水培及生理指標(biāo)的測定

1、水培前種子的處理把種子置于滅菌三角瓶中（第1天） （水洗1min）換成70%乙醇 （搖晃5min，不能太激烈）水洗2次，每次1min換成15%次氯酸鈉（5min）水洗3次，每次1min培養(yǎng)皿（雙層濾紙）室溫等種子基本露白，放4度冰箱點(diǎn)種子注意：PEG處理的要多點(diǎn)種子，因?yàn)樘幚砗蟮娜~子變蔫，質(zhì)量變小。Hoagland培養(yǎng)液100×微量元素1L2LH3BO3309.2mg0.6184gMnCl.4H2O198mg0.396gZnSO4.7H2O23mg0.046 gCuSO4.7H2O9.98mg0.01996 g(NH4)6MoO24.4H2O2.48mg0.00496 g100

2、15;鐵鹽（Fe2+）（以下用一個(gè)就行）C10H12O8M2Na2Fe1.954g/LC10H12O8M2NaFe1.839g/L1×大量元素KH2PO4136.09mg/LKNO3505.5 mg/LCa(NO3) .4H2O1.18 g/LMgSO4.7H2O492.94mg/L20×大量元素KH2PO42721.8 mg/LKNO310110 mg/LCa(NO3) .4H2O23.6 g/LMgSO4.7H2O9858.8 mg/L8×大量元素 PH5.8_6.0(KOH調(diào))1L2.5L4LKH2PO41.0887g2.72175g4.3549gKNO34

3、.044g10.11g16.176gCa(NO3) .4H2O9.44g23.6g37.76gMgSO4.7H2O3.9435g9.8587g15.774g注意：KH2PO4、KNO3、Ca(NO3) .4H2O溶完后再加MgSO4.7H2O實(shí)驗(yàn)中常用酸堿的質(zhì)量密度與濃度的關(guān)系名 稱分 子 式相對質(zhì)量質(zhì)量密度（Kg / L）百分濃度（w/w）量濃度C（粗略） ( mol·L1 )配1升1mol·L1溶液所需數(shù)（ml）鹽 酸硫 酸硝 酸冰乙酸乙 酸磷 酸氨 水氫氧化鈉溶液HC1H2SO4HNO3CH3COOHCH3COOHH3PO4NH3·H2O 36.47 98.

4、09 63.02 60.05 98.06 35.05 40.0 1.19 1.18 1.10 1.84 1.18 1.42 1.40 1.20 1.05 1.075 1.71 0.90 0.904 0.91 0.96 1.5 37.2 35.4 20.0 95.6 24.8 70.90 65.3 32.36 99.5 80.0 85.0 27.0 25.0 10.0 50.0 12.0 11.8 6.0 18.0 3.0 16.0 14.5 6.1 17.4 14.3 15.0 15.0 14.3 13.4 5.6 19.0 84 56 63 59 69.93 67 67 70 53Pro含量

5、的測定在逆境條件下（旱、鹽堿、熱、冷、凍），植物體內(nèi)脯氨酸（proline，Pro）的含量顯著增加。 用磺基水楊酸提取植物樣品時(shí)，脯氨酸便游離于磺基水楊酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加熱處理后，溶液即成紅色，再用甲苯處理，則色素全部轉(zhuǎn)移至甲苯中，色素的深淺即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波長下比色，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出（或用回歸方程計(jì)算）脯氨酸的含量。 試劑1. 酸性茚三酮溶液：將1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸（配20ml 6mol/L磷酸時(shí)，加8mL的磷酸）中，攪拌加熱（70）溶解，貯于冰箱中；2. 3磺基水楊酸：3g磺基水楊酸加蒸餾水溶解后定容至100ml；3.

