 和R.L.Rodrignez姓氏的頭一個字母 322:指實驗室編號pBR322pBR322BamBamHIHISalSalI IHinHindIIIdIIIPstPstI IScaScaI IAmpAmpr roriori(4.36 kb)(4.36 kb)pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點自身分子量小 4363bp同時具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號具有較高的拷貝數(shù)重組DNAAmprTcs提取DNA 電泳AmprAmprAmprAmprTcrTcrTcAmprTcsTcs轉(zhuǎn)化 無菌落陽性菌落篩選重組子2)DNA重組無DNA插入有DNA插入外源

36、DNA1)限制酶切pBR322由三個不同的部分組成1、來源于pSF2124質(zhì)粒易位子Tn3的ampr2、來源于pSC101質(zhì)粒的tetr3、來源于ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復(fù)制起點4、pUC質(zhì)粒載體是在pBR322載體質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，組入了一個在其5端帶有一段多克隆位點的lacZ基因，而發(fā)展成為具有雙功能檢測特性的新型質(zhì)粒載體系列。pUC18 / 19：正選擇標(biāo)記正選擇標(biāo)記 lacZ 的顯色原理的顯色原理 pUC18/19 Plac lacZMCS b b-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的a a-肽段肽段OHHHOHHOHHOHCH2OHONClBrClBrClBrONN 5-溴溴-4-氯氯-

37、3-吲哚基吲哚基-b b-D-半乳糖苷半乳糖苷X-gal5-溴溴-4-氯靛藍（藍色）氯靛藍（藍色）476bp片段含有E.coli的lacZ基因的 5-序列，表達半乳糖苷酶的片段。LacZ的上游包括乳糖操縱子上的啟動子Plac和操縱基因O。lacZ之內(nèi)有M13的多功能連接器多克隆位點（MCS）。BamHIpUC182686 bpAprlacZoriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIII(2)pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點具有更小的分子量(2

38、686bp)和更高的拷貝數(shù)(500700)適用于組織化學(xué)方法檢測重組體具有多克隆位點MCS區(qū)段，可以更方便的插入外源基因二、噬菌體載體和柯斯載體二、噬菌體載體和柯斯載體(cosmid) 及單鏈及單鏈DNA噬菌體載體噬菌體載體(M13)(一一)噬菌體噬菌體DNA1、噬菌體的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)噬菌體為雙鏈DNA病毒，宿主為E.Coli。在宿主內(nèi)有溶菌和溶源兩種形式，在溶源方式中，噬菌體感染宿主后其DNA整合到宿主染色體DNA中，伴隨宿主染色體復(fù)制而復(fù)制。噬菌體DNA是有48502bp組成的線性雙螺旋分子，分子量3.1107dal。迄今已定位的基因至少61個，其中一半?yún)⑴c了噬菌體生命周期的活動，我們稱這類基

39、因為噬菌體的“必要基因 ”；另一部分基因，當(dāng)它們被外源基因取代后，并不影響噬菌體的生命功能，我們稱這類基因為噬菌體的“非必要基因”。這為其作為基因工程噬菌體的基礎(chǔ)。野生型的噬菌體DNA兩端各具12個核苷酸組成的粘性末端，可用來構(gòu)建柯斯質(zhì)粒（cosmid）。l l 噬菌體生物學(xué)特性：噬菌體生物學(xué)特性： 生物結(jié)構(gòu)生物結(jié)構(gòu)5 TCCAGCGGCGGGG 3 3CCCGCCGCTGGA 5 COSCOS cos頭部合成基因頭部合成基因 尾部合成基因尾部合成基因 溶菌控制基因溶菌控制基因 晚期控制基因晚期控制基因 DNA合成控制合成控制基因基因 阻遏基因阻遏基因 早期控制基因早期控制基因 阻遏基因阻遏基

40、因 重組基因重組基因 刪除與整合基因刪除與整合基因l - DNA2、 噬菌體DNA克隆載體野生型的DNA不適宜作為克隆載體。因為其分子量較大，常用的限制酶切點較多。如EcoRI切點5個，Hind切點7個，而這些切點大多位于溶菌周期生長所必須基因內(nèi)，容納不下比其更大的外源性DNA片段，必須對其進行改造。改造方法：將噬菌體感染到具有EcoR I限制修飾體系的和不具有EcoR I 限制修飾體系的兩種寄主細胞中循環(huán)生長，使DNA 的EcoR I 位點發(fā)生修飾作用或產(chǎn)生點突變，使其一些EcoR I 位點不能再被EcoR I 切割。最終篩選獲得僅有1-2個限制酶位點的DNA。將DNA在體外用限制酶消化，再

