現(xiàn)代生化藥學(xué)

1、. 現(xiàn)代生化藥學(xué)復(fù)習(xí)提要  2009年12月使用  第一章 PCR1 PCR的英文全稱是什么? Polymerase Chain Reaction2 PCR是誰發(fā)明的？Kary Mullis3 PCR的基本原理是什么？PCR的基本工作原理，是以擬擴(kuò)增的DNA片段為模板，以一對分別與模板DNA互補(bǔ)的寡核苷酸為引物，在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)半保留復(fù)制的機(jī)制沿著模板DNA鏈延伸，直至新的DNA合成。不斷重復(fù)這一過程，則可使目的DNA片段得到擴(kuò)增。4 PCR反應(yīng)的產(chǎn)物中一般會生成幾種長度不同的產(chǎn)物？反應(yīng)結(jié)束時他們的含量分別是怎樣的？PCR反應(yīng)中一般會產(chǎn)生2種不同長度的產(chǎn)物：一種

2、是預(yù)期長度的產(chǎn)物，一種是比預(yù)期長度長得多的產(chǎn)物；前者以指數(shù)級數(shù)增加（2n），后者以幾何級數(shù)增加（2n）。因此后者在總產(chǎn)物中所占比重很小，可忽略不計(jì)。5 一般PCR反應(yīng)中包括幾種基本成份？它們的功能分別是什么？模板：待擴(kuò)增的DNA或RNA；引物：與靶DNA的3端和5端特異性結(jié)合的寡核苷酸片段，是決定PCR特異性的關(guān)鍵。只有每條引物都與靶DNA特異性結(jié)合，才能保證其特異性，引物越長，特異性越高。兩段引物間的距離決定了擴(kuò)增片斷的長度；兩引物的5端決定了擴(kuò)增產(chǎn)物的5端位置。說明引物決定了擴(kuò)增片斷的長度、位置和結(jié)果。6 PCR反應(yīng)對模板有什么要求（種類及質(zhì)量要求等）？基因組DNA、噬菌體DNA、質(zhì)粒DN

3、A、cDNA、mRNA、預(yù)先擴(kuò)增的DNA均可作為模板。PCR反應(yīng)對模板質(zhì)量要求不是很高，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法制備的DNA可以作為模板，但是模板中絕對不能含有蛋白酶、核酸酶、Taq酶抑制劑和任何可以結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)；雖然片段長短不是影響PCR效率的關(guān)鍵因素，短片段模板PCR效率更高；為保證反應(yīng)的特異性，應(yīng)使用ng級的克隆DNA、g級的單拷貝染色體DNA、或104拷貝的待擴(kuò)增片段。7 什么叫PCR的引物？什么叫特異性引物？什么叫簡并性引物？引物是與靶DNA的3端和5端特異性結(jié)合的寡核苷酸片段，是決定PCR特異性的關(guān)鍵。只有每條引物都與靶DNA特異性結(jié)合，才能保證其特異性，引物越長，特異性越高。

4、8 引物設(shè)計(jì)的基本原則有哪些？a. 引物長度一般在2024bp：這樣長度的引物保證了不易形成雜合體；b. （G+C）%：兩段引物的此數(shù)值應(yīng)相近；在已知模板序列的時候應(yīng)與模板的相近。c. 引物本身不能形成明顯的次級結(jié)構(gòu)，如發(fā)卡結(jié)構(gòu)；d. 兩引物不可配對；e. 引物3端為DNA聚合酶連上寡核苷酸的地方，因此應(yīng)嚴(yán)格、準(zhǔn)確地配對。9 PCR中使用的DNA聚合酶有哪幾種，各具有哪些特點(diǎn)？a. Klenow片段：為DNA聚合酶的片段，具有聚合酶活性和35外切酶活性；b. Taq酶：耐熱DNA聚合酶，可耐受9395攝氏度，是PCR普及的關(guān)鍵。它避免了不斷補(bǔ)加DNA聚合酶的繁瑣操作，提高了退火和延伸的溫度，減

