毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)PPT課件

1、二、內(nèi)容二、內(nèi)容（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇 1、物種的選擇：嚙齒類(lèi)、非嚙齒類(lèi)、物種的選擇：嚙齒類(lèi)、非嚙齒類(lèi) 基本原則：基本原則： 代謝、生化、毒理學(xué)特征與人最接近的代謝、生化、毒理學(xué)特征與人最接近的 自然壽命不太長(zhǎng)的自然壽命不太長(zhǎng)的 易于飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作的易于飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作的 經(jīng)濟(jì)且易于獲得的經(jīng)濟(jì)且易于獲得的2、品系的選擇：遺傳學(xué)控制分類(lèi)、品系的選擇：遺傳學(xué)控制分類(lèi) 近交系：純品系，近交系：純品系，經(jīng)至少連續(xù)20代的全同胞兄妹之間或親代與子代之間交配培育而成的動(dòng)物 雜交群：雜交群：F1代，代，兩個(gè)不同近交系之間進(jìn)行有計(jì)劃的交配.雜交所產(chǎn)生的第一代動(dòng)物，即F1代動(dòng)物 封閉群：封閉群：

2、5年內(nèi)，隨機(jī)交配。年內(nèi)，隨機(jī)交配。一個(gè)種群動(dòng)物位于固定地點(diǎn)，5年以上不從外部引進(jìn)任何新種,僅在群內(nèi)隨機(jī)交配繁殖遺傳均一性：遺傳均一性：一種毒物固定使用同種品系一種毒物固定使用同種品系3、微生物學(xué)和寄生蟲(chóng)控制的選擇、微生物學(xué)和寄生蟲(chóng)控制的選擇 級(jí)：普通動(dòng)物，開(kāi)放系統(tǒng)飼養(yǎng)級(jí)：普通動(dòng)物，開(kāi)放系統(tǒng)飼養(yǎng) 級(jí)：清潔動(dòng)物，屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)級(jí)：清潔動(dòng)物，屏障系統(tǒng)飼養(yǎng) 級(jí)：級(jí)：SPF動(dòng)動(dòng)，屏障動(dòng)動(dòng)，屏障/隔離系統(tǒng)飼養(yǎng)隔離系統(tǒng)飼養(yǎng) 級(jí)：無(wú)菌動(dòng)物，隔離系統(tǒng)飼養(yǎng)級(jí)：無(wú)菌動(dòng)物，隔離系統(tǒng)飼養(yǎng)4、個(gè)體選擇、個(gè)體選擇 性別：性別： 年齡：急性、慢性年齡：急性、慢性以體重估計(jì)：組內(nèi)、組間差異以體重估計(jì)：組內(nèi)、組間差異 生理狀態(tài)：雌

3、生理狀態(tài)：雌-未產(chǎn)未孕，避免妊娠、激未產(chǎn)未孕，避免妊娠、激素影響素影響 健康狀況：健康動(dòng)物健康狀況：健康動(dòng)物健康動(dòng)物辨認(rèn)：健康動(dòng)物辨認(rèn)：l 健康動(dòng)物辨認(rèn)：外觀體形豐滿，被毛濃密有光澤、緊貼體表，眼健康動(dòng)物辨認(rèn)：外觀體形豐滿，被毛濃密有光澤、緊貼體表，眼睛明亮，行動(dòng)迅速、反應(yīng)靈活，食欲及營(yíng)養(yǎng)狀況良好。睛明亮，行動(dòng)迅速、反應(yīng)靈活，食欲及營(yíng)養(yǎng)狀況良好。 (1)眼：明亮，瞳孔雙側(cè)等圓，無(wú)分泌物。眼：明亮，瞳孔雙側(cè)等圓，無(wú)分泌物。 (2)耳，耳道無(wú)分泌物溢出，耳殼無(wú)膿瘡。耳，耳道無(wú)分泌物溢出，耳殼無(wú)膿瘡。 (3)鼻：無(wú)噴嚏，無(wú)漿性粘液分泌物。鼻：無(wú)噴嚏，無(wú)漿性粘液分泌物。 (4)皮膚：無(wú)創(chuàng)傷、無(wú)膿瘡、疥

4、癬、濕疹。皮膚：無(wú)創(chuàng)傷、無(wú)膿瘡、疥癬、濕疹。 (5)頸部：要求頸項(xiàng)端正，如有歪斜提示可能存在內(nèi)耳疾患，不頸部：要求頸項(xiàng)端正，如有歪斜提示可能存在內(nèi)耳疾患，不應(yīng)選作實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。應(yīng)選作實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。 (6)消化道：無(wú)嘔吐、腹瀉，糞便成形，肛門(mén)附近被毛潔凈。消化道：無(wú)嘔吐、腹瀉，糞便成形，肛門(mén)附近被毛潔凈。 (7)神經(jīng)系統(tǒng)：無(wú)震顫、麻痹。若動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)：無(wú)震顫、麻痹。若動(dòng)物(大鼠、小鼠大鼠、小鼠)出現(xiàn)圓圈動(dòng)出現(xiàn)圓圈動(dòng)作或提尾倒置呈圓圈擺應(yīng)放棄該動(dòng)物。作或提尾倒置呈圓圈擺應(yīng)放棄該動(dòng)物。 (8)四肢及尾：四肢、趾及尾無(wú)紅腫及潰瘍。四肢及尾：四肢、趾及尾無(wú)紅腫及潰瘍。（二）動(dòng)物性別鑒定（二）動(dòng)物性別鑒定 (1)

