基因工程常規(guī)技術(shù)-凝膠電泳

1、帶電顆粒在電場的作用下，向著與其電性相反的電極移動帶電顆粒在電場的作用下，向著與其電性相反的電極移動電泳電泳電泳（電泳（Electrophoresis）正極正極負(fù)極負(fù)極帶負(fù)電粒子帶負(fù)電粒子帶正電粒子帶正電粒子1電泳遷移率及其影響因素電泳遷移率及其影響因素遷移率：帶電顆粒在單位電場下泳動的速度遷移率：帶電顆粒在單位電場下泳動的速度遷移率的影響因素遷移率的影響因素: 內(nèi)在因素內(nèi)在因素 外在因素外在因素2v影響遷移率的內(nèi)在因素影響遷移率的內(nèi)在因素 所帶靜電荷的多少所帶靜電荷的多少遷移率與表面電荷成正比。遷移率與表面電荷成正比。 大小和形狀大小和形狀直徑小而接近于球形，則在電場中泳直徑小而接近于球形，

2、則在電場中泳動速度快。動速度快。 DNA構(gòu)象構(gòu)象一般遷移速率超螺旋環(huán)狀一般遷移速率超螺旋環(huán)狀線狀線狀DNA單鏈開環(huán)單鏈開環(huán)3Relaxed supercoiled Increasing degree of supercoiling 相同分子量的相同分子量的DNA:閉合環(huán)狀卷曲超螺旋遷移最快，閉合環(huán)狀卷曲超螺旋遷移最快， 線性分子次之，線性分子次之， 伸展開環(huán)狀最慢。伸展開環(huán)狀最慢。4v影響遷移率的外界因素影響遷移率的外界因素 電場強(qiáng)度電場強(qiáng)度 溶液的溶液的pH值值 溶液的離子強(qiáng)度溶液的離子強(qiáng)度 溫度的影響溫度的影響 支持物的影響支持物的影響 5v電場強(qiáng)度電場強(qiáng)度 單位長度（每一厘米）支持物體上

3、的電位降，它對泳單位長度（每一厘米）支持物體上的電位降，它對泳動速度起著十分重要的作用。動速度起著十分重要的作用。v電場強(qiáng)度越高，帶電顆粒移動速度越快。電場強(qiáng)度越高，帶電顆粒移動速度越快。6v溶液的溶液的pH值值 決定了帶電顆粒解離的程度，也決定了物質(zhì)所帶凈電決定了帶電顆粒解離的程度，也決定了物質(zhì)所帶凈電荷的多少。荷的多少。v溶液的離子強(qiáng)度溶液的離子強(qiáng)度 電泳液中的離子電泳液中的離子增加增加會使電泳遷移率會使電泳遷移率降低降低 原因：帶電離子吸引相反電荷的離子聚集在其周圍，原因：帶電離子吸引相反電荷的離子聚集在其周圍，相成一個(gè)與運(yùn)動粒子電荷相反的離子氛（相成一個(gè)與運(yùn)動粒子電荷相反的離子氛（io

4、nic atmosphere），它使該離子向相反的方向運(yùn)動，從而），它使該離子向相反的方向運(yùn)動，從而降低了該粒子的遷移率。降低了該粒子的遷移率。7v溫度的影響溫度的影響 電泳過程中由于通電產(chǎn)生焦耳熱，熱對電泳有很大的電泳過程中由于通電產(chǎn)生焦耳熱，熱對電泳有很大的影響。影響。 溫度每升高溫度每升高1，遷移率約增加，遷移率約增加2.4%。為降低熱效應(yīng)。為降低熱效應(yīng)對電泳的影響，可控制電壓或電流，或在電泳系統(tǒng)中對電泳的影響，可控制電壓或電流，或在電泳系統(tǒng)中安裝冷卻散熱裝置安裝冷卻散熱裝置8v支持物的影響支持物的影響 對支持物的要求一般是均勻和吸附力小，否則電場強(qiáng)對支持物的要求一般是均勻和吸附力小，否

5、則電場強(qiáng)度不均勻，影響區(qū)帶的分離，實(shí)驗(yàn)結(jié)果及掃描圖譜無度不均勻，影響區(qū)帶的分離，實(shí)驗(yàn)結(jié)果及掃描圖譜無法重復(fù)。法重復(fù)。9電泳的分類電泳的分類Tise-leas式微量電泳式微量電泳顯微電泳顯微電泳等電聚焦電泳等電聚焦電泳等速電泳等速電泳密度梯度電泳密度梯度電泳電泳電泳 自由電泳自由電泳（無支持體）（無支持體） 區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳（有支持體）（有支持體）濾紙電泳濾紙電泳薄層電泳薄層電泳凝膠電泳凝膠電泳10凝膠電泳凝膠電泳v凝膠電泳：由瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠及聚丙烯酰胺凝膠電泳：由瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠及聚丙烯酰胺等物質(zhì)作支持物的電泳。等物質(zhì)作支持物的電泳。v特點(diǎn)：特點(diǎn)： 可以制成非常均勻的凝膠，帶電質(zhì)點(diǎn)在