5、少了非特異性產(chǎn)物和DNA二級結(jié)構(gòu)的影響，提高了PCR的特異性、敏感度和產(chǎn)量。它沒有35外切酶活性，無校對功能。c. Stoffel片段：第二代耐熱DNA聚合酶，將97.5攝氏度的半衰期提高到20min，而Taq酶只有5min；對復(fù)合PCR（2個或以上模板位點(diǎn)的PCR）更有效；d. Vent酶：耐受100攝氏度以上高溫達(dá)2h；具有校對功能。e. RTth 逆轉(zhuǎn)錄酶：有依賴于RNA的耐熱DNA聚合酶活性和依賴于DNA的耐熱DNA聚合酶活性，這兩種活性分別依賴于Mn2+和Mg2+。10 PCR反應(yīng)中對于加入的dNTP有什么要求？dNTP應(yīng)具有一定濃度：濃度過高會抑制Taq酶活性，較低濃度可降低錯誤摻

6、入，濃度過高會導(dǎo)致錯誤摻入，濃度過低會導(dǎo)致產(chǎn)量過低；4種dNTP應(yīng)有一樣的濃度，否則會誘導(dǎo)聚合酶錯誤摻入而降低產(chǎn)率、提前終止反應(yīng)；不能反復(fù)凍融，否則會降解。11 PCR反應(yīng)中加入的二價陽離子有什么功能？常用的是什么離子？緩沖液中二價陽離子的存在至關(guān)重要，因?yàn)槟蜔酓NA聚合酶需要游離的二價陽離子作為輔助離子，它影響著PCR的產(chǎn)量和特異性。常用Mn2+和Mg2+。12 PCR反應(yīng)一般分為幾個步驟？各步驟有什么特點(diǎn)？A變性：雙鏈DNA變成單鏈DNA。變性溫度的高低由G、C含量決定；變性時間由DNA鏈長度決定。常規(guī)PCR變性條件為9495度45s。B 退火：指單鏈DNA與引物特異性結(jié)合。退火溫度太高則

7、效率低，退火溫度太低則出現(xiàn)非特異性復(fù)性。C 延伸：寡核苷酸的延長，一般在耐熱DNA聚合酶的最適溫度下進(jìn)行。對于Taq酶，為7278度。13 什么叫PCR的反應(yīng)平臺？形成的原因可能是什么？PCR反應(yīng)不是無窮的進(jìn)行，到了PCR后期，當(dāng)產(chǎn)物達(dá)0.31pmol/L時，產(chǎn)物不是呈指數(shù)增長而是進(jìn)入平臺期，曲線由指數(shù)曲線變?yōu)槠教?。形成原因：由于引物和dNTP的減少，Taq酶失活；或由于底物過剩、非特異性產(chǎn)物的競爭、變性時解鏈不完全、退貨時產(chǎn)物單鏈自行締合、最終產(chǎn)物的阻化作用。14 提高PCR反應(yīng)的特異性一般可以使用哪幾種方法？a. 引物設(shè)計(jì)：引物長度，G+C含量，退火溫度，引物濃度與純度，穩(wěn)定性；b. 使用

8、熱啟動：在變性完成之后再加入DNA聚合酶，這樣可以提高特異性，因?yàn)镈NA聚合酶在低溫時也有活性。c. 鎂離子濃度：不同的模板和引物有不同的鎂離子濃度，應(yīng)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探索；較高的鎂離子濃度會提高產(chǎn)量，同時降低特異性；dNTP濃度較高時應(yīng)適當(dāng)提高鎂離子濃度。d. 促進(jìn)PCR的添加劑：影響DNA溶解溫度的添加劑可提高特異性和產(chǎn)率；e. 使用巢式PCR：降低擴(kuò)增多個靶位點(diǎn)的可能性，提高特異性15 常用的促進(jìn)PCR特異性的試劑有哪些？甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜堿，PCRx Enhancer Solution。16 什么是熱啟動？在模板DNA完全變性后再加入DNA聚合酶（或使DNA聚合酶有活性）的方法

9、，可減少低溫下DNA聚合酶活性造成的非特異性擴(kuò)增。17 RACE的全稱是什么？Rapid Amplification of cDNA Ending（cDNA末端的快速擴(kuò)增）18 什么叫定量PCR？利用PCR反應(yīng)來測定樣品中的DNA或RNA的原始拷貝數(shù)量。利用每一個循環(huán)都能測得PCR產(chǎn)物的增生來獲得反應(yīng)飽和前的資料。19 為什么PCR中對產(chǎn)物進(jìn)行終點(diǎn)檢定量不準(zhǔn)確？隨著PCR的進(jìn)行，反應(yīng)體系中的引物、dNTP，甚至模板都會供不應(yīng)求，導(dǎo)致PCR的效率下降，產(chǎn)物產(chǎn)生的越來越慢。直到Taq酶都被飽和后，反應(yīng)就進(jìn)入平臺期。在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，由于各種條件的相互影響，每個反應(yīng)進(jìn)入平臺期的時間不同，導(dǎo)致終產(chǎn)物濃度各

