乙肝病毒核酸檢測實驗操作流程

1、乙肝病毒核酸檢測乙肝病毒核酸檢測實驗操作流程實驗操作流程廣西臨床檢驗中心廣西臨床檢驗中心 唐唐 娟娟主要內(nèi)容HBV-DNA的檢測原理HBV-DNAHBV-DNA操作流程操作流程 HBV-DNA檢測結(jié)果分析臨床意義DNA 提取PCR 擴增標(biāo)本采集檢測原理HBV ： 用一對乙型肝炎病毒特性引物（Primer）和一條乙型肝炎病毒特異性熒光探針，配以PCR反應(yīng)液、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、四種脫氧核苷酸單體（dNTPs）等成分，用PCR體外擴增法定量檢測乙型肝炎病毒DNA原理圖 每產(chǎn)生一條DNA鏈，就切斷一條探針 每切斷一條探針，就產(chǎn)生一個熒光信號 信號強度與結(jié)合探針的DNA分子數(shù)成正比操作流程一

2、、標(biāo)本采集一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2毫升，注入無菌的干燥玻璃管室溫（2225C）放置3060 分鐘血標(biāo)本使用水平離心機，4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘吸取上層血清吸取上層血清，轉(zhuǎn)移至1.5ml滅菌離心管 血清的采集血漿的采集用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2毫升，注入含EDTAEDTA或枸櫞酸鈉或枸櫞酸鈉抗凝劑的試管立即輕輕顛倒玻璃管混合510次，使抗凝劑與靜脈血充分混勻510分鐘后即可分離出血漿，轉(zhuǎn)移至1.5ml滅菌離心管注意事項盡量吸取血清的上層液，有纖維蛋白的標(biāo)本應(yīng)離心去除脂類渾濁標(biāo)本拒收（離心4000rpm，5min）血清血清不能使用肝素抗凝因為對PCR擴增有抑制作用，且很難在核酸

3、提取過程中完全去除血漿二.HBV-DNA的提取打開打開HBV-DNA試劑盒試劑盒取出取出DNA濃縮液、濃縮液、 DNA提取液提取液（置室溫融解，充分混勻）（置室溫融解，充分混勻）取已滅菌的取已滅菌的1.5ml離心管并按樣本唯一編號離心管并按樣本唯一編號加入加入DNA濃縮液和待測樣本各濃縮液和待測樣本各100ul（振蕩混勻）（振蕩混勻）12000rpm，離心，離心10min去上清，沉淀中加入去上清，沉淀中加入20ulDNA提取液提取液 （振蕩混勻）（振蕩混勻） （陰、陽性質(zhì)控品處理方法：各取（陰、陽性質(zhì)控品處理方法：各取50ul，分別加入，分別加入DNA提取液各提取液各50ul）100恒溫干浴恒

4、溫干浴10min12000rpm離心離心5min注意事項1.加入等體積的濃縮液后請用震蕩器劇烈震蕩混勻。不能用移液器混勻2.標(biāo)本12000rpm離心時一定要統(tǒng)一離心管擺放方向。離心后應(yīng)沿著沉淀存在的對側(cè)緩緩吸去上清，槍頭貼管壁順著液面下移，防止帶走不可見的沉淀物。如沉淀不明顯可以保留少量液體，建議將移液器量程調(diào)至190ul一次性吸取。注意事項3.濃縮離心后若出現(xiàn)有“絮狀懸浮物”，去上清時應(yīng)一并把“絮狀懸浮物”吸除，不影響實驗結(jié)果。如不吸取絮狀懸浮物會導(dǎo)致實驗結(jié)果偏低。4.加入20ul的DNA提取液（DNA提取液用前充分融解混勻),并用震蕩器劇烈震蕩混勻20秒后,瞬時離心。5.裂解溫度要確保有1

5、001，裂解時間10min1三三.PCR .PCR 擴增步驟擴增步驟取上清液取上清液2ul2ul點樣點樣8000rpm8000rpm離心數(shù)秒離心數(shù)秒按順序放進(jìn)擴增儀微孔中按順序放進(jìn)擴增儀微孔中編輯軟件，設(shè)置循環(huán)條件編輯軟件，設(shè)置循環(huán)條件保存文件，運行保存文件，運行 注意：吸取上清液中上層注意：吸取上清液中上層2ul2ul進(jìn)行加樣，進(jìn)行加樣，不要吸取到沉淀。不要吸取到沉淀。循環(huán)條件循環(huán)條件循環(huán)次數(shù)、溫度循環(huán)次數(shù)、溫度93 2分鐘 93 45秒55 60秒10個循環(huán)93 30秒55 45秒30個循環(huán)結(jié)果分析1.2.結(jié)果讀取3.3.結(jié)果報告 結(jié)果的報告必須簡單清楚 定量測定則必須報告量的多少 1、結(jié)果高于測定方法線性范圍上限，可報告多少；也可對樣本稀釋后再測，結(jié)果乘以稀釋倍數(shù) 2、結(jié)果低于方法的測定范圍下限，則報告多少即可，不能報告不能報告“0”0”或陰性或陰性臨床意義1、診斷早期乙型肝炎，提高HBV檢測陽性率。2、判斷HBV的傳染性及病毒復(fù)制情