5、大鼠、小鼠：主要依肛門(mén)與生殖孔間的距離大鼠、小鼠：主要依肛門(mén)與生殖孔間的距離區(qū)分，間距大者為雄性，小者為雌性。成年雄鼠區(qū)分，間距大者為雄性，小者為雌性。成年雄鼠臥位可見(jiàn)到辜丸，雌性在腹部可見(jiàn)乳頭。臥位可見(jiàn)到辜丸，雌性在腹部可見(jiàn)乳頭。 (2)豚鼠；用一只于抓住豚鼠頸部，另一只手扒豚鼠；用一只于抓住豚鼠頸部，另一只手扒開(kāi)靠生殖器孔的皮膚，雄性動(dòng)物在圓孔中露出性開(kāi)靠生殖器孔的皮膚，雄性動(dòng)物在圓孔中露出性器官的突起，雌性動(dòng)物則顯示三角形間隙，成年器官的突起，雌性動(dòng)物則顯示三角形間隙，成年雌性豚鼠胸部有兩個(gè)乳頭。雌性豚鼠胸部有兩個(gè)乳頭。（三）動(dòng)物抓取（三）動(dòng)物抓取 正確地抓取固定動(dòng)物，既不損害動(dòng)物健康、

6、不影正確地抓取固定動(dòng)物，既不損害動(dòng)物健康、不影響觀察指標(biāo)，又防止被動(dòng)物咬傷響觀察指標(biāo)，又防止被動(dòng)物咬傷(1)小鼠：先用右手抓取鼠尾提起，置于鼠籠或?qū)嵭∈螅合扔糜沂肿ト∈笪蔡崞?，置于鼠籠或?qū)嶒?yàn)臺(tái)上向后拉，在其向前爬行時(shí)，用左手拇指和驗(yàn)臺(tái)上向后拉，在其向前爬行時(shí)，用左手拇指和食指抓住小鼠的兩耳和頸部皮膚，將鼠體置于左食指抓住小鼠的兩耳和頸部皮膚，將鼠體置于左手心中，把后肢拉直，以無(wú)名指按住鼠尾，小指手心中，把后肢拉直，以無(wú)名指按住鼠尾，小指按住后腿即可。按住后腿即可。 尾靜脈注射時(shí)，可使用特殊的固定裝置進(jìn)行固定尾靜脈注射時(shí)，可使用特殊的固定裝置進(jìn)行固定,如尾靜脈注射架或如尾靜脈注射架或粗的玻璃試管

7、。如要進(jìn)行手術(shù)或心臟采血應(yīng)先行麻醉再操作粗的玻璃試管。如要進(jìn)行手術(shù)或心臟采血應(yīng)先行麻醉再操作,如進(jìn)行如進(jìn)行解剖實(shí)驗(yàn)則必須先行無(wú)痛處死后再進(jìn)行。解剖實(shí)驗(yàn)則必須先行無(wú)痛處死后再進(jìn)行。(2)大鼠：大鼠的抓取基本同小鼠，只是大大鼠：大鼠的抓取基本同小鼠，只是大鼠比小鼠性情兇猛，不易用襲擊方法抓取。鼠比小鼠性情兇猛，不易用襲擊方法抓取。為避免咬傷，可帶上帆布或棉紗手套。采為避免咬傷，可帶上帆布或棉紗手套。采用左手固定法，用拇指和食指捏住鼠耳，用左手固定法，用拇指和食指捏住鼠耳，余下三指緊捏鼠背皮膚，置于左掌心中。余下三指緊捏鼠背皮膚，置于左掌心中。(3)豚鼠：豚鼠膽小易驚，在抓取時(shí)要穩(wěn)、豚鼠：豚鼠膽小易

8、驚，在抓取時(shí)要穩(wěn)、準(zhǔn)、迅速。用手掌迅速扣住鼠背，抓住其準(zhǔn)、迅速。用手掌迅速扣住鼠背，抓住其肩胛上方，以拇指和食指環(huán)握頸部，另一肩胛上方，以拇指和食指環(huán)握頸部，另一只手托住臀部即可。只手托住臀部即可。(4)兔：用右手抓住兔頸部的毛皮提起，然兔：用右手抓住兔頸部的毛皮提起，然后左手托住其臀部或腹部，讓其體重的大后左手托住其臀部或腹部，讓其體重的大部分重量集中在左手上。注意不要抓取雙部分重量集中在左手上。注意不要抓取雙耳或抓提腹部。耳或抓提腹部。（四）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物稱(chēng)重、編號(hào)、標(biāo)記（四）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物稱(chēng)重、編號(hào)、標(biāo)記n項(xiàng)圈項(xiàng)圈n耳緣孔口標(biāo)記：耳緣孔口標(biāo)記：n染色法：苦味酸、品紅染色法：苦味酸、品紅 耳緣孔口標(biāo)記