6、 冰醋酸； 4. 甲苯。實(shí)驗(yàn)步驟 1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制（1）在分析天平上精確稱取25mg脯氨酸，倒入小燒杯內(nèi)，用少量蒸餾水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，此標(biāo)準(zhǔn)液中每ml含脯氨酸100g。（2）系列脯氨酸濃度的配制取6個(gè)50ml容量瓶，分別盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，各瓶的脯氨酸濃度分別為1，2，3，4，5及6g/ml。（3）取6支試管，分別吸取2ml系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加熱30min。（4）冷卻后各試管準(zhǔn)確加入4ml甲苯，振蕩30S，靜置片刻，使色素全

7、部轉(zhuǎn)至甲苯溶液。（甲苯有毒，最好帶口罩）（5）用注射器輕輕吸取各管上層脯氨酸甲苯溶液至石英比色杯中，以甲苯溶液為空白對照，于520nm波長處進(jìn)行比色。（換樣品測量時(shí)，可用甲苯或乙醇潤洗）（6）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸濃度（X）而變的回歸方程式，再按回歸方程式繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算2ml測定液中脯氨酸的含量（g/2ml）。 2. 樣品的測定（1）脯氨酸的提取：準(zhǔn)確稱取不同處理的待測植物葉片各0.5g，分別置大管中，然后向各管分別加入5ml3的磺基水楊酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取過程中要經(jīng)常搖動），冷卻后過濾于干凈的試管中，濾液即為脯氨酸的提取液。（2）吸取2ml提取液

8、于另一干凈的帶玻塞試管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮試劑，在沸水浴中加熱30min，溶液即呈紅色。（3）冷卻后加入4ml甲苯，搖蕩30S，靜置片刻，取上層液至10ml離心管中，在3000rpm下離心5min。（4）用吸管輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯為空白對照，在分光光度計(jì)上520nm波長處比色，求得吸光度值。根據(jù)回歸方程計(jì)算出（或從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出）2ml測定液中脯氨酸的含量（Xg/2ml），然后計(jì)算樣品中脯氨酸含量的百分?jǐn)?shù)。計(jì)算公式如下： 脯氨酸含量（g/g）X×5/2/樣重（g）。 測曲線的脯氨酸量2ug4ug6ug8ug10ug12ug需脯氨酸原液的量

9、20ul40ul60ul80ul100ul120ul補(bǔ)水1.98ml1.96ml1.94ml1.92ml1.90ml1.88ml丙二醛含量的測定丙二醛（MDA）是常用的膜脂過氧化指標(biāo)，在酸性和高溫度條件下，可以與硫代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)生成紅棕色的三甲川（3,5,5-三甲基惡唑2,4-二酮），其最大吸收波長在532nm。但是測定植物組織中MDA時(shí)受多種物質(zhì)的干擾，其中最主要的是可溶性糖，糖與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長在450nm，532nm處也有吸收。植物遭受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫時(shí)可溶性糖增加，因此測定植物組織中MDATBA反應(yīng)物質(zhì)含量時(shí)一定要排除可溶性糖的干擾。低濃度的鐵離子能

10、夠顯著增加TBA與蔗糖或MDA顯色反應(yīng)物在532、450nm處的消光度值，所以在蔗糖、MDA與TBA顯色反應(yīng)中需一定量的鐵離子，通常植物組織中鐵離子的含量為100300g/g DW，根據(jù)植物樣品量和提取液的體積，加入Fe3的終濃度為0.5mol/L。 A. 直線回歸法 MDA與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450nm波長下的消光度值為零。不同濃度的蔗糖（025mmol/L）與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450nm的消光度值與532nm和600nm處的消光度值之差成正相關(guān)，配制一系列濃度的蔗糖與TBA顯色反應(yīng)后，測定上述三個(gè)波長的消光度值，求其直線方程，可求算糖分在532nm處的消光度值。UV-120型紫外可見分

11、光光度計(jì)的直線方程為：Y5320.001980.088D450 B雙組分分光光度計(jì)法據(jù)朗伯-比爾定律：DkCL，當(dāng)液層厚度為1cm時(shí)，k=D/C，k稱為該物質(zhì)的比吸收系數(shù)。當(dāng)某一溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)時(shí)，某一波長下的消光度值等于此混合液在該波長下各顯色物質(zhì)的消光度之和。 已知蔗糖與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450nm和532nm波長下的比吸收系數(shù)分別為85.40，7.40。MDA在450nm波長下無吸收，故該波長的比吸收系數(shù)為0，532nm波長下的比吸收系數(shù)為155，根據(jù)雙組分分光度計(jì)法建立方程組，求解方程得計(jì)算公式：C1(mmol/L)=11.71D450 C2(mol/L)=6.45(D532D6

