抗流感病毒單克隆抗體的制備與鑒定

1、抗流感病毒單克隆抗體的制備與鑒定 1.文獻綜述2.單抗的制備與鑒定 目的意義 材料方法 結(jié)果與分析3.討論1.文獻綜述 1.1 流感的病原學 流感病毒在病毒分類學上屬正粘病毒科A型、B型流感病毒屬和C型流感病毒屬A型流感病毒亞型HA: 16NA: 10高致病性禽流感 (HPAI) -H5 and H7 1.2 流感病毒檢測技術(shù) 1.2.1 病毒的分離鑒定 1.2.2 血清學診斷技術(shù) 血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗 瓊脂凝膠擴散試驗（AGID） 神經(jīng)氨酸酶抑制試驗（NIT） 病毒中和試驗（NT） 免疫熒光技術(shù)（IFT） 酶聯(lián)免疫吸附試驗 （ELISA）1.2.3 分子生物學診斷技術(shù) PCR

2、診斷技術(shù) 實時熒光定量PCR NASBA法 核酸探針技術(shù) M 檢測法 基因芯片技術(shù) 2 單抗的制備與鑒定2.1 研究目的與意義 流感是第一個實行全球監(jiān)控的傳染性疾病。對人及禽、畜的危害十分巨大。除禽流感外，常見的還有人流感、馬流感和豬流感等。 動物流感尤其是禽流感與人類流感和人類健康非常密切，禽流感被認為是人流感病毒的保存和發(fā)生變異的新基因的來源，這種聯(lián)系是通過中間宿主來實現(xiàn)的。豬是人源、禽源和豬源流感病毒的唯一共同易感宿主，它能將流感病毒傳播給人。 2.1 研究目的與意義 流感的監(jiān)控工作是預(yù)防與控制該病的一個重要環(huán)節(jié)。國內(nèi)對流感病毒的臨床診斷主要是對抗體的檢測。 病毒抗原檢測方面，雖然病毒的

3、分離鑒定是診斷禽流感的一種可靠方法，但病毒的分離鑒定、動物接種試驗操作復(fù)雜，周期長，難以滿足對高致病性禽流感快速診斷的需要。聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）、核酸探針等方法則需要較好的試驗條件和較高的人員素質(zhì)，目前還難以廣泛推廣 。 流感病毒的HA蛋白具有亞型特異性，但NP蛋白卻相對保守。 利用NP蛋白和HA蛋白分別有望建立一種所有亞型禽流感病毒的檢測方法和診斷流感病毒亞型的方法。而單克隆抗體由于由于特異性以及高度親和力，用于病毒學診斷時相較于多抗有許多優(yōu)點。 本研究利用雜交瘤技術(shù)獲得了抗禽流感病毒NP蛋白和H3亞型禽流感病毒HA蛋白的單抗，為對禽流感病毒的進一步研究和建立針對所有亞型禽流感病毒和H3

4、亞型的檢測方法奠定基礎(chǔ)。 2.1 研究目的與意義2.2 材料方法2.2.1 細胞、病毒與動物 SP2/0骨髓瘤細胞系由本實驗室保存。 流感病毒H9N2、H1N1由本實驗室分離鑒定，保存。H3N8由哈爾濱 獸醫(yī)研究所提供。新城疫病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)、傳染性法氏囊病毒(IBDV)、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒（EDS-76）、禽腺病毒1型（APMV-1）購自北京梅里亞維通公司。 SPF雞胚購自北京梅里亞維通公司。 BALB/C小鼠購自湖北省疾病控制中心實驗動物中心。2.2.2 培養(yǎng)基及主要試劑lRPMI-1640、HAT、HT、弗氏完全與不完全佐劑：G

