醋酸纖維薄膜電泳實(shí)驗(yàn)

1、tnii學(xué)朮友叢網(wǎng)論文發(fā)表專家一l醋酸纖維薄膜電泳實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵詞醋酸纖維薄膜；電泳；影響因素；對策keywordscelluloseacetatemembrane;electrophoresis;influencingfactors;countermeasure醋酸纖維薄膜電泳因其有快速省時、分辨能力強(qiáng)、操作簡單、成本低廉、透明后利于掃描定量及長期保持等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于血漿蛋白、脂蛋白、糖蛋白、核酸及其他生物大分子的分析檢測，已成為醫(yī)學(xué)和臨床檢驗(yàn)的常規(guī)技術(shù)，血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳實(shí)驗(yàn)也成為了生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課程必開的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目之一。但該實(shí)驗(yàn)影響因素很多，每個環(huán)節(jié)的失誤都會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響而得不

2、到理想的圖譜，并且還造成很大浪費(fèi)。筆者結(jié)合多年的實(shí)驗(yàn)教學(xué)經(jīng)驗(yàn)對影響本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的常見因素進(jìn)行分析探討，并提出了相應(yīng)的解決對策?，F(xiàn)報(bào)道如下：1電泳前準(zhǔn)備的影響因素1.1醋酸纖維薄膜的因素1.1.1醋酸纖維薄膜的選擇醋酸纖維薄膜如果厚度不一、粗面細(xì)孔不均、脆性不一，在電泳時會出現(xiàn)區(qū)帶不均勻、白色斑點(diǎn)處蛋白質(zhì)不泳動而影響圖譜的效果1。對策：購買知名度相對高的正規(guī)廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品；將干膜片漂浮于電極緩沖液表面，如漂浮20s左右時，膜片出現(xiàn)白斑點(diǎn)或條紋，應(yīng)舍去不用2。1.1.2醋酸纖維薄膜的浸泡由于醋酸纖維薄膜親水性比較低,匸交發(fā)表專家一LB國學(xué)朮發(fā)叢網(wǎng)浸泡時間過短，不能保證膜片上有一定量的緩沖液，難以使其

3、恢復(fù)原來多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，所以浸泡時間不少于30min。浸泡時用鑷子將纖維薄膜條粗面向下平穩(wěn)放入緩沖液中，使其自然濕潤沉下液面或用手輕搖裝液外盒，不要用鑷子、玻棒等器材按壓纖維素薄膜沉下液面，也不要同時將多條纖維素薄膜一起放進(jìn)緩沖液盒。1.2標(biāo)本的因素1.2.1血清標(biāo)本的新鮮度不新鮮血清標(biāo)本蛋白質(zhì)電泳圖譜a2與B之間可能會多出現(xiàn)一條粗而染色均勻的區(qū)帶，也可能會出現(xiàn)電泳圖譜區(qū)帶不清晰，比較離散，甚至有拖尾現(xiàn)象1。有研究證明，在28C冰箱保存血清標(biāo)本，第1天與第2天標(biāo)本中各蛋白質(zhì)組分百分比變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從第3天開始，標(biāo)本中白蛋白百分比下降，a1-球蛋白、a2-球蛋白和B-球蛋白百分比上升均有統(tǒng)計(jì)

4、學(xué)意義3。因此，必須使用新鮮的血清，如新采取血清標(biāo)本不是馬上用，則必須放4C冰箱貯存保鮮，但時間最多不能超過48h。1.2.2溶血標(biāo)本溶血標(biāo)本中白蛋白降低，a2-球蛋白、B-球蛋白升高。嚴(yán)重溶血時可見a2、B球蛋白區(qū)帶重疊，區(qū)帶百分比增加4，因此應(yīng)采用清亮無溶血的血清標(biāo)本。1.2.3點(diǎn)樣標(biāo)本的替代有文獻(xiàn)報(bào)道，在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中用雞蛋白（雞蛋清：緩沖液=1：9）代替血清作為點(diǎn)樣樣品，加樣量約3卩l(xiāng),可取得卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵白蛋白、溶菌酶和卵黏蛋白4條電泳區(qū)帶5。用雞蛋白作為實(shí)驗(yàn)材料，既取材方便，又能節(jié)約成本。匸交發(fā)表專家一LB國學(xué)朮發(fā)叢網(wǎng)1.3緩沖液的因素1.3.1緩沖液的離子強(qiáng)度及ph值緩沖液的離子強(qiáng)度