41、將未切割部分包裝并感E.Coli。如野生型DNA 上有7個Hind限制位點，從圖中可看出，E.Coli位點1 和2之間片段的缺失，可降去兩個Hind位點1和2。按此上方法，可構(gòu)建兩類噬菌體派生載體取代型載體或替換型載體（replacement vector） 它具有成對的克隆位點，這兩個位點之間的DNA 區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代。如EMBL4 和Charon40。 (圖5-12)插入型載體（insertion vectors）只具有一個可供外源DNA插入的克隆位點（也有一些具有兩個插入位點）。外源性DNA克隆到插入型的載體分子上會使噬菌體的某中生物功能喪失，即所謂插入失活效應(yīng)。如免

42、疫功能失活的和大腸桿菌-半乳糖苷酶失活的兩種亞型。我們把這些經(jīng)過改造的噬菌體載體稱為：我們把這些經(jīng)過改造的噬菌體載體稱為：凱倫噬菌體載體（凱倫噬菌體載體（Charon bacteriophage）凱倫噬菌體是F.R.Blattner等人于1977年在噬菌體基礎(chǔ)上發(fā)展出來的一種特殊的噬菌體載體。凱倫是古希臘神話中的一位老擺渡工，專司運送亡靈到陰間。這類載體有插入型的如Charon2,亦有替換型的如Charon30。他們在基因工程實驗中用途十分廣泛。許多Charon載體帶有編碼-半乳糖苷酶基因以及它的操控基因和啟動子的lac 5取代區(qū)段，如Charon 4噬菌體可以在Xgal瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生出深藍

43、色的噬菌斑。而當(dāng)含有l(wèi)ac 5的EcoRI片段被外源DNA取代后，所形成的重組噬菌體就只能產(chǎn)生出無色的噬菌斑，可以很方便的進行重組體篩選。（圖5-13）載體遺傳標(biāo)記檢測載體遺傳標(biāo)記檢測顯色篩選法顯色篩選法顯色篩選法的基本操顯色篩選法的基本操作：作： AprlacZori3、DNA載體重組分子的體外包裝以噬菌體DNA為載體構(gòu)成的重組DNA分子必須包裝成完整病毒顆粒后才具有感染宿主的能力。噬菌體的正常包裝過程噬菌體的正常包裝過程1、先按滾環(huán)復(fù)制合成多連體的DNA，2、這些DNA 在具備噬菌體頭部前體和A基因產(chǎn)物的條件下，從cos為點處被切割成DNA 單體分子，并被很快裝填到頭部外殼里邊，3、它具有

44、的12bp長的粘性末端，又會重新環(huán)化起來，4、基因產(chǎn)物便滲入到完整的頭部，接著通過基因W和基因F II產(chǎn)物的作用，把頭部與尾部結(jié)構(gòu)連成一體，最終形成成熟的噬菌體顆粒。體外包裝過程體外包裝過程利用兩個琥珀突變種噬菌體，一個是Dam 噬菌體，產(chǎn)生頭部蛋白。另一個是噬菌體Eam突變體產(chǎn)生尾部蛋白。上述溶菌物與重組DNA混合后，基因E產(chǎn)物（主要為外殼蛋白）在基因A產(chǎn)物作用下，與基因D產(chǎn)物一起將重組DNA包裝成噬菌體頭部，在基因W及基因F產(chǎn)物作用下，將頭部和尾部連接成完整噬菌體顆粒。特點：特點：經(jīng)包裝后重組DNA分子轉(zhuǎn)化率提高100-1000倍。這類載體可以有效克隆15kb大小的外源基因。(二)科斯質(zhì)粒

45、載體（Cosmid vectors）1、概述噬菌體一般有效克隆外源基因范圍僅為15kb左右，但有些基因可達35-40kb，甚至更大，同時噬菌體不能夠同時克隆兩個連鎖基因。為此，1978年，J.Collins及B.Hohn等人發(fā)展出科斯質(zhì)粒載體，可滿足以上需要?！癱osmid”一詞是由英文“cos site-carrying plasmid”縮寫而成，其愿意是指帶有粘性末端位點(cos)的質(zhì)粒。定義：科斯質(zhì)粒是人工構(gòu)建的，含有DNA 的粘性(cos)末端序列、質(zhì)粒復(fù)制起始區(qū)及質(zhì)粒一個抗藥性標(biāo)記的、兼具質(zhì)粒與噬菌體DNA載體雙重性質(zhì)的特殊載體。（圖5-18）2、Cosmid的特點目前已有許多不同類