9、：耳緣孔口標(biāo)記：用耳號(hào)鉗在耳上打洞或者用剪刀在耳邊緣剪缺口，左耳為十位，右耳為個(gè)位。（五）動(dòng)物隨機(jī)分組：隨機(jī)數(shù)字表（五）動(dòng)物隨機(jī)分組：隨機(jī)數(shù)字表（六）染毒途徑和方法（六）染毒途徑和方法1. 經(jīng)口（胃腸道）染毒經(jīng)口（胃腸道）染毒 喂飼：不易揮發(fā)、不易水解、無(wú)異味、不影響營(yíng)養(yǎng)喂飼：不易揮發(fā)、不易水解、無(wú)異味、不影響營(yíng)養(yǎng) 吞咽膠囊：吞咽膠囊： 灌胃：灌前禁食空腹，不飲水，灌胃容積灌胃：灌前禁食空腹，不飲水，灌胃容積0.10.2ml/10g小鼠、大鼠或豚鼠：左手抓住鼠背部及頸部皮膚將動(dòng)小鼠、大鼠或豚鼠：左手抓住鼠背部及頸部皮膚將動(dòng)物固定，右手持注射器，將灌胃針插入動(dòng)物口中，沿物固定，右手持注射器，將灌

10、胃針插入動(dòng)物口中，沿咽后壁徐徐插入食管。針插入時(shí)應(yīng)無(wú)阻力，若感到阻咽后壁徐徐插入食管。針插入時(shí)應(yīng)無(wú)阻力，若感到阻力或動(dòng)物掙扎，應(yīng)立即停止進(jìn)針或?qū)⑨槹纬?，以免損力或動(dòng)物掙扎，應(yīng)立即停止進(jìn)針或?qū)⑨槹纬?，以免損傷或穿破食管及誤入氣管。傷或穿破食管及誤入氣管。2. 經(jīng)呼吸道染毒經(jīng)呼吸道染毒 靜式吸入靜式吸入 動(dòng)式吸入動(dòng)式吸入 氣管內(nèi)注入氣管內(nèi)注入3. 經(jīng)皮膚染毒經(jīng)皮膚染毒 斑貼法（家兔）斑貼法（家兔）被毛的去除：剪毛、拔毛、脫毛被毛的去除：剪毛、拔毛、脫毛 浸尾法（大、小鼠）浸尾法（大、小鼠）4. 注射染毒：靜脈注射、肌肉注射、腹腔注注射染毒：靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射、皮內(nèi)注射射、皮下注

11、射、皮內(nèi)注射（七）生物標(biāo)本采集（七）生物標(biāo)本采集 1.血液采集：血液采集： 大、小鼠鼠尾采血法大、小鼠鼠尾采血法 眼眶靜脈叢采血法眼眶靜脈叢采血法 腹主動(dòng)脈或股動(dòng)腹主動(dòng)脈或股動(dòng)(靜靜)脈采血法脈采血法 斷頭采血法斷頭采血法 家兔耳緣靜脈采血法家兔耳緣靜脈采血法 心臟采血法心臟采血法動(dòng)物品種動(dòng)物品種最大安全采血量最大安全采血量(ml) 最小致死采血量最小致死采血量(ml)小鼠小鼠0.10.3大鼠大鼠1.02.0豚鼠豚鼠5.010.0家兔家兔10.040.0（八）動(dòng)物處死（八）動(dòng)物處死1. 脊椎脫臼法脊椎脫臼法2. 斷頭法斷頭法3. 急性大失血法急性大失血法4. 擊打法擊打法5. 麻醉致死法麻醉致

12、死法6.麻醉后急性放血法麻醉后急性放血法7.空氣栓塞法空氣栓塞法8.化學(xué)藥物致死法化學(xué)藥物致死法9.開(kāi)放性氣胸法開(kāi)放性氣胸法 陰性對(duì)照組：生理鹽水陰性對(duì)照組：生理鹽水 陽(yáng)性對(duì)照組：環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組：環(huán)磷酰胺40-60mg/kg 高劑量組：敵敵畏高劑量組：敵敵畏20mg/kg 中劑量組：敵敵畏中劑量組：敵敵畏10mg/kg 低劑量組：敵敵畏低劑量組：敵敵畏5mg/kg一、目的一、目的 掌握掌握LD50 計(jì)算方法和急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算方法和急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 熟悉經(jīng)口灌胃技術(shù)熟悉經(jīng)口灌胃技術(shù) 了解急性毒性試驗(yàn)的設(shè)計(jì)原則了解急性毒性試驗(yàn)的設(shè)計(jì)原則 急性毒性：一次或多次接觸，短時(shí)間產(chǎn)生急性毒性：一次或