5、應(yīng)為0.06,ph應(yīng)為8.6。如離子強(qiáng)度過低緩沖容量小，不易維持緩沖液的ph值恒定，同時導(dǎo)致樣品所載電流增加，電泳速度加快，帶電顆粒在介質(zhì)上擴(kuò)散嚴(yán)重，分辨力明顯降低，區(qū)帶展開延長，導(dǎo)致區(qū)帶拖尾。ph過高、過低也會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。研究證實(shí)，隨著電泳次數(shù)的增加，巴比妥緩沖液的ph發(fā)生變化，且陽極變化明顯，導(dǎo)致電流強(qiáng)度、蛋白遷移率、蛋向區(qū)帶均變小，故巴比妥緩沖液實(shí)驗(yàn)6次左右就應(yīng)更換，否則會發(fā)生明顯拖尾現(xiàn)象7。對策：選擇沒有失效的分析純藥品；用電子天平準(zhǔn)確稱取藥品，精確到0.001g；配好后用ph計(jì)校正；學(xué)生多次使用時，應(yīng)在每次電泳前將正負(fù)兩極的緩沖液混勻再分別加入電泳槽兩極，保證緩沖液ph值穩(wěn)定或重新

6、配置新的緩沖液。1.3.2緩沖液的替代巴比妥緩沖液中巴比妥有毒性，長期接觸會對人體產(chǎn)生傷害，且實(shí)驗(yàn)教學(xué)中大量使用費(fèi)用較貴。有實(shí)驗(yàn)證明，用硼酸緩沖液（離子強(qiáng)度：0.08；ph8.6）代替巴比妥緩沖液能得到更清晰、更理想的電泳圖譜8-9。硼酸緩沖液連續(xù)電泳實(shí)驗(yàn)10次蛋白仍可分離清晰，這樣既減少了避免了巴比妥對操作者的傷害，又減少了成本。1.4點(diǎn)樣的因素點(diǎn)樣是本實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵的一步，點(diǎn)樣前薄膜的準(zhǔn)備、點(diǎn)樣器的選擇、匸交發(fā)表專家一LB國學(xué)朮發(fā)叢網(wǎng)點(diǎn)樣位置的選擇、點(diǎn)樣的量的多少都直接影響最后圖譜的效果。1.4.1點(diǎn)樣前薄膜的準(zhǔn)備浸泡好的薄膜吸得過干，電泳時電流不易通過薄膜，樣品在薄膜上流動困難，易導(dǎo)致電泳圖譜

7、有條痕；亦不能留存過多的緩沖液，以避免點(diǎn)樣時血清隨著緩沖液而擴(kuò)散開來，導(dǎo)致電泳圖譜分離不齊10。因此只要用濾紙輕輕吸取薄膜上的多余水分即可。142點(diǎn)樣器的選擇傳統(tǒng)用載玻片端面點(diǎn)樣，因其寬度稍大于薄膜寬度，點(diǎn)樣血清會橫跨薄膜，產(chǎn)生明顯的邊緣效應(yīng)，且有拖尾現(xiàn)象。有文獻(xiàn)報(bào)道，用自制點(diǎn)樣器（將寬為1.3cm的訂書針折成0.4cm寬，拋光，再將兩頭插入小塊有機(jī)玻璃作為手柄）得到的電泳圖譜中蛋白質(zhì)條帶無邊緣效應(yīng)，也無明顯拖尾現(xiàn)象11，并且可以在同一張薄膜上點(diǎn)樣兩次，在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中可增加學(xué)生的訓(xùn)練次數(shù)。143點(diǎn)樣位置的選擇點(diǎn)樣太靠薄膜邊緣，易產(chǎn)生邊流現(xiàn)象；點(diǎn)在薄膜光澤面上，則血清不能滲入薄膜，圖譜不清晰。所以