46、型的科斯質(zhì)粒載體，其特點如下： 具有噬菌體的特性；具有質(zhì)粒載體特性；具有高容量的克隆能力；具有與同源序列的質(zhì)粒進行重組的能力。3、科斯克隆應(yīng)用科斯質(zhì)粒載體，在大腸桿菌細胞中克隆大片段的真核基因組DNA的技術(shù)，叫做科斯克隆(cosmid cloning)。先用特定的核酸內(nèi)切酶局部切割真核生物DNA，產(chǎn)生較高分子量的外源DNA片段，與經(jīng)同樣酶切割過的科斯質(zhì)粒線性分子進行體外連接反應(yīng)，由此形成的連接產(chǎn)物群體中，有一定比例的分子是兩端各有一個cos位點的長度為40kb左右的真核DNA片段，而且這兩個cos為點在取向上是一致的，它可作為Ter體系的一種通用底物。當(dāng)加入噬菌體的包裝連接物時，它將能識別并切

47、割這種兩端由 cos 位點包圍著的35-45 kb長的真核DNA片段，并把這些分子包裝進入噬菌體的頭部。（圖5-19）(三三)單鏈單鏈DNA噬菌體噬菌體M13載體載體1、概述 噬菌體M13宿主為絲狀E.Coli，其遺傳物質(zhì)為單 鏈環(huán)狀DNA，故稱為單鏈DNA噬菌體。其DNA分子長度為6500bp。M13是一種雄性大腸桿菌特有的噬菌體，因此它們只能感染帶有F性須的大腸桿菌菌株。其復(fù)制過程如下：2、M13克隆體系中半乳糖苷酶顯色反應(yīng) M13克隆體系，包括M13噬菌體本身和寄主菌株兩個組成部分。但無論M13載體，還是大腸桿菌寄主菌株（如JM101），單獨都不能產(chǎn)生有功能活性的半乳糖苷酶，而這種酶的活

48、性可以用X-gal顯色法測定出來。 在M13體系中，已將Lac阻遏基因的Iq突變引入宿祖細胞。該Iq突變基因可產(chǎn)生出10余倍超量的阻遏物。這些阻遏物的存在可以抑制Lac操縱子的表達。IPTG是一種乳糖類似物，再無乳糖的條件下，他可以誘導(dǎo)細胞合成半乳糖苷酶。因此，IPTG被稱為半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的安慰誘導(dǎo)物安慰誘導(dǎo)物。安慰誘導(dǎo)劑3、M13載體系列的優(yōu)點 單鏈DNA噬菌體的復(fù)制是以雙鏈環(huán)形DNA為中 間媒介的，這種RFDNA可以如同質(zhì)粒DNA一樣， 在體外進行純化和操作。 不論是RFDNA還是ssDNA，它們都能夠轉(zhuǎn)染感 受態(tài)的E.Coli寄主細胞產(chǎn)生出噬菌斑 單鏈DNA噬菌體顆粒的大小，是受

49、其DNA多寡 的制約，因此，并不存在包裝限制。 應(yīng)用這類單鏈DNA噬菌體，可以容易地控制外 源DNA片段的插入取向?？僧a(chǎn)生大量純化的含外源DNA片段插入的單鏈 DNA分子。這種單鏈DNA分子可按雙脫氧鏈終 止法做核苷酸序列測定，也可用于制備具放射 性同位素標(biāo)記的DNA探針，可以進行寡核苷酸 定點突變?？傊?，M13載體兼具質(zhì)粒載體與噬菌體的優(yōu)點。采用Sanger雙脫氧鏈終止DNA測序法：測序三要素：測序三要素：1、模板DNA母鏈。新合成鏈按堿基互補原則（A-T，C-G）進行。2、引物DNA短鏈。起起始合成作用。3、酶、底物（dATP、dTTP、dGTP、dCTP)和非正常底物（ddATP、ddT

