南方醫(yī)科大學細胞生物學第二章研究方法

1、第一節(jié)第一節(jié) 顯微鏡技術(shù)顯微鏡技術(shù) 光學顯微鏡光學顯微鏡 : : 觀察顯微結(jié)構(gòu)觀察顯微結(jié)構(gòu) （light microscope)light microscope)顯微鏡顯微鏡 電子顯微鏡電子顯微鏡 : : 觀察亞微結(jié)構(gòu)觀察亞微結(jié)構(gòu) (electron microscope) (electron microscope) 第二章第二章. .細胞生物學研究方法細胞生物學研究方法分辨率公式分辨率公式n = 介質(zhì)折射率（空氣介質(zhì)折射率（空氣1，水，水1.33，香柏油，香柏油1.5）= 標本對物鏡鏡口張角的半角，標本對物鏡鏡口張角的半角， sin的最大值為的最大值為1。= 照明光源的波長，白光照明光源的波

2、長，白光0.5 m 。橫向分辨率橫向分辨率 Rx,y=0.61/nsin 縱向分辨率縱向分辨率 Rz=2/(nsin)2 退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁( (一一) )普通光學顯微鏡的分辨率：普通光學顯微鏡的分辨率：0.2微米微米一、光學顯微鏡技術(shù)一、光學顯微鏡技術(shù)思考：思考：如何提高顯微如何提高顯微鏡的分辨能力？鏡的分辨能力？人眼的分辨率：人眼的分辨率：100 m不同光線的波長不同光線的波長名名 稱稱 波波 長長 (nm) 可見光可見光 760 -390 紫外光紫外光 390 -13 X 射線射線 13-0.05 射線射線 1-0.005 電子束電

3、子束 : 100V 0.123 10,000V 0.0122 100,000V 0.00387 （二）普通光學顯微鏡的成像原理（二）普通光學顯微鏡的成像原理 光鏡的結(jié)構(gòu)光鏡的結(jié)構(gòu) 光學部分光學部分 照明部分照明部分 機械部分機械部分在普通光學顯微鏡下，細胞結(jié)構(gòu)呈在普通光學顯微鏡下，細胞結(jié)構(gòu)呈半透明狀半透明狀，不易看清。，不易看清。往往將標本切片往往將標本切片進行進行染色染色提提高可辨程度高可辨程度。切片機切片機染染色色的的原原理理以以紫外線紫外線為光源，照為光源，照射被檢物體發(fā)出能觀射被檢物體發(fā)出能觀察到的熒光。察到的熒光。熒光顯微鏡顯示同一細胞中的多種結(jié)構(gòu)成分熒光顯微鏡顯示同一細胞中的多種結(jié)

4、構(gòu)成分細胞核內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細胞骨架通過致密部分通過致密部分( (如細胞核如細胞核), ),速度慢速度慢通過疏松部位通過疏松部位( (如細胞質(zhì)如細胞質(zhì)), ),速度快速度快倒置相差顯微鏡倒置相差顯微鏡載物臺的上方：載物臺的上方： 光源光源 長焦距長焦距聚光器聚光器載物臺的下方：載物臺的下方： 物鏡物鏡應(yīng)用：直接對培養(yǎng)的應(yīng)用：直接對培養(yǎng)的 細胞進行觀察細胞進行觀察體外培養(yǎng)的細胞(a)：正在分裂生長的Hela 細胞(b)：CHO單層細胞的培養(yǎng) 用激光作光源，逐點、逐行、逐面快速掃描。用激光作光源，逐點、逐行、逐面快速掃描。 類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖

5、像。體圖像。信噪比信噪比 英文名稱：英文名稱：signal-to-noise ratio;signal to noise ratio定義定義： 特定參數(shù)特定參數(shù)( (信號信號) )值與非特異性參數(shù)值與非特異性參數(shù)( (噪噪聲聲) )的比值。的比值。 如實驗中樣品的放射性與本底放射性如實驗中樣品的放射性與本底放射性強度之比；熒光在強度之比；熒光在X X射線底片上所造成的感射線底片上所造成的感光強度與非特異感光背景強度之比等光強度與非特異感光背景強度之比等二、電子顯微鏡二、電子顯微鏡1.1.透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡分辨率分辨率= = 0.1 nm2.2.掃描電子顯微鏡掃描電子顯微鏡-顯示細胞顯

6、示細胞表面表面三維立三維立體結(jié)構(gòu)體結(jié)構(gòu)顯示細胞顯示細胞斷面斷面三維立三維立體結(jié)構(gòu)體結(jié)構(gòu)電鏡與光鏡的比較電鏡與光鏡的比較顯微鏡顯微鏡分辨本分辨本領(lǐng)領(lǐng)光源光源透鏡透鏡真空真空成像原理成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見光可見光（400-700） 紫外光紫外光（約（約200nm)電子束電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空不要求真空不要求真空要求真空要求真空1.33x10-51.33x10-3Pa利用樣品對光利用樣品對光的吸收形成明的吸收形成明暗反差和顏色暗反差和顏色變化變化利用樣品對電利用樣品對電子的散射和透子的散射和透射形成

7、明暗反射形成明暗反差差一一. .細胞組分的分級分離細胞組分的分級分離 第二節(jié)第二節(jié). .細胞生物學其他研究方法細胞生物學其他研究方法分離不同類型細胞 大小大小 密度密度 形狀形狀 小小 輕輕 不規(guī)則不規(guī)則 大大 重重 圓形圓形1.1.差速離心法差速離心法 方法：方法：從高速到低速逐級沉降從高速到低速逐級沉降 分離對象：分離對象：體積、質(zhì)量差別較大的顆粒體積、質(zhì)量差別較大的顆粒二二 細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)（一）細胞培養(yǎng)（一）細胞培養(yǎng) 從機體中取出組織或細胞，模擬體內(nèi)的生從機體中取出組織或細胞，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，使之能夠繼續(xù)生存的一種方法。理環(huán)境，使之能夠繼續(xù)生存的一種方法。（二）分類（二）分類 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)體外培養(yǎng)的細胞(a)：正在分裂生長的Hela 細胞(b)：CHO單層細胞的培養(yǎng)三、細胞融合（細胞雜交）三、細胞融合（細胞雜交）1.1.概念：在自發(fā)或人工誘導下，概念：在自發(fā)或人工誘導下，相同或不同基因型細胞之間相互相同或不同基因型細胞之間相互融合的過程。融合的過程。2.2.誘導因子：生物：仙臺病毒誘導因子：生物：仙臺病毒 化學：聚乙二醇化學：聚乙二醇 物理：電脈沖物理：電脈沖3.3.分類：分類： 異核體：異核體：不同基因的細胞核融合不同基因的細胞核融合 同核體：同核體：相同基因的細胞核融合相