13、多次接觸，短時(shí)間產(chǎn)生的毒性效應(yīng)，包括一般行為和外觀改變，的毒性效應(yīng)，包括一般行為和外觀改變，大體形態(tài)改變以及死亡效應(yīng)等。大體形態(tài)改變以及死亡效應(yīng)等。 農(nóng)藥的急性毒性分級(jí)：低、中、高、劇毒農(nóng)藥的急性毒性分級(jí)：低、中、高、劇毒 改良寇氏法：改良寇氏法：計(jì)算簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確率高，常用計(jì)算簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確率高，常用 霍恩法霍恩法 序貫法序貫法 Bliss法法 每組動(dòng)物數(shù)相等每組動(dòng)物數(shù)相等 各劑量組組距呈等比級(jí)數(shù)各劑量組組距呈等比級(jí)數(shù) 死亡呈正態(tài)分布死亡呈正態(tài)分布 最低劑量組死亡最低劑量組死亡80% 健康動(dòng)物健康動(dòng)物按體重隨機(jī)分組按體重隨機(jī)分組一次或多次一次或多次經(jīng)口給藥經(jīng)口給藥觀察中毒特征或死亡觀察中毒特征或死亡

14、劑量劑量-反反應(yīng)關(guān)系應(yīng)關(guān)系求出求出LD50 毒性分級(jí)毒性分級(jí) 動(dòng)物：昆明種小白鼠動(dòng)物：昆明種小白鼠 器材：注射器、灌胃針、見(jiàn)到、鑷子、試器材：注射器、灌胃針、見(jiàn)到、鑷子、試劑瓶、標(biāo)簽筆、移液槍等（課下交還）劑瓶、標(biāo)簽筆、移液槍等（課下交還） 試劑：敵敵畏，苦味酸試劑：敵敵畏，苦味酸1. 動(dòng)物選擇動(dòng)物選擇2. 劑量設(shè)計(jì)：劑量設(shè)計(jì)：5-8個(gè)劑量（一般不設(shè)對(duì)照組）個(gè)劑量（一般不設(shè)對(duì)照組）3. 動(dòng)物稱(chēng)重、編號(hào)、標(biāo)記動(dòng)物稱(chēng)重、編號(hào)、標(biāo)記4. 受試物配制受試物配制5. 灌胃：灌胃：0.1-0.2ml/10g體重體重6. 觀察：急性毒性試驗(yàn)原始記錄觀察：急性毒性試驗(yàn)原始記錄n劑量設(shè)計(jì)：劑量設(shè)計(jì)： 預(yù)實(shí)驗(yàn)：文

15、獻(xiàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)：文獻(xiàn)LD50=50-92mg/kg 設(shè)置設(shè)置400、200、100、50、25mg/kg 五個(gè)劑量，每劑量五個(gè)劑量，每劑量3只鼠。只鼠。 找出找出LD100和和LD0 組距組距i=（lgLD100-lgLD0）/（n-1） n是實(shí)驗(yàn)組數(shù)；是實(shí)驗(yàn)組數(shù)；i是正式實(shí)驗(yàn)中兩個(gè)相鄰劑量是正式實(shí)驗(yàn)中兩個(gè)相鄰劑量組的劑量對(duì)數(shù)之差組的劑量對(duì)數(shù)之差 A: lg200=2.301 B: lgx=2.301-i C: lgy=2.301-2i D: lgz=2.301-3i E: lgw=2.301-4i F: lg50=1.690n1：k系列稀釋法系列稀釋法 最大劑量組濃度最大劑量組濃度C1 （母液濃度

16、）（母液濃度）C1=200mg/kg=2mg/10g0.2ml/10g2mg/0.2ml=10mg/ml 每組最大體積每組最大體積m=20ml（設(shè)每只鼠需（設(shè)每只鼠需2ml） k：相鄰兩組劑量之比：相鄰兩組劑量之比=64.89/85.981=0.75 V總總=m/（1-k）=81.53ml（各組母液和）（各組母液和） 敵敵畏原液濃度：敵敵畏原液濃度：1400mg/ml 稀釋成稀釋成10mg/ml，81.53ml的母液的母液 1400mg/ml*Vx=10mg/ml*81.53ml Vx=0.582ml V水水=81.53-0.582l 第第1組組 20mll 第第2組組 剩余母液剩余母液+20