6、凝膠的孔中泳動可以制成非常均勻的凝膠，帶電質(zhì)點(diǎn)在凝膠的孔中泳動 電泳操作方法簡便，電泳速度快電泳操作方法簡便，電泳速度快 分辨率高，重復(fù)性好，電泳圖譜清晰分辨率高，重復(fù)性好，電泳圖譜清晰 適用于生化，免疫等定性定量測定適用于生化，免疫等定性定量測定1112克隆基因的檢查和鑒定方法克隆基因的檢查和鑒定方法 凝膠電泳分離鑒定大凝膠電泳分離鑒定大小不等的酶解片段：小不等的酶解片段：磷酸基團(tuán)帶負(fù)電荷磷酸基團(tuán)帶負(fù)電荷酶解片段向陽極移動酶解片段向陽極移動電場驅(qū)動力和凝膠阻力電場驅(qū)動力和凝膠阻力 不同遷移率不同遷移率分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物酶切和電泳方法酶切和電泳方法1314瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠

7、電泳1. 瓊脂糖瓊脂糖2. 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠瓊脂糖在水里（或電泳液）中加熱到沸點(diǎn)后熔瓊脂糖在水里（或電泳液）中加熱到沸點(diǎn)后熔解，冷卻后又凝固成均勻的的膠體解，冷卻后又凝固成均勻的的膠體“胨胨”。是一種是一種線性多糖聚合物線性多糖聚合物，從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中，從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來。提取而來。瓊脂糖的濃度決定凝膠的空隙（密度）。瓊脂糖的濃度決定凝膠的空隙（密度）。 濃度高濃度高空隙小空隙小15空隙小，分辨率高：空隙小，分辨率高： 小分子較易通過，而大分子難通過；小分子較易通過，而大分子難通過； 空隙大，分辨率低：空隙大，分辨率低： 大小分子幾乎以同等速率通過。大小分子幾乎以同等速率通過

8、。3. 瓊脂糖凝膠的分辨力瓊脂糖凝膠的分辨力空隙大小決定其分辨分子大小的能力?？障洞笮Q定其分辨分子大小的能力。16174.電泳緩沖液電泳緩沖液TAE：乙酸鹽緩沖液、：乙酸鹽緩沖液、TBE：硼酸鹽緩沖液、：硼酸鹽緩沖液、TPE：磷酸鹽緩沖液：磷酸鹽緩沖液18v安裝膠槽安裝膠槽v熔膠熔膠 量取適量緩沖液，按所需濃度稱取量取適量緩沖液，按所需濃度稱取agarose瓊脂糖，在瓊脂糖，在微波爐或電爐上加熱至全熔。微波爐或電爐上加熱至全熔。v制備凝膠制備凝膠 等凝膠溫度降至大約等凝膠溫度降至大約5060以下時(shí)，加入以下時(shí)，加入1 mg/L溴溴化乙錠（化乙錠（EB）至終濃度為）至終濃度為0.5ug/mL

9、；搖勻并輕快地；搖勻并輕快地倒入水平板中，并除掉氣泡。倒入水平板中，并除掉氣泡。亦可不加入亦可不加入EB，待電，待電泳后浸泡染色。泳后浸泡染色。5.實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟19v凝固后，將梳子輕輕拔出凝固后，將梳子輕輕拔出 凝膠放入相同電泳緩沖液的電泳槽中，使電泳緩沖液凝膠放入相同電泳緩沖液的電泳槽中，使電泳緩沖液比凝膠略高比凝膠略高v點(diǎn)樣點(diǎn)樣 在核酸樣品中加入適量上樣在核酸樣品中加入適量上樣Buffer，混均后點(diǎn)樣，混均后點(diǎn)樣v電泳電泳 蓋好電泳槽蓋子，選擇適當(dāng)?shù)碾娪倦妷弘娪旧w好電泳槽蓋子，選擇適當(dāng)?shù)碾娪倦妷弘娪緑成像成像 凝膠成像儀成像凝膠成像儀成像20凝膠板凝膠板 22UVP全自動凝膠成像分析系