50、TP、ddGTP、ddCTP) 。 DNA序列測定法非正常底物非正常底物三、真核基因病毒載體三、真核基因病毒載體病毒載體優(yōu)點是：1、有很高的拷貝數(shù)；2、強大的啟動子，可保證外源基因的高效表達；3、可保證糖基化。常用的有SV40病毒載體及昆蟲桿狀病毒載體。真核基因表達載體應(yīng)具備的條件：1、含有原核基因的復(fù)制起始序列（如ColEI起始序列ori）以及篩選標(biāo)記（如使E.Coli具有 Ampr的-內(nèi)酰胺酶基因 ）。這樣便于在E.Coli細胞中進行擴增和篩選。2、含有真核基因的復(fù)制起始序列（如SV40病毒的復(fù)制序列、酵母自主復(fù)制序列）以及真和細胞篩選標(biāo)記（如氨基糖苷G418抗性基因，在酵母中與自養(yǎng)有關(guān)的

51、基因）。3、含有有效的啟動子序列（可包含增強子序列等各種順式作用元件cis-acting element），保證在其下游的外源基因進行有效的轉(zhuǎn)錄起始。4、RNA聚合酶II所需的轉(zhuǎn)錄終止和poly(A)加入的信號序列。5、合適的供外源基因插入的限制性內(nèi)切酶位點。SV40病毒載體(simian vacuolating virus 40 vector)SV40病毒DNA位環(huán)狀雙螺旋結(jié)構(gòu)，長度為5224bp，其基因組分為早期區(qū)域和晚期區(qū)域，前者在整個病毒生長循環(huán)中均可表達，后者則在DNA復(fù)制開始后的一段時間內(nèi)表達，產(chǎn)生病毒外殼蛋白。SV40 DNAoriVP2TVP3VP1tpV2(gpt)即為一個S

52、V40載體它包括pBR322的大腸桿菌復(fù)制起始位點；氨芐青霉素抗性基因；大腸桿菌谷氨酸丙氨酸酶基因gpt和SV40的哺乳動物細胞復(fù)制起始位點以及其他一些在哺乳動物細胞中表達所必須的序列。重組子可以通過對gpt進行篩選。SV40 DNA為載體的取代克隆方式又分為早期基因區(qū)域取代及晚期基因區(qū)域取代兩種類型。晚期基因區(qū)域取代方式是以外源性DNA片段取代晚期基因區(qū)域，構(gòu)成的重組DNA在宿主中可以復(fù)制，但不能產(chǎn)生重組病毒顆粒，因而采用早期基因缺失的SV40病毒突變種作為輔助病毒與晚期取代重組DNA或和感染宿主，則晚期區(qū)域取代重組DNA可獲得標(biāo)記營救，輔助病毒產(chǎn)生的晚期基因產(chǎn)物與重組病毒的早期基因產(chǎn)物一起

53、可形成完整病毒顆粒。早期區(qū)域取代方式是以外源性DNA片段取代早期基因區(qū)域，但重組DNA形成病毒顆粒與早期區(qū)域基因產(chǎn)物T抗原供應(yīng)有關(guān)，故同樣可采用晚期基因區(qū)域缺失的SV40突變種作為輔助病毒進行標(biāo)記營救，即可形成完整病毒顆粒。SV40病毒載體的宿主為動物細胞。表達產(chǎn)物有糖基化。目前很多基因工程藥物如EPO，TPA，-珠蛋白可用其表達。第四節(jié)第四節(jié) 基因的分離和獲得基因的分離和獲得 獲得目的基因，是基因工程研究中最重要的內(nèi)容，也是基因工程操作中的關(guān)鍵。 每種基因都由四種堿基組成，具有極相似的理化性質(zhì)，這給分離特定的基因帶來很大困難。 盡管如此，人們?nèi)钥赏ㄟ^各種方法有效地分離出所要的基因?；虻姆蛛x

54、和獲得的常用方法基因的分離和獲得的常用方法一、基因分離的物理方法二、鳥槍法(Shot gun) 又稱霰彈法三、cDNA文庫的建立與基因的分離四、基因組文庫法五、基因的化學(xué)合成六、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）一、基因分離的物理方法 根據(jù)DNA分子的兩條鏈存在著GC，A=T堿基配對。 如DNA分子中某段的GC堿基對含量高，則其熱穩(wěn)定性就高，其溶解溫度（Tm）就高。這樣，人們通過控制溶解溫度使富A=T區(qū)解鏈變性，而富GC區(qū)仍維持雙鏈。當(dāng)利用單鏈核酸酶S，酶去除解開的單鏈部分，得到富GC區(qū)的DNA片段 。二、鳥槍法(Shot gun) 又稱霰彈法 用限制性內(nèi)切酶將基因組DNA進行切割，得到很多在長度上與