10、不相同。即使是重復(fù)實(shí)驗(yàn)，也不可能做到同時進(jìn)入平臺期。因此反應(yīng)終產(chǎn)物與原始拷貝數(shù)無線性關(guān)系，定量不準(zhǔn)確。20 什么是定量PCR的Ct值？Ct值是如何確定的?Cycle threshold（Ct）：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光達(dá)到閾值時的循環(huán)數(shù)，即在PCR中，熒光信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長的拐點(diǎn)處所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)。21 簡述Taqman探針技術(shù)的原理。TaqMan技術(shù)原理：除了一對特異性引物，TaqMan探針法增加一條和模版互補(bǔ)的基因特異性探針（通常2030bp），探針上5'端和3'端分別標(biāo)記了一個報(bào)告熒光基團(tuán)（供體）和一個淬滅熒光基團(tuán)（受體），在反應(yīng)初始（探針完整）時系統(tǒng)激發(fā)供體而產(chǎn)生的熒光

11、信號被臨近的淬滅基團(tuán)吸收，所以此時檢測不到供體熒光信號；而當(dāng)PCR過程中Taq DNA聚合酶擴(kuò)增到探針結(jié)合模版的位點(diǎn)時，其5'-3'核酸外切酶的活性（也就是切口平移）切割掉探針5'端的報(bào)告基團(tuán)游離的報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，打破能量的傳遞，激發(fā)報(bào)告基團(tuán)產(chǎn)生的熒光信號就可以被熒光檢測系統(tǒng)檢測到。這樣每擴(kuò)增一條DNA鏈，就對應(yīng)有一個游離的熒光分子（報(bào)告基團(tuán)）形成，保證了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，因此對熒光信號進(jìn)行檢測就可以實(shí)時監(jiān)控PCR的過程，準(zhǔn)確定量PCR的起始拷貝數(shù)>。但是實(shí)際上探針較長使得兩端基團(tuán)距離較遠(yuǎn)，會導(dǎo)致熒光淬滅不徹底，而且淬滅基團(tuán)也會產(chǎn)生不同

12、波長的熒光，都會使得本底偏高22 解釋下列各種PCR的基本原理： (1) RT-PCR  （Reverse Translation-PCR）將反轉(zhuǎn)錄與PCR結(jié)合的技術(shù)，以便利用mRNA擴(kuò)增得到cDNA。RNA的提?。河卯惲蚯杷犭?酚-氯仿提取細(xì)胞中的RNA；mRNA的提?。河H和層析法；RT：在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈，namely以oligo（dT）、隨機(jī)六聚寡核苷酸或基因特異序列為引物，與mRNA結(jié)合之后，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下延伸合成cDNA第一鏈；PCR：設(shè)計(jì)基因特異的上下游引物，其中上游引物與cDNA第一鏈復(fù)性后延伸合成cDNA第二鏈，再以cD

13、NA第一鏈和第二鏈為模板，用上下游引物進(jìn)行PCR。(2) 多重PCR  用于檢測多個基因的表達(dá)，且這些基因都與某一疾病的檢測、治療或預(yù)后有關(guān)。多重PCR與常規(guī)RT-PCR的不同點(diǎn)在于：在反轉(zhuǎn)錄過程，前者使用Oligo（dT）或隨機(jī)六聚寡核苷酸為引物，而不用基因特異性引物；在PCR過程，前者需要設(shè)計(jì)多對引物，以擴(kuò)增多個基因表達(dá)產(chǎn)物。(3) 3'-RACE A反轉(zhuǎn)錄獲得3末端第一鏈cDNA：3末端本身具有PolyA，可以與引物結(jié)合。引物也同樣具有oligo(dT)，但這種引物在5端有OP（Outer Primer）和IP（Inner Primer）的特殊結(jié)構(gòu)，便于為以后的兩輪PC