10、統(tǒng)全自動凝膠成像分析系統(tǒng)23OMEGA8-LOGO全自全自動凝膠成像分析系統(tǒng)動凝膠成像分析系統(tǒng)24聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳v過硫酸銨過硫酸銨（AP）為催化劑）為催化劑，以四甲基乙二胺（，以四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑）為加速劑。在聚合過程中，。在聚合過程中，TEMED催催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基，后者引發(fā)化過硫酸銨產(chǎn)生自由基，后者引發(fā)丙烯酰胺單體丙烯酰胺單體（Acr）聚合，同時(shí)聚合，同時(shí)甲叉雙丙烯酰胺（甲叉雙丙烯酰胺（Bis）與丙與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生甲叉鍵交聯(lián)，從而形成三維網(wǎng)狀烯酰胺鏈間產(chǎn)生甲叉鍵交聯(lián)，從而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。網(wǎng)格孔徑的平均直徑?jīng)Q定于丙烯酰胺和雙結(jié)構(gòu)。網(wǎng)格孔徑的平均直

11、徑?jīng)Q定于丙烯酰胺和雙功能交聯(lián)劑的濃度。功能交聯(lián)劑的濃度。25v毒性毒性 聚丙烯酰胺無毒聚丙烯酰胺無毒 AP，對黏膜和上呼吸道組織刺激性和腐蝕性、眼睛，對黏膜和上呼吸道組織刺激性和腐蝕性、眼睛和皮膚有強(qiáng)烈刺激和皮膚有強(qiáng)烈刺激 TEMED，強(qiáng)神經(jīng)毒性，操作快速，密封存放，強(qiáng)神經(jīng)毒性，操作快速，密封存放 Acr，劇毒物質(zhì)，神經(jīng)毒性，生殖、發(fā)育毒性及致突，劇毒物質(zhì)，神經(jīng)毒性，生殖、發(fā)育毒性及致突變性；累積毒性，不容易排毒變性；累積毒性，不容易排毒 Bis，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，刺激眼睛、皮膚和粘膜，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，刺激眼睛、皮膚和粘膜26優(yōu)點(diǎn)是比瓊脂糖凝膠的優(yōu)點(diǎn)是比瓊脂糖凝膠的分辨率高的多分辨率高的多。

12、聚丙烯酰胺凝膠濃度（聚丙烯酰胺凝膠濃度（%）分離分離DNA片斷大?。ㄆ瑪啻笮。╞p）4.0 10.0 20.01000100 50025 501聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳瓊脂糖的濃度（瓊脂糖的濃度（%）分離分離DNA片斷大?。ㄆ瑪啻笮。╞p）0.3 0.7 1.4500001000 200001000 600030027v 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 用于雙鏈用于雙鏈DNA片段的分離純化、蛋白質(zhì)電泳片段的分離純化、蛋白質(zhì)電泳 遷移率受堿基組成和序列影響、與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及荷遷移率受堿基組成和序列影響、與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及荷質(zhì)比有關(guān)質(zhì)比有關(guān)v變性聚丙烯酰胺凝膠電泳變性聚

13、丙烯酰胺凝膠電泳 用于單鏈用于單鏈DNA片段的分離或純化、蛋白質(zhì)電泳片段的分離或純化、蛋白質(zhì)電泳 遷移率與堿基組成及序列完全無關(guān)、與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)遷移率與堿基組成及序列完全無關(guān)、與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及荷質(zhì)比無關(guān)及荷質(zhì)比無關(guān)28v垂直板電泳裝置垂直板電泳裝置2930SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）十二烷基磺酸鈉十二烷基磺酸鈉(SDS)和少量巰基乙醇和少量巰基乙醇蛋白質(zhì)中的多肽鏈處于伸展?fàn)顟B(tài)蛋白質(zhì)中的多肽鏈處于伸展?fàn)顟B(tài)形成形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合體蛋白質(zhì)復(fù)合體具有相同的荷質(zhì)比具有相同的荷質(zhì)比具有相同的構(gòu)象具有相同的構(gòu)象蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)電泳速度由質(zhì)量決定電泳速度由質(zhì)量決定原理原理3