8、應(yīng)點(diǎn)在無光澤面距邊緣1.52.0cm處，點(diǎn)樣線與薄膜短邊平行。144點(diǎn)樣的量點(diǎn)樣的量太多易導(dǎo)致電泳圖譜分離不良或產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象；點(diǎn)樣的量太少會使圖譜區(qū)帶顯色過淺。加樣量的多少與電泳條件、樣品的性質(zhì)、染色方法與檢測手段靈敏度密切相關(guān)，如電泳后要用洗脫法定量時，每厘米加樣線上加樣量為0.10.5匸交發(fā)表專家一LB國學(xué)朮發(fā)叢網(wǎng)卩l(xiāng)，相當(dāng)于51000卩g;如是血清蛋白常規(guī)電泳分離時，加樣量不超過每厘米1卩l(xiāng)，相當(dāng)于6080卩g。對策：對每一種樣品的加樣量應(yīng)先做預(yù)實(shí)驗(yàn)；點(diǎn)樣前應(yīng)在濾紙上反復(fù)練習(xí)，掌握點(diǎn)樣技術(shù)后，再以印章法使點(diǎn)樣后的樣品呈一條線涂于纖維薄膜12。2電泳時的影響因素2.1搭橋根據(jù)電泳槽裁剪大小

9、合適的濾紙或脫脂紗布，使其對折后一端的長邊能浸入緩沖液中，另一端的長邊與支架前沿對齊。待濾紙完全浸透后，用玻璃棒輕輕擠壓膜支架上的濾紙或紗布以驅(qū)趕氣泡，使其緊貼在膜支架上13。2.2平衡薄膜傾斜放置，電泳圖譜會出現(xiàn)要靠近陽極越窄。薄膜搭在濾紙橋時應(yīng)將無光澤面向下，點(diǎn)樣端放在負(fù)極，加樣線距離橋墊2mm左右；膜條要緊貼濾紙橋不能有氣泡；膜條要拉直，不能下垂。蓋上電泳槽蓋平衡1015min。2.3通電2.3.1通電電壓電流電壓過高，圖譜展開短，蛋白質(zhì)各組分之間出現(xiàn)擠壓，區(qū)分困難；反之，以低電壓進(jìn)行電泳時，樣品泳動速度慢且易擴(kuò)散，所呈現(xiàn)的圖譜常有“拖尾”現(xiàn)象?？傠娏饕鶕?jù)放入膜條的多少計(jì)算后調(diào)節(jié)，如果

10、太大會將膜條燒斷6。按電場強(qiáng)度1012v/em（指薄膜與濾紙橋總長度），電流強(qiáng)度0.50.8ma/em匸交發(fā)表專家一LB國學(xué)朮發(fā)叢網(wǎng)膜寬（指薄膜數(shù)目的總寬度）進(jìn)行計(jì)算，并以控制電流大小為主效果較好14。232通電時間電泳時間的長短跟室溫是密切相關(guān)的，具體可待電泳區(qū)帶展開3.54.0cm后關(guān)閉電源。3電泳后的影響因素3.1染色染色時間過長，薄膜底色難以脫掉，時間過短，區(qū)帶不易區(qū)分；多條薄膜放入染液時重疊易致染色不良。因此薄膜應(yīng)一條一條逐次放入染液，保證前一條薄膜染色固定后再放入下一條，并輕輕搖動染色杯，染色10min即可。3.2漂洗漂洗液成分主要為乙醇，易發(fā)揮，所以應(yīng)密封保存或在臨用前配制。為節(jié)

11、省洗液，用鑷子將薄膜從染液中取出時盡量瀝去染液。另外，溫度對薄膜漂洗結(jié)果也有影響，如室溫過低，可將漂洗杯放入恒溫水浴箱，不能超過25C，能提高漂洗效率，又不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果15-16。因此，只需準(zhǔn)備3杯漂洗液，將薄膜依次放入3份洗液中，每次5min即可達(dá)到漂洗的目的。綜上所述，影響血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳實(shí)驗(yàn)的因素很多，在實(shí)際操作過程中想要得到理想的圖譜而又不造成浪費(fèi)和污染，就必須選擇最佳的操作條件和操作方法，盡量避免和減少上述影響因素的影響，以達(dá)到臨床檢驗(yàn)和教學(xué)實(shí)驗(yàn)的目的。匸交發(fā)表專家一LB國學(xué)朮發(fā)叢網(wǎng)參考文獻(xiàn)1 翁閃凡,莊錫偉.醋酸纖維薄膜法血清蛋白電泳的影響因素分析與對策j.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，

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