14、R提供引物；在3端加入一個錨定核苷酸，可以使反轉(zhuǎn)錄在緊接著PolyA的交界處進(jìn)行，這樣可以有效減少同聚物的產(chǎn)生。B第一鏈cDNA3端的擴(kuò)增：設(shè)計(jì)兩種引物GSOP和GSIP。由于cDNA已含有外源性O(shè)P和IP序列，故可以用來自目的基因的GSOP和來自錨定序列的外源性O(shè)P進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，用GSIP和IP進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，以此增強(qiáng)特異性。(4) 簡并PCR  一般PCR根據(jù)確定的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，簡并PCR一般用于已知氨基酸序列而不知道核苷酸序列的情況。根據(jù)氨基酸密碼子的簡并性，設(shè)計(jì)一個包含多個核苷酸序列的引物庫，以擴(kuò)增出未知序列的核苷酸。這些引物有很多相同堿基，但也有堿基不同，這樣保證了

15、和多種同源序列發(fā)生退火。(5) 不對稱PCR是一種用不對稱的引物進(jìn)行PCR的方法，分為引物濃度不對稱PCR和引物長度不對稱PCR。結(jié)果是產(chǎn)生大量的單鏈DNA，又避免了在檢測時要先出去剩余引物的操作。引物濃度不對稱PCR：兩引物的濃度不同，其中濃度低的為限制性引物，起決定性作用，只有當(dāng)限制性引物耗盡后才會開始大量產(chǎn)生ssDNA。常規(guī)熱不對稱PCR（常規(guī)引物長度不對稱PCR）：將限制性引物的退火溫度設(shè)計(jì)得比非限制性引物低至少10度。在剛開始的1015個循環(huán)中，退火溫度略低于限制性引物的退火溫度，產(chǎn)生雙鏈DNA，以耗盡限制性引物；之后的退火溫度便以非限制性引物的退火溫度為準(zhǔn)，大量產(chǎn)生單鏈DNA。交錯

16、式熱不對稱PCR(6) 競爭性PCR  首先將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后在擴(kuò)增體系中加入濃度已知的競爭性參考模板，這兩種模板都可以與引物競爭性結(jié)合，但產(chǎn)物可因大小不同或酶切位點(diǎn)不同而可以區(qū)分開。之后在凝膠電泳上測定兩種產(chǎn)物的濃度后即可推斷mRNA的初始濃度。(7)巢式PCR   由兩輪PCR和兩套引物組成。首先對靶基因進(jìn)行一次擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物提取后進(jìn)行第二次擴(kuò)增，此時的結(jié)果即為目的產(chǎn)物。這樣可以提高特異性和靈敏性。(8) 降落PCR(touch-down PCR)一般用于PCR溫度條件的摸索。退火溫度起始于高于計(jì)算值15度，之后每過一個循環(huán)，溫度降低12度。由

17、于正確和非正確的退火溫度造成的產(chǎn)量是指數(shù)級的，因此可以使正確產(chǎn)物得到累計(jì)。當(dāng)溫度降低到非特異性退火溫度時，就會發(fā)生非特異性結(jié)合，但此時的特異性結(jié)合產(chǎn)物已經(jīng)累計(jì)了一個幾何級數(shù)的優(yōu)勢，因此非特異性結(jié)合產(chǎn)物的量不會很多。第2章 放射性同位素知識和應(yīng)用1 什么叫“核衰變”？放射性同位素的原子核很不穩(wěn)定，會持續(xù)不斷的自發(fā)放出射線，直到變成另一種穩(wěn)定同位素。2 什么叫半衰期？特點(diǎn)是什么？放射性同位素的半衰期：一定數(shù)量的放射性同位素原子數(shù)目減少到原來一半時所需要的時間。半衰期越長，說明衰變的越慢；反之越快。半衰期是放射性同位素的特征參數(shù)，不同的放射性同位素有不同的半衰期。3 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用的幾種放射性

18、同位素有哪幾種？他們的半衰期分別是多少？4 什么叫放射源？用放射性物質(zhì)制成的，能產(chǎn)生輻射照射的物體。5 什么叫同位素示蹤法？有什么優(yōu)點(diǎn)？利用放射性核素作為示蹤劑對研究對象進(jìn)行標(biāo)記的微量分析方法。靈敏度高、方法簡便、定量定位準(zhǔn)確、符合生理?xiàng)l件。6 同位素示蹤法中使用的同位素是哪種同位素?7 什么叫同位素效應(yīng)？8 舉例說明同位素示蹤法在分子生物學(xué)核生物化學(xué)中的應(yīng)用。9 放射性測量的原理是什么？探測儀可以分為哪2類？放射性同位素發(fā)出的射線與物質(zhì)相互作用，會直接或間接產(chǎn)生電力和激發(fā)等效應(yīng)，以此探測放射性的存在、強(qiáng)度和放射性同位素的性質(zhì)。分為徑跡型和信號型。10 閃爍計(jì)數(shù)器的工作原理是什么？閃爍型探測器