17、ml水水混勻后取混勻后取20mll 以此類(lèi)推以此類(lèi)推5. LD50計(jì)算：計(jì)算：LD50及及95%可信區(qū)間可信區(qū)間 m=Xk-i(p-0.5)m：lgLD50 i:相鄰兩劑量組對(duì)數(shù)值的差 Xk：最大劑量的對(duì)數(shù)值P：死亡率 q:存活率 n：每組動(dòng)物數(shù)p=各劑量組死亡率總和五、評(píng)價(jià)：毒性分級(jí)、毒性特征五、評(píng)價(jià)：毒性分級(jí)、毒性特征六、討論：六、討論： 確定化學(xué)物對(duì)哺乳動(dòng)物皮膚局部是否有刺確定化學(xué)物對(duì)哺乳動(dòng)物皮膚局部是否有刺激作用或腐蝕作用及其程度，為制定防護(hù)激作用或腐蝕作用及其程度，為制定防護(hù)化學(xué)物對(duì)皮膚的刺激保護(hù)措施提供依據(jù)?；瘜W(xué)物對(duì)皮膚的刺激保護(hù)措施提供依據(jù)。 皮膚刺激性皮膚刺激性(Dermal

18、Irritation)：皮：皮膚涂敷受試樣品后局部產(chǎn)生的可逆性炎性膚涂敷受試樣品后局部產(chǎn)生的可逆性炎性變化。變化。 皮膚腐蝕性皮膚腐蝕性(Dermal Corrosion)：皮膚：皮膚涂敷受試樣品后局部引起的不可逆組織損涂敷受試樣品后局部引起的不可逆組織損傷。傷。將受試物一次將受試物一次(或多次或多次)涂敷于受試動(dòng)物的涂敷于受試動(dòng)物的皮膚上，在規(guī)定的時(shí)間間隔內(nèi)，觀察動(dòng)物皮膚上，在規(guī)定的時(shí)間間隔內(nèi)，觀察動(dòng)物皮膚局部刺激作用的程度并進(jìn)行評(píng)分。皮膚局部刺激作用的程度并進(jìn)行評(píng)分。采用自身對(duì)照，以評(píng)價(jià)受試物對(duì)皮膚的刺采用自身對(duì)照，以評(píng)價(jià)受試物對(duì)皮膚的刺激作用。急性皮膚刺激性試驗(yàn)觀察期限應(yīng)激作用。急性皮膚

19、刺激性試驗(yàn)觀察期限應(yīng)足以評(píng)價(jià)該作用的可逆性或不可逆性。足以評(píng)價(jià)該作用的可逆性或不可逆性。 強(qiáng)酸或強(qiáng)堿物質(zhì)如強(qiáng)酸或強(qiáng)堿物質(zhì)如pH2或或pH11.5，由于可預(yù)見(jiàn)其腐蝕特性，不必做本試驗(yàn)；由于可預(yù)見(jiàn)其腐蝕特性，不必做本試驗(yàn)； 若已知受試樣品有很強(qiáng)的經(jīng)皮吸收毒性若已知受試樣品有很強(qiáng)的經(jīng)皮吸收毒性（LD50200mg/kg bw）的物質(zhì)不必）的物質(zhì)不必進(jìn)行本試驗(yàn)；進(jìn)行本試驗(yàn)；1、受試樣品、受試樣品 液態(tài)受試樣品采用原液或人類(lèi)實(shí)際應(yīng)用濃度液態(tài)受試樣品采用原液或人類(lèi)實(shí)際應(yīng)用濃度 固體受試樣品經(jīng)研磨，過(guò)固體受試樣品經(jīng)研磨，過(guò)100目篩后用水或目篩后用水或適當(dāng)?shù)馁x形劑（如凡士林、阿拉伯樹(shù)膠、乙適當(dāng)?shù)馁x形劑（如凡

20、士林、阿拉伯樹(shù)膠、乙醇和水、羧甲基纖維素、聚乙二醇、丙三醇、醇和水、羧甲基纖維素、聚乙二醇、丙三醇、植物油和礦物油等）按一定比例調(diào)制，以保植物油和礦物油等）按一定比例調(diào)制，以保證與皮膚充分接觸。證與皮膚充分接觸。 首選健康成年白色家兔，其次為白色豚鼠。首選健康成年白色家兔，其次為白色豚鼠。 至少需要至少需要4只健康成年動(dòng)物（雄性和只健康成年動(dòng)物（雄性和/或雌性均可）?；虼菩跃桑?每只動(dòng)物相鄰的未處理的皮膚可作為對(duì)照。每只動(dòng)物相鄰的未處理的皮膚可作為對(duì)照。 每只單籠飼養(yǎng)，試驗(yàn)前動(dòng)物要在實(shí)驗(yàn)室中適應(yīng)每只單籠飼養(yǎng)，試驗(yàn)前動(dòng)物要在實(shí)驗(yàn)室中適應(yīng)3d。 常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水 3