5、IBCOL公司。l新生小牛血清（超級）：四季青生物工程公司。l精制小牛血清：Hyclone公司。l融合劑50PEG（P7181）、羊抗鼠IgG-HRP、 8氮鳥嘌呤：SIGMA公司。l羊抗鼠IgG1、G2aHRP ：SBA公司。l青、鏈霉素：華北制藥廠。 2.3.3 方法l 病毒粒子的大量制備與純化 l 免疫原的制備l 動物免疫l SP2/0骨髓瘤細胞的活化與制備l 免疫脾細胞的制備 l 細胞融合 l雜交瘤細胞上清檢測 l雜交瘤細胞的克隆化（有限稀釋法）l雜交瘤細胞染色體數(shù)的檢測 l單克隆抗體的生產(chǎn)、純化和效價測定 l單克隆抗體亞類鑒定l單抗特異性鑒定l間接免疫熒光法檢測單克隆抗體 2.3.3

6、 方法2.3 結(jié)果與分析 2.3.1 抗NP蛋白雜交瘤細胞的篩選 用間接ELISA方法進行篩選。使用A法免疫制備了1株抗NP蛋白的單抗1D10，使用B法獲得了4株單抗（4F4、1C3、1G11、1C2），使用C法獲得了1株單抗(2E7)。 各株單抗用間接ELISA方法的檢測結(jié)果如表21所示，其中1D10和1G11效價最高，用于以下的試驗?？箍筃P雜交瘤細胞上清雜交瘤細胞上清ELISA檢測結(jié)果檢測結(jié)果(OD630)lAntigens 1D104F41C31G111C22E7H1N10.8310.4080.2760.5980.1980.211H3N81.0860.5670.4011.1590.51

7、30.456H9N20.9750.4190.3620.6870.3670.386陰性尿囊液0.1320.0400.0520.0530.095NNP1.1821.0370.4641.0110.5210.811BL21NNNNN0.057注：N表示沒有檢測； 所建立的ELISA臨界值均為0.2。 2.3.2 抗HA 蛋白雜交瘤細胞的篩選 通過血凝抑制試驗進行篩選。 經(jīng)2 次檢測、3 次克隆后獲得3株穩(wěn)定分泌抗HA蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞，連續(xù)培養(yǎng)數(shù)月，細胞生長良好，反復(fù)凍存復(fù)蘇后，仍保持穩(wěn)定的抗體分泌能力，分別命名為2B7、1C11、4G7。2.3.3 雜交瘤細胞染色體數(shù)的檢測 雜交瘤細胞染色體

8、計數(shù)結(jié)果見表22。2.3.4 單克隆抗體亞類鑒定 以羊抗鼠IgG、G1、G2a-HRP 為二抗用間接ELISA 鑒定了單克隆抗體的亞類。 結(jié)果見表22。表表22 單克隆抗體亞型及相應(yīng)雜交瘤細胞單克隆抗體亞型及相應(yīng)雜交瘤細胞染色體計數(shù)染色體計數(shù)AntigenCells Antibody isotypes The number of chromosomes Splenocyte 40 SP2/0 70 Hybridoma NP 1D101G11G2aG1 94(8997)83(8186) HA2B71C114G7 G2aG1G2a 90(8294)98(92103)87(7987) 2.3.5 單

9、克隆抗體的生產(chǎn)和效價測定單克隆抗體的生產(chǎn)和效價測定表表23 抗抗NP蛋白雜交瘤上清和腹水的蛋白雜交瘤上清和腹水的ELISA效價測定結(jié)果效價測定結(jié)果(OD630) 1D10supernatant Ascite fluids 1G11supernatant Ascite fluidsH1N1200213100200212100H3N8400212100400211100H9N2400214100400213100NP200212100200210100表表24 抗抗H3 HA蛋白雜交瘤上清和腹蛋白雜交瘤上清和腹水的效價測定結(jié)果水的效價測定結(jié)果2B71C114G7ELISAsupernatant32

10、08080Ascite fluids2111002810027100HIsupernatant242121Ascite fluids21228272.3.6 單抗特異性鑒定單抗特異性鑒定 將抗NP單抗1D10、1G11分別用雞新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、傳染性喉氣管炎病毒包被的酶標板作間接ELISA檢測，檢測結(jié)果全部為陰性，說明所制備的單抗與這些病毒均無交叉反應(yīng)。 抗H3 HA單抗2B7、1C11、4G7分別用H1、H3、H5、H9亞型禽流感病毒及雞新城疫病毒作血凝抑制試驗，檢測結(jié)果三種單抗只對H3亞型流感病毒有血凝抑制效價，說明說明所制備的單抗與這些病毒均無交叉反應(yīng)。