19、由閃爍體-光電倍增管-放大器-分析器-定標(biāo)器組成。閃爍體吸收射線后發(fā)出光信號，被光電倍增管收到而發(fā)生光電效應(yīng)，轉(zhuǎn)化成電信號并逐級放大，最后被定標(biāo)器記錄下來。放射性同位素越多，發(fā)出的光信號越多，電信號也越多。11 什么叫閃爍體？一類能吸收能量，并在1微秒內(nèi)甚至更短將能量以光的形式發(fā)射出來的物質(zhì)。12 液體閃爍計(jì)數(shù)器和晶體閃爍計(jì)數(shù)器分別適合檢測什么樣的放射性線？液體閃爍計(jì)數(shù)器和晶體閃爍計(jì)數(shù)器分別適合檢測什么樣的放射性線？液體閃爍計(jì)數(shù)器適合檢測-ray和低能-ray；晶體閃爍計(jì)數(shù)器適合-ray。13 人體各種器官中，對輻射最為敏感的是什么器官?14 什么叫細(xì)胞的間期死亡？增殖死亡？細(xì)胞的間期死亡：細(xì)

20、胞受輻射照射后，不經(jīng)分裂，在幾小時內(nèi)死亡。兩類細(xì)胞發(fā)生間期死亡一類是不分裂或分裂能力有限的細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞和胸腺細(xì)胞；另一類是不分裂或可逆性分裂的細(xì)胞，如成熟神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞等。增殖死亡：細(xì)胞受輻射照射后，經(jīng)1個或幾個分裂周期后，因失去增值能力而死亡。主要是由于DNA分子損傷后錯誤修復(fù)和染色體畸變等原因造成有絲分裂障礙。15 什么叫外照射？內(nèi)照射？輻射的確定性效應(yīng)？隨機(jī)效應(yīng)？外照射：輻射源由體外照射人體。生物效應(yīng)強(qiáng)。如-ray、中子、X-ray。內(nèi)照射：放射性物質(zhì)通過某種途徑進(jìn)入人體，以其輻射能產(chǎn)生生物效應(yīng)者為內(nèi)照射。如ray。輻射的確定性效應(yīng)：輻射的嚴(yán)重程度與照射劑量的大小有關(guān)，效應(yīng)

21、的嚴(yán)重程度取決于細(xì)胞群中受損細(xì)胞的數(shù)量或百分率。如白細(xì)胞減少、皮膚紅斑脫毛、白內(nèi)障。隨機(jī)效應(yīng)：效應(yīng)的發(fā)生率與照射劑量的大小有關(guān)，這種效應(yīng)在個別細(xì)胞損傷時即可出現(xiàn)，無閾劑量。如誘發(fā)癌癥和遺傳效應(yīng)。16 放射防護(hù)的3原則是什么？放射實(shí)踐正當(dāng)化；放射防護(hù)最優(yōu)化；個人劑量限制。17 外照射防護(hù)的基本措施是什么？時間防護(hù)、距離防護(hù)、屏障防護(hù)。18 放射性的“三廢”是指哪三廢？放射性廢氣、廢液、固廢。19 外照射的，和伽馬射線應(yīng)該分別如何防護(hù)？20 醫(yī)院中使用的X光機(jī)中有沒有輻射源？為什么？ 沒有密封源。是由X線管發(fā)出，X線管由真空玻璃管中的陽極和陰極組成，其中陰極為鎢絲。 第3章 分

22、子雜交技術(shù)1 核酸分子雜交的分子基礎(chǔ)是什么？2 舉例說明哪些生物反應(yīng)是屬于探針靶反應(yīng)？3 核酸探針的種類有哪些？各有什么特點(diǎn)？4 探針標(biāo)記技術(shù)可以分為哪兩類？5 核酸探針常用的酶促標(biāo)記技術(shù)有哪幾種？6 缺口平移標(biāo)記技術(shù)的原理是什么？利用了什么酶的哪些？7 DNA快速末端標(biāo)記中使用的酶是什么酶？使用的常用同位素是什么？8 標(biāo)記DNA 5'末端時使用的酶是什么酶？使用的常用同位素是什么？與DNA快速末端標(biāo)記中使用的有什么不同？9 核酸的非放射性標(biāo)記技術(shù)可以分哪幾類？10 常用的非放射性標(biāo)記系統(tǒng)中，有哪幾種常用的非放射性物質(zhì)可用來標(biāo)記核酸分子？11 Souther雜交的過程一般分為哪幾步驟？