21、、劑量設(shè)計(jì)、劑量設(shè)計(jì) 受試樣品受試樣品0.5ml(g)，均勻涂布于受試部，均勻涂布于受試部位。如受試樣品難以獲得，或易產(chǎn)生全身位。如受試樣品難以獲得，或易產(chǎn)生全身毒性等原因，用量可適當(dāng)減少。但為了試毒性等原因，用量可適當(dāng)減少。但為了試驗(yàn)的一致性，測(cè)試面積應(yīng)力求相等。驗(yàn)的一致性，測(cè)試面積應(yīng)力求相等。1）試驗(yàn)前準(zhǔn)備）試驗(yàn)前準(zhǔn)備 試驗(yàn)前試驗(yàn)前24h，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脊柱兩側(cè)毛剪去，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脊柱兩側(cè)毛剪去或剃掉，不可損傷表皮，去毛范圍左右各或剃掉，不可損傷表皮，去毛范圍左右各3cm3cm。24h后，選擇皮膚健康完整后，選擇皮膚健康完整無(wú)損的動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)。不應(yīng)在長(zhǎng)有濃密島無(wú)損的動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)。不應(yīng)在長(zhǎng)有濃密島

22、狀毛的部位進(jìn)行受試樣品試驗(yàn)。狀毛的部位進(jìn)行受試樣品試驗(yàn)。2） 染毒染毒 受試樣品受試樣品0.5ml(g)直接涂布在皮膚上，直接涂布在皮膚上，用二層紗布（用二層紗布（2.5cm2.5cm）和一層玻）和一層玻璃紙或類(lèi)似物覆蓋，再用無(wú)刺激性膠布和璃紙或類(lèi)似物覆蓋，再用無(wú)刺激性膠布和繃帶加以固定。另一側(cè)皮膚作為對(duì)照。采繃帶加以固定。另一側(cè)皮膚作為對(duì)照。采用封閉試驗(yàn)，敷用時(shí)間為用封閉試驗(yàn)，敷用時(shí)間為4h。 對(duì)化妝品產(chǎn)品而言，可根據(jù)人的實(shí)際使用對(duì)化妝品產(chǎn)品而言，可根據(jù)人的實(shí)際使用和產(chǎn)品類(lèi)型，延長(zhǎng)或縮短敷用時(shí)間。和產(chǎn)品類(lèi)型，延長(zhǎng)或縮短敷用時(shí)間。 對(duì)用后沖洗的化妝品產(chǎn)品，僅采用對(duì)用后沖洗的化妝品產(chǎn)品，僅采用2

23、 h敷用敷用試驗(yàn)。試驗(yàn)。 試驗(yàn)結(jié)束后用溫水或無(wú)刺激性溶劑清除殘?jiān)囼?yàn)結(jié)束后用溫水或無(wú)刺激性溶劑清除殘留受試物。留受試物。 如懷疑受試樣品可能引起嚴(yán)重刺激或腐蝕如懷疑受試樣品可能引起嚴(yán)重刺激或腐蝕作用，可采用分段試驗(yàn)，將三個(gè)涂布受試作用，可采用分段試驗(yàn)，將三個(gè)涂布受試樣品的紗布?jí)K同時(shí)或先后敷貼于一只家兔樣品的紗布?jí)K同時(shí)或先后敷貼于一只家兔背部脫毛區(qū)皮膚上，分別于涂敷后背部脫毛區(qū)皮膚上，分別于涂敷后3min、60min和和4h取下一塊紗布，皮膚涂敷部取下一塊紗布，皮膚涂敷部位在任一時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)腐蝕作用，即可停止位在任一時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)腐蝕作用，即可停止試驗(yàn)。試驗(yàn)。3）觀察期限）觀察期限 觀察時(shí)間的確定應(yīng)足以

24、觀察到可逆和不可逆刺激觀察時(shí)間的確定應(yīng)足以觀察到可逆和不可逆刺激作用的全過(guò)程，一般不超過(guò)作用的全過(guò)程，一般不超過(guò)14d。 于清除受試樣品后的于清除受試樣品后的1、24、48、72h分別觀分別觀察給予受試樣品部位的皮膚反應(yīng)，按表察給予受試樣品部位的皮膚反應(yīng)，按表1進(jìn)行皮進(jìn)行皮膚反應(yīng)評(píng)分，以受試動(dòng)物積分的平均值進(jìn)行綜合膚反應(yīng)評(píng)分，以受試動(dòng)物積分的平均值進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，根據(jù)評(píng)價(jià)，根據(jù)24、48和和72h各觀察時(shí)點(diǎn)最高積分各觀察時(shí)點(diǎn)最高積分均值，按表均值，按表2判定皮膚刺激強(qiáng)度。判定皮膚刺激強(qiáng)度。表 1皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分皮 膚 反 應(yīng)積分紅斑和焦痂形成無(wú)紅斑0輕微紅斑（僅僅可覺(jué)察到）1明顯紅斑2中等程度到