14、1原態(tài)蛋白質(zhì)原態(tài)蛋白質(zhì)磺酸基磺酸基 極性親水極性親水烷基烷基 親油（蛋白質(zhì)疏水區(qū)）親油（蛋白質(zhì)疏水區(qū)）32凝膠染色方案凝膠染色方案Ethidium bromide （EB）v核酸染色方案核酸染色方案1. EB染色染色 溴化乙錠溴化乙錠:中等毒性物質(zhì)中等毒性物質(zhì) 毒性：強(qiáng)誘變劑、致突變性毒性：強(qiáng)誘變劑、致突變性 光敏感性：紫外、可見光光敏感性：紫外、可見光 熱敏感性：熱揮發(fā)熱敏感性：熱揮發(fā)33vEB是扁平分子，能是扁平分子，能插入插入DNA堿基之間堿基之間，但不與，但不與瓊脂糖結(jié)合。瓊脂糖結(jié)合。 EB在紫外光照射下能發(fā)出在紫外光照射下能發(fā)出紅色熒紅色熒光光，EB-DNA復(fù)合物的熒光產(chǎn)率比沒有結(jié)合

15、復(fù)合物的熒光產(chǎn)率比沒有結(jié)合DNA的染料高出的染料高出20-30倍，因此可顯示倍，因此可顯示DNA泳帶泳帶在凝膠中所處的位置。在凝膠中所處的位置。 熒光強(qiáng)度與熒光強(qiáng)度與DNA含量成含量成正比。正比。34v在在EB存在的情況下，線存在的情況下，線狀狀DNA的電泳遷移率約的電泳遷移率約降低降低15%。當(dāng)需要知道核。當(dāng)需要知道核酸片段準(zhǔn)確大小時(shí)，應(yīng)在酸片段準(zhǔn)確大小時(shí)，應(yīng)在無無EB情況下電泳，結(jié)束情況下電泳，結(jié)束后后EB染色。染色。35vEB替代物替代物 Goldview：宣稱無毒、不靈敏、影響回收、熒光易淬滅：宣稱無毒、不靈敏、影響回收、熒光易淬滅（吖啶橙？）（吖啶橙？） GelRed/GelGree

16、n：低毒，高效，價(jià)格昂貴：低毒，高效，價(jià)格昂貴 花青素類染料，如花青素類染料，如gene finder、SYBR Green：不穩(wěn)定，：不穩(wěn)定，易降解易降解 36v銀染色液中的銀離子（銀染色液中的銀離子（Ag+）與）與核酸核酸形成穩(wěn)定的形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛使復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛使Ag+還原成銀顆還原成銀顆粒，把核酸電泳的條帶染成黑褐色粒，把核酸電泳的條帶染成黑褐色v銀染法主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色，也銀染法主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色，也可以用于瓊脂糖凝膠染色，其可以用于瓊脂糖凝膠染色，其靈敏度比靈敏度比EB高高200倍，但銀染后，倍，但銀染后，DNA不宜回收不宜回

17、收2. 銀染銀染3738v蛋白質(zhì)染色方案蛋白質(zhì)染色方案1.考馬斯亮藍(lán)染色法考馬斯亮藍(lán)染色法常用的考馬斯亮藍(lán)有常用的考馬斯亮藍(lán)有G250和和R250兩種。兩種。凝膠染色使用考馬斯亮藍(lán)凝膠染色使用考馬斯亮藍(lán)R250。染料可以和蛋白結(jié)合，。染料可以和蛋白結(jié)合，使蛋白染色，與蛋白質(zhì)反應(yīng)雖然比較緩慢，但是可以被使蛋白染色，與蛋白質(zhì)反應(yīng)雖然比較緩慢，但是可以被洗脫下去，因此用來對電泳條帶染色。洗脫下去，因此用來對電泳條帶染色。 考馬斯亮藍(lán)染色可以達(dá)到考馬斯亮藍(lán)染色可以達(dá)到0.20.5 g（200500 ng），最），最低可檢出低可檢出0.1 g蛋白蛋白考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)G250主要用于蛋白質(zhì)含量測定主要用于蛋白質(zhì)含量測定39402.銀染色法銀染色法銀染的方法種類很多，目前有文獻(xiàn)報(bào)道的就有銀染的方法種類很多，目前有文獻(xiàn)報(bào)道的就有 100 多多種。但是其準(zhǔn)確的染色機(jī)制還不是特別的清楚。大致種。但是其準(zhǔn)確的染色機(jī)制還不是特別的清楚。大致的原理是銀離子在堿性的原理是銀離子在堿性pH 環(huán)境下被還原成金屬銀，環(huán)境下被還原成金屬銀，沉淀在蛋白質(zhì)的表面上而顯色。由于銀染的靈敏度很沉淀在蛋白質(zhì)的表面上而顯色。由于銀染的靈敏度很高，可染出膠上低于高，可染出膠上低于1 ng/蛋白質(zhì)點(diǎn)。蛋白質(zhì)點(diǎn)。4142v雙向電泳（雙向電泳（two dimens