23、12 預(yù)雜交的作用是什么？13 核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化一般可以從哪幾個方面考慮？ 第4章 cDNA文庫1 什么叫基因組文庫？cDNA文庫？有什么區(qū)別？2 構(gòu)建一個理想的cDNA文庫需要考慮的因素有哪些？3 如何考察確定一個cDNA文庫的質(zhì)量？4 什么叫文庫的代表性？5 什么叫文庫的庫容量？有什么意義？6 常用來構(gòu)建文庫使用的載體系統(tǒng)有哪些？各有什么特點(diǎn)？7 構(gòu)建cDNA文庫的基本步驟有哪些？8 對cDNA文庫進(jìn)行篩選的策略有哪兩種？1.以一個已知的分子作為靶標(biāo),通過檢測在特定條件下文庫與靶標(biāo)發(fā)生相互作用的基因序列或其編碼的表達(dá)產(chǎn)物,從而分離出目的基因.這是篩選cDNA文庫最常用的策略

24、.前提是必須首先確定出一個可作為靶標(biāo)的分子.2.不需要附加任何先決條件,而是通過檢測在特定條件下來源于兩個文庫的基因編碼產(chǎn)物之間相互發(fā)生作用的情況,從而確定出這兩個文庫中所有可能在生理上發(fā)生相互作用的基因?qū)?描繪出某一特定類型細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出的基因之間發(fā)生的基因相互作用的聯(lián)絡(luò)圖.不僅有助于確定各種基因在細(xì)胞生命活動中的具體功能,還能研究功能基因組學(xué).9 使用核酸雜交方法篩選cDNA文庫時使用的探針有哪幾種？1.同源探針2.簡并性寡核苷酸探針3.cDNA探針10 對表達(dá)文庫進(jìn)行高通量的功能性篩選有哪幾種方法？1.噬菌體表面展示系統(tǒng)2.酵母雙雜交系統(tǒng)3.酵母單雜交系統(tǒng)11 噬菌體表面展示技術(shù)的原理是什

25、么？利用大腸桿菌絲狀單鏈DNA噬菌體(fd或M13)作為載體,在重組噬菌體顆粒表面展示外源多肽分子.外源蛋白在噬菌體表面上展現(xiàn),是通過外源蛋白在宿主大腸桿菌分泌性表達(dá)過程中與絲狀噬菌體外膜結(jié)構(gòu)蛋白(如主要外膜蛋白P8和次要外膜蛋白P3)形成牢靠的復(fù)合物而得以實(shí)現(xiàn).方法一:通過基因重組操作,構(gòu)建外源基因與噬菌體外膜蛋白基因的融合基因,直接產(chǎn)生出外源蛋白與外膜結(jié)構(gòu)蛋白的嵌合分子.方法二:在表達(dá)基因的構(gòu)件上,分別使表達(dá)出的噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白P3或P8的N端和外源蛋白的C端分別融合上一種短的介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用的功能結(jié)構(gòu)域.12 酵母雙雜交系統(tǒng)的原理和主要功能是什么？一般由哪幾部分組成？原理:在這一系統(tǒng)中,

26、與誘餌蛋白融合的DNA-BD和與文庫獵物蛋白融合的AD均來自GAL4相應(yīng)的結(jié)構(gòu)域.將誘餌蛋白與獵物蛋白的編碼質(zhì)粒分別導(dǎo)入同一個GAL4缺失的酵母細(xì)胞中,通過兩種相互作用蛋白結(jié)合形成復(fù)合物,可以重建GAL4的活性,轉(zhuǎn)錄激活相應(yīng)的效應(yīng)基因.三個基本組成部分:1.編碼靶蛋白與DNA結(jié)合域融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒.這種靶蛋白在雙雜交系統(tǒng)中專稱誘餌蛋白;2.cDNA質(zhì)粒表達(dá)文庫,文庫cDNA表達(dá)出的蛋白與轉(zhuǎn)錄激活域形成融合蛋白,這些蛋白統(tǒng)稱為獵物蛋白;3.能反映出體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子活性重建的宿主酵母菌及體現(xiàn)出這種活性的報(bào)道基因系統(tǒng).13 酵母雙雜交體系常常出現(xiàn)假的陽性結(jié)果，應(yīng)該如何正確判讀得到的結(jié)論呢？14 酵母單