25、重度程度紅斑3嚴(yán)重紅斑（輕微的結(jié)痂）至輕度焦痂（深度損傷）4水腫形成無(wú)水腫0很輕微水腫（僅僅可覺(jué)察到）1輕微水腫（腫起部位邊界清楚）2中度水腫（隆起約 lmm）3嚴(yán)重水腫（隆起約 lmm，超出染毒部位）4表 2皮膚刺激強(qiáng)度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)*指觀察時(shí)點(diǎn)的最高積分均值積分均值*強(qiáng) 度 分 級(jí)0無(wú)刺激性0.5輕刺激性2.0中等刺激性6.0強(qiáng)刺激性 試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)以表格形式總結(jié)，包括如下內(nèi)容：試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)以表格形式總結(jié)，包括如下內(nèi)容： 受試物名稱(chēng)、理化性狀、配制方法和用量。必要時(shí)受試物名稱(chēng)、理化性狀、配制方法和用量。必要時(shí)說(shuō)明說(shuō)明pH值值 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬、品系、性別、體重和來(lái)源實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬、品系、性別、體重和來(lái)源(合

26、格證號(hào)合格證號(hào)和級(jí)別和級(jí)別) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境：飼料來(lái)源、室溫、相對(duì)濕度、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境：飼料來(lái)源、室溫、相對(duì)濕度、動(dòng)物房合格證號(hào)動(dòng)物房合格證號(hào) 每個(gè)動(dòng)物在每一觀察時(shí)點(diǎn)的皮膚刺激反應(yīng)積分每個(gè)動(dòng)物在每一觀察時(shí)點(diǎn)的皮膚刺激反應(yīng)積分 具體描述除刺激性以外的其它毒性作用具體描述除刺激性以外的其它毒性作用 結(jié)論結(jié)論表 3豚鼠急性皮膚刺激/腐蝕實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄表動(dòng)物編號(hào)性別體重（kg）1h24h48h樣品對(duì)照樣品對(duì)照樣品對(duì)照紅斑水腫總分紅斑水腫總分紅斑水腫總分紅斑水腫總分紅斑水腫總分紅斑水腫總分1234總積分平均值刺激強(qiáng)度分級(jí) 急性皮膚刺激試驗(yàn)結(jié)果從動(dòng)物外推到人的可靠性急性皮膚刺激試驗(yàn)結(jié)果從動(dòng)物外推到人的可

27、靠性很有限。很有限。 白色家兔和豚鼠在大多數(shù)情況下對(duì)有刺激性或腐白色家兔和豚鼠在大多數(shù)情況下對(duì)有刺激性或腐蝕性的物質(zhì)較人類(lèi)敏感。蝕性的物質(zhì)較人類(lèi)敏感。 若用其它品系動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)也得到類(lèi)似結(jié)果，若用其它品系動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)也得到類(lèi)似結(jié)果，則會(huì)增加從動(dòng)物外推到人的可靠性。則會(huì)增加從動(dòng)物外推到人的可靠性。 試驗(yàn)中使用封閉式接觸是一種超常的實(shí)驗(yàn)室條件試驗(yàn)中使用封閉式接觸是一種超常的實(shí)驗(yàn)室條件下的試驗(yàn)，在人類(lèi)實(shí)際接觸化學(xué)品過(guò)程中很少存下的試驗(yàn)，在人類(lèi)實(shí)際接觸化學(xué)品過(guò)程中很少存在這種接觸方式。在這種接觸方式。附：多次皮膚刺激性試驗(yàn)步驟附：多次皮膚刺激性試驗(yàn)步驟 1 試驗(yàn)前將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背部脊柱兩側(cè)被毛剪掉，去

28、試驗(yàn)前將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背部脊柱兩側(cè)被毛剪掉，去毛范圍各為毛范圍各為2cm3cm，涂抹面積，涂抹面積2.5 cm2.5cm。 2 取受試物約取受試物約0.5mL(g)涂抹在一側(cè)皮膚上，涂抹在一側(cè)皮膚上，當(dāng)受試物使用無(wú)刺激性溶劑配制時(shí)，另一側(cè)涂溶當(dāng)受試物使用無(wú)刺激性溶劑配制時(shí)，另一側(cè)涂溶劑作為對(duì)照，每天涂抹劑作為對(duì)照，每天涂抹1次，連續(xù)涂抹次，連續(xù)涂抹14d。從。從第二天開(kāi)始，每次涂抹前應(yīng)剪毛，用水或無(wú)刺激第二天開(kāi)始，每次涂抹前應(yīng)剪毛，用水或無(wú)刺激性溶劑清除殘留受試物。一小時(shí)后觀察結(jié)果，按性溶劑清除殘留受試物。一小時(shí)后觀察結(jié)果，按表表1 評(píng)分，對(duì)照區(qū)和試驗(yàn)區(qū)同樣處理。評(píng)分，對(duì)照區(qū)和試驗(yàn)區(qū)同樣處理。 結(jié)果