55、一般基因大小相當(dāng)?shù)腄NA片段（1000bp），然后，將這些片段混合物隨機地重組入適當(dāng)?shù)妮d體，轉(zhuǎn)化后在受體菌（如：E.Coli）中進行擴增，再用適當(dāng)?shù)暮Y選方法篩選出你所要的基因。鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略1、隨機酶切成基因相當(dāng)大小的片段（約1000bp)；2、重組入適當(dāng)載體（質(zhì)粒）；3、轉(zhuǎn)化進宿主菌（E.coli)，擴增；4、篩選出含有目的基因的目的重組子，進而獲得目的基因。鳥槍法適用于原核細菌目的基因的克隆分離 +鳥槍法克隆目的基因的優(yōu)缺點鳥槍法克隆目的基因的優(yōu)缺點優(yōu)點：操作簡單，命中率較高。缺點：盲目性大，陽性片段不一定正好是基因，樣本多，可能會漏。三、cDNA

56、文庫的建立與基因的分離 是以mRNA為模版，用反轉(zhuǎn)錄酶合成互補DNA的方法。 cDNA的克隆對于特定基因的分離和特性研究是極有價值的工具。 cDNA文庫最關(guān)鍵的特征是它只包括在特定的組織或細胞類型中已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄成mRNA的那些基因序列。cDNAcDNA文庫組建步驟如下：文庫組建步驟如下：1、分離表達目的基因的組織或細胞。2、從組織和細胞中制備總RNA和mRNA3、第一條cDNA鏈的合成4、第二條cDNA鏈的合成5、cDNA上接頭的加入6、雙鏈cDNA與載體的連接7、從眾多的重組體中篩選出特定的基因cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略mDNAc cDNA第一鏈的合成第一鏈的合成

57、 5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 35ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5cDNA第一鏈第一鏈引物引物退火退火逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPsc cDNA第二鏈的合成第二鏈的合成 煮沸煮沸NaOH自身引導(dǎo)法：自身引導(dǎo)法：獲得的雙鏈獲得的雙鏈cDNA 5端會有幾對堿基缺失端會有幾對堿基缺失AAAAAAAAAAAAAA5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTT

58、TTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTOH 3KlenowdNTPsS1c cDNA第二鏈的合成第二鏈的合成 DNApol dNTPsRNaesH置換合成法：置換合成法：獲得的雙鏈獲得的雙鏈cDNA 5端也會有幾對堿基缺失端也會有幾對堿基缺失5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAp 55S1 AAAATTTOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55TTTTTTTTTTTTTTOH 3AAAAAAAAAAAAAA 55TTTTTTTTTTTTTT 33T4-DNA l

59、igasec cDNA第二鏈的合成第二鏈的合成 dCTP引導(dǎo)合成法：引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈獲得的雙鏈cDNA 能保留完整的能保留完整的5端序列端序列5ppp5G G AAAAAOH 3TTTTTp 53 HO5ppp5G G AAAAACCCCCCCOH 33 HO CCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 55 p GGGGGGG3 HOCCCCCCCTTTTTp 55 pGGGGGGGAAAAAOH 3NaOH退火退火KlenowdNTPs 雙鏈平頭的雙鏈平頭的cDNA通常克隆入載體中的三種方法：通?？寺∪胼d體中的三種方法： 平

60、頭末端直接與載體連接，平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收但插入的片段無法回收 平頭兩端分別接同聚物尾，平頭兩端分別接同聚物尾，最好是最好是AT同聚物尾，同聚物尾，這樣重組分子可通過加熱局部變性和這樣重組分子可通過加熱局部變性和S1核酸酶處理核酸酶處理回收插入片段回收插入片段 加裝人工接頭引入酶切口，加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段的回收以便插入片段的回收cDNA法克隆目的基因的局限性法克隆目的基因的局限性四、基因組文庫法所謂基因組文庫是將基因組DNA通過限制性內(nèi)切酶部分酶解后所產(chǎn)生的基因組DNA片段隨機地同相應(yīng)的載體重組、克隆，所產(chǎn)生的克隆群體代表了基因組DNA的所有序列?；蚪M