27、雜交系統(tǒng)的原理和主要功能是什么？  第6章 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)1 使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因有哪些優(yōu)點(diǎn)？與其他表達(dá)系統(tǒng)相比，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清楚，目標(biāo)基因表達(dá)水平高，培養(yǎng)周期短，抗污染能力強(qiáng)2 質(zhì)粒表達(dá)載體一般包括哪些主要的組成部分？A復(fù)制子：復(fù)制子是一段包含復(fù)制起始位點(diǎn)、反式因子作用區(qū)在內(nèi)的DNA片段，其功能是通過復(fù)制使得質(zhì)粒能穩(wěn)定存在于大腸桿菌內(nèi)。B篩選標(biāo)記：質(zhì)粒表達(dá)載體上，必需含有表型選擇標(biāo)記，才能把已成功轉(zhuǎn)化的大腸桿菌從大量的菌群中分理處理啊，表型選擇標(biāo)記分為顯性標(biāo)記和營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)都采用抗生素抗性基因作為顯性選擇標(biāo)記。C啟動子：在

28、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，大部分表達(dá)載體采用調(diào)控型啟動子控制目標(biāo)基因的表達(dá)。這種能控制基因在特定時期表達(dá)的模式既可避免菌體生長前期目標(biāo)基因的高表達(dá)對菌體生長的影響，又可減少細(xì)菌的蛋白水解酶對目標(biāo)基因產(chǎn)物的降解。這對于建立一個高效、實(shí)用的表達(dá)系統(tǒng)十分重要。D終止子：位于啟動子的上游轉(zhuǎn)錄終止子，可以防止由質(zhì)粒上其他基因啟動子產(chǎn)生的通讀作用，以降低誘導(dǎo)前的本底表達(dá)。位于啟動子的下游轉(zhuǎn)錄終止子既可以控制目的基因mRNA的長度，提高其穩(wěn)定性，又能避免質(zhì)粒上其他基因的異常表達(dá)導(dǎo)致高拷貝質(zhì)粒的穩(wěn)定性下降的缺陷。E核糖體結(jié)合位點(diǎn)：緊靠啟動子下游，翻譯起始密碼子ATG通常位于它的中心位置，含有SD序列，與rRNA 1

29、6S亞基互補(bǔ)。3 質(zhì)粒表達(dá)載體中一般在什么位置使用終止子？位于啟動子的上游轉(zhuǎn)錄終止子，可以防止由質(zhì)粒上其他基因啟動子產(chǎn)生的通讀作用，以降低誘導(dǎo)前的本底表達(dá)。位于啟動子的下游轉(zhuǎn)錄終止子既可以控制目的基因mRNA的長度，提高其穩(wěn)定性，又能避免質(zhì)粒上其他基因的異常表達(dá)導(dǎo)致高拷貝質(zhì)粒的穩(wěn)定性下降的缺陷。4 使用簡明的語言敘述Lac/Tac表達(dá)系統(tǒng)、PL和PR表達(dá)系統(tǒng)以及T7表達(dá)系統(tǒng)的主要特點(diǎn)。表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)載體宿主菌誘導(dǎo)方法控制本底的方法Lac和Tac野生型lac操縱子：受正調(diào)節(jié)因子CAP和負(fù)調(diào)節(jié)因子lacI調(diào)控lacUV5突變體可以在沒有CAP存在的情況下非常有效的起始轉(zhuǎn)錄,只受lacI阻遏調(diào)控tac

30、啟動子調(diào)控模式與lacUV5模式相似,但mRNA轉(zhuǎn)錄水平更高,具有更高的基因表達(dá)水平大腸桿菌JM 109等基因型為lacIq的菌株化學(xué)誘導(dǎo)：IPTG、乳糖、異乳糖當(dāng)多拷貝的lac表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌,不能保證有足夠的阻遏蛋白,因此具有較高的本底.可采用lacI基因突變體lacIq為宿主菌,它可以產(chǎn)生過量的阻遏蛋白;還可在表達(dá)載體中插入lacIq基因PL和PR野生型噬菌體: PL和PR啟動子受cI基因的產(chǎn)物阻遏選用溫度敏感突變體cI857(ts)的基因產(chǎn)物來調(diào)控,高溫失活溶源化噬菌體的腸桿菌熱脈沖誘導(dǎo)一,采用溶源化噬菌體的腸桿菌;二,將cI857ts基因組裝在表達(dá)載體上T7T7噬菌體基因1編