29、評(píng)價(jià)：按下列公式計(jì)算每天每只動(dòng)物結(jié)果評(píng)價(jià)：按下列公式計(jì)算每天每只動(dòng)物平均積分，以表平均積分，以表2判定皮膚刺激強(qiáng)度。判定皮膚刺激強(qiáng)度。14受試動(dòng)物數(shù)紅斑和水腫積分每天每只動(dòng)物平均積分表 4對(duì)豚鼠多次皮膚刺激性試驗(yàn)結(jié)果涂抹天數(shù)動(dòng)物數(shù)(只)刺激反應(yīng)積分樣品對(duì)照紅斑水腫總分紅斑水腫總分14243444546474849410411412413414414 天每只動(dòng)物積分均值每天每只動(dòng)物積分均值 DDV：LD50：5080 mg/kg(大鼠經(jīng)口大鼠經(jīng)口)；75-107，113 mg/kg(大鼠經(jīng)皮大鼠經(jīng)皮)；LC50：15mg/ (大鼠吸入，大鼠吸入，4h) 二甲苯：二甲苯：LD50：5000mg/k

30、g（大鼠經(jīng)口）；（大鼠經(jīng)口）；LC50：1947mg/m3（大鼠吸入）（大鼠吸入）;輕微粘膜刺激。引起皮膚輕微粘膜刺激。引起皮膚發(fā)紅。家兔經(jīng)皮：發(fā)紅。家兔經(jīng)皮：500mg/24h，中度刺激，中度刺激 甲醛：甲醛：急性毒性急性毒性：LD50800mg/kg（大鼠經(jīng)口），（大鼠經(jīng)口），2700mg/kg（兔經(jīng)皮）；（兔經(jīng)皮）；LC50590mg/m3（大鼠（大鼠吸入）；人吸入吸入）；人吸入60120mg/m3，發(fā)生，發(fā)生支氣管炎支氣管炎、肺、肺部嚴(yán)重?fù)p害；人吸入部嚴(yán)重?fù)p害；人吸入1224mg/m3，鼻、咽粘膜嚴(yán)，鼻、咽粘膜嚴(yán)重灼務(wù)、流淚、咳嗽；人經(jīng)口重灼務(wù)、流淚、咳嗽；人經(jīng)口1020ml，致死。，

31、致死。 一、目的：掌握小鼠骨髓一、目的：掌握小鼠骨髓PCE微核測(cè)定方法微核測(cè)定方法二、原理二、原理 染色體斷裂染色體斷裂染色體完整性染色體完整性 紡錘絲受影響紡錘絲受影響染色體分離改變?nèi)旧w分離改變 有核細(xì)胞：難與核的分葉鑒別有核細(xì)胞：難與核的分葉鑒別 紅細(xì)胞：最后一次分裂后將主核排出（紅細(xì)胞：最后一次分裂后將主核排出（PCE） PCE 24小時(shí)小時(shí)NCE（比（比PCE小小1/5） 灰藍(lán)色灰藍(lán)色 桔紅色桔紅色三、材料、試劑三、材料、試劑1. 試劑：受試物、陽(yáng)性物、小牛血清、試劑：受試物、陽(yáng)性物、小牛血清、染液等染液等2. 動(dòng)物動(dòng)物3. 器材器材四、步驟四、步驟1. 動(dòng)物選擇：雌雄各半動(dòng)物選擇：

32、雌雄各半2. 劑量選擇：劑量選擇：陰性、陽(yáng)性對(duì)照，陰性、陽(yáng)性對(duì)照，3-5個(gè)劑量組個(gè)劑量組高、中、低劑量組：高、中、低劑量組： 1/5、1/10、1/20 LD50最高劑量組：最高劑量組：3. 動(dòng)物分組、編號(hào)、標(biāo)記動(dòng)物分組、編號(hào)、標(biāo)記4. 動(dòng)物染毒：動(dòng)物染毒：環(huán)磷酰胺（陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)）環(huán)磷酰胺（陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)）腹腔注腹腔注射，射，20mg/kg，每組，每組2只鼠只鼠 染毒次數(shù)：兩次或多次染毒，每天染一次染毒次數(shù)：兩次或多次染毒，每天染一次5. 涂片、固定、染色：涂片、固定、染色：脫臼處死脫臼處死胸骨或胸骨或股骨股骨（股骨連接骨盆和小腿骨，取股骨保留股骨連接骨盆和小腿骨，取股骨保留股骨頭和膝蓋骨股骨頭和膝蓋骨）肌肉軟組織用紗布包上去除肌肉軟組織用紗布包上去除剪剪掉兩端，移液槍吸血清（掉兩端，移液槍吸血清（預(yù)熱預(yù)熱）1ml放離心管放離心管中中1ml注射器吸血清，鑷子夾股骨沖洗骨髓注射器吸血清，鑷子夾股骨沖洗骨髓細(xì)胞，細(xì)胞，1端沖洗端沖洗3-5次，次，2端共沖洗端共沖洗6-10次次1000rpm離心離心10min倒掉上清，留倒掉上清，留0.2-0.3ml上清上清推片推片晾干甲醇固定晾干甲醇固定30-60s吉姆薩染色吉姆薩染色10min吉姆薩工作液：蒸餾水吉姆薩工作液：蒸餾水=1:9染色缸染色缸50ml染色后沖洗無(wú)細(xì)胞的一側(cè)，顯微鏡觀察染色后沖洗無(wú)細(xì)胞的一側(cè)，顯微鏡觀察PC