11、 2.3.7 間接免疫熒光 分別以一定濃度H1、H3、H9亞型流感病毒感染MDCK細胞，固定細胞后進行熒光染色檢測腹水?？箍筃P單抗與單抗與H3N8感染感染MDCK的的IFA檢測檢測 F Positive controlG SP2/0H MDCK cells controlA 1G11B 1D10抗抗H3 HA單抗與單抗與H3N8感染感染MDCK的的IFA檢測檢測 F Positive controlG SP2/0H MDCK cells controlE 4G7D 1C11C 2B7抗抗NP單抗與單抗與AIV H9亞型感染亞型感染MDCK的的IFA檢測檢測 A 1G11B 1D10F Pos

12、itive controlG SP2/0H MDCK cells control抗抗H3 HA單抗與單抗與AIV H9亞型感染亞型感染MDCK的的IFA檢測檢測 F Positive controlG SP2/0H MDCK cells controlC 2B7D 1C11E 4G7F Positive controlG SP2/0H MDCK cells controlA 1G11B 1D10抗抗NP單抗與單抗與 H1N1亞型感染亞型感染MDCK的的IFA檢測檢測G SP2/0F Positive controlH MDCK cells controlC 2B7D 1C11E 4G7抗抗H3

13、HA單抗與單抗與H1N1亞型感染亞型感染MDCK的的IFA檢測檢測3 討論討論3.1 單抗制備中需注意的問題l動物的免疫 l細胞融合 l雜交瘤細胞的篩選 l雜交瘤細胞的克隆 l雜交瘤細胞的凍存和復(fù)蘇 l污染的預(yù)防和排除 3.2 關(guān)于抗NP蛋白單抗 由于禽流感病毒NP蛋白相對保守，因此可以使用抗NP蛋白的抗體來檢測所有亞型的禽流感病毒。 NP蛋白并非完全保守，因此要保證所制備的單抗是針對其保守性抗原位點的。 3.2 關(guān)于抗NP蛋白單抗 為了證實所產(chǎn)生的單克隆抗體確實是針對病毒NP蛋白保守性位點的，采用了多株禽流感病毒和表達的NP蛋白正篩選、陰性尿囊液及破碎的菌體負篩選的方法，篩選到了6株針對禽流

14、感病毒NP蛋白保守性位點的單抗，其中2株是高效價的單抗。 本實驗所制備的2株高效價的抗NP蛋白的單抗用雞新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、傳染性喉氣管炎病毒檢測，均無交叉反應(yīng)，具有很好的特異性。 3.2 關(guān)于抗NP蛋白單抗 本研究所獲得的針對禽流感病毒NP蛋白的單克隆抗體為禽流感的診斷，甚至是A型流感病毒的診斷提供了高質(zhì)量的試劑。 本實驗室已在此基礎(chǔ)上進行了雙夾心ELISA方法檢測不同亞型的禽流感病毒的研究，并已經(jīng)研制出了相關(guān)試劑盒應(yīng)用于臨床檢測，為實現(xiàn)實驗室診斷的標準化、開展流行病學調(diào)查研究奠定了很好的基礎(chǔ) 。 3.2 關(guān)于抗NP蛋白單抗3.3 關(guān)于抗關(guān)于抗H3N8 HA蛋白單抗蛋白單抗 本研究所制備的3株高效價的抗HA蛋白的單抗用H1、H3、H5、H9亞型禽流感病毒及雞新城疫病毒作血凝抑制試驗，檢測結(jié)果三種單抗只對H3亞型禽流感病毒有血凝抑制效價 說明所制備的單抗與這些病毒均無交叉反應(yīng)，具有很好的特異性。 HA是流感病毒的主要表面抗原，一般情況下，新分離的毒株鑒定，一般要做HA的亞型鑒定，故研究針