31、碼的T7 RNA聚合酶(高活性)選擇性激活T7噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄,根據(jù)T7 RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式?jīng)Q定表達(dá)系統(tǒng)的調(diào)控方式化學(xué)信號誘導(dǎo)；熱脈沖誘導(dǎo)；貧氧誘導(dǎo)如果目的基因?qū)Υ竽c桿菌宿主有毒性,會影響細(xì)胞的生長,可以在表達(dá)系統(tǒng)中低水平表達(dá)T7溶菌酶基因,溶菌酶可以與T7RNA聚合酶結(jié)合以抑制其轉(zhuǎn)錄活性5 使用大腸桿菌表達(dá)外源基因時，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)在大腸桿菌體內(nèi)有哪幾種形式？各有什么特點(diǎn)？PS包涵體是由于在新合成的大量目標(biāo)蛋白的折疊過程中，大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)參與折疊的蛋白因子的量不能滿足需要，無法形成正確的構(gòu)象而產(chǎn)生的。包涵體顆粒：在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為不溶性的，存在于大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中。優(yōu)點(diǎn)是能夠表達(dá)對大腸桿

32、菌宿主有毒或有致死效應(yīng)的目標(biāo)蛋白；能夠避免細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶的作用和有利于目標(biāo)蛋白的富集和分離純化。缺點(diǎn)：包涵體要用變性劑溶解，經(jīng)過復(fù)性過程才能得到在緩沖溶液中溶解的蛋白質(zhì)；經(jīng)過復(fù)性處理的目標(biāo)蛋白不一定能完全恢復(fù)原來的生物學(xué)活性，有時甚至完全得不到有活性的蛋白質(zhì)。復(fù)性處理工藝會使目標(biāo)蛋白的制備成本上升?？扇苄缘鞍祝涸诩?xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的，除可存在于細(xì)胞質(zhì)中，還可最終分泌到周質(zhì)空間，或外泌到培養(yǎng)液中。優(yōu)點(diǎn)：可避免包涵體復(fù)性帶來的問題缺點(diǎn)：大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)環(huán)境的氧化還原態(tài)勢不利于蛋白質(zhì)二硫鍵的形成，并且缺少一種形成二硫鍵所必須的體系。一些需要通過二硫鍵的形成來維持其構(gòu)想的目標(biāo)蛋白在大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中往

33、往不能正確折疊。并且分離純化較復(fù)雜。6 使用大腸桿菌表達(dá)外源基因時，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)在大腸桿菌體中的位置有哪幾種？各有什么特點(diǎn)？細(xì)胞質(zhì)：表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建比較簡單；能夠達(dá)到很高的目標(biāo)蛋白表達(dá)量；在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)的目標(biāo)蛋白往往形成包涵體顆粒。周質(zhì)空間：自身蛋白質(zhì)的數(shù)量少，蛋白水解酶的含量也相比少得多，因此目標(biāo)蛋白在周質(zhì)空間中表達(dá)有利于分離純化和減少蛋白水解酶的降解。目標(biāo)蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)空間過程中信號肽被加工切除，有效地避免了N端附加的甲硫氨酸的產(chǎn)生。目標(biāo)蛋白在周質(zhì)空間中能夠較好折疊，維持正確的構(gòu)象。信號肽序列在目標(biāo)蛋白由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至周質(zhì)空間有重要作用。培養(yǎng)基：可以進(jìn)一步減少蛋白水解酶的降級，也有利于分離純化，但對外泌分子量較小的蛋白有效，而且外泌效率一般都比較低。 7 如何在大腸桿菌中高效表達(dá)外源基因？可以從哪幾個方面考慮？A. 表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化設(shè)計(jì)：核糖體結(jié)合位點(diǎn)對于構(gòu)建高效表達(dá)質(zhì)粒至關(guān)重要。它序列的變化對mRNA的翻譯效率有顯著影響，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時，首先要考慮使目標(biāo)基因的翻譯起始密碼ATG與SD序列之間的距離和堿基組成處于一個適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)。另外，核糖體結(jié)合位點(diǎn)本