12、00)0.56D450 式中 C1為可溶性糖的濃度；C2為MDA的濃度；D450、D532、D600分別代表450nm、532nm和600nm波長下的消光度值。試劑： 10%三氯乙酸（TCA）；0.6%硫代巴比妥酸，先加少量的氫氧化鈉（1mol/L）溶解，再用10的三氯乙酸定容；石英砂。（加10%TCA時(shí)，要緩慢加，避免形成沉淀。） 步驟 1. MDA的提取 稱取剪碎的試材1g，液氮研碎，加入2ml 10TCA研磨至勻漿，再加8ml TCA進(jìn)一步研磨，勻漿離心（4000×g）10min，上清液為樣品提取液。 2. 顯色反應(yīng)和測定 吸取離心的上清液2ml（對照加2ml蒸餾水），加入2m

13、l 0.6%TBA溶液，混勻物于沸水浴上反應(yīng)15min，迅速冷卻后再離心。取上清液測定532nm、600nm和450nm波長下的消光度。 3. 計(jì)算含量 (1) 直線方程法 按公式求出樣品中糖分在532nm處的消光度值Y532，用實(shí)測532nm的消光度值減去600nm非特異吸收的消光度值再減去Y532，其差值為測定樣品中MDA-TBA反應(yīng)產(chǎn)物在532nm的消光度值。按MDA在532nm處的毫摩爾消光系數(shù)為155換算求出提取液中MDA濃度。 (2) 雙組分分光光度法 按公式可直接求得植物樣品提取液中MDA的濃度。 用上述任一方法求得MDA的濃度，根據(jù)植物組織的重量計(jì)算測定樣品中MDA的含量：MD

14、A（mol/g FW）土壤含水量的測定烘干法烘干法是唯一可以直接測量土壤水分方法，也是目前國際上的標(biāo)準(zhǔn)方法。（1）取洗凈的編有號碼的有蓋鋁盒（或玻璃稱量瓶），放在1052的烘箱中烘干，用坩堝鉗取出放入干燥器中冷卻，在天平（感量0.01g、0.0001g）上稱得其恒重（A）。一般測定土壤自然含水量，使用感量0.01g天平，測定風(fēng)干土樣使用感量0.0001g天平。（2）用牛角勺將約5.0g土樣，均勻地平鋪在鋁盒中，準(zhǔn)確稱重（B）.（3）將敞開蓋子的鉛盒放入1052的恒溫烘箱中，鉛盒蓋放在鋁盒的旁側(cè)或傾斜放在稱量瓶上。烘6h左右。（4）用坩堝鉗將鋁盒取出，蓋上蓋子，置鋁盒于干燥器中2030min，冷

15、卻到室溫，稱重。啟開鋁盒蓋，在烘2h，冷卻，稱至恒重（C）即前后兩次稱重之差不大于3mg。5.結(jié)果計(jì)算土壤吸濕水的含量（W）=×100%式中 A鋁盒的重量（g） B土樣與鋁盒的重量（g） C烘干土與鋁盒的重量（g）注：平行測定結(jié)果的相差，水分小于5%的風(fēng)干土樣不得超過0.2%，水分為5%25%的潮濕土樣不得超過0.3%，水分大于15%的大粒黏重潮濕土壤不得超過0.7%。土壤含水量 (water content of soil)是土壤中所含水分的數(shù)量。一般是指土壤絕對含水量，即100g烘干土中含有若干克水分，也稱土壤含水率。用土鉆采取土樣，用 0.1g 精度的天平稱取土樣的重量，記作土

16、樣的濕重 M，在 105的烘箱內(nèi)將土 樣 烘 68 小 時(shí) 至 恒 重 ， 然 后 測 定 烘 干 土 樣 ， 記 作 土 樣 的 干 重 Ms土壤含水量=（烘干前鋁盒及土樣質(zhì)量-烘干后鋁盒及土樣質(zhì)量）/（烘干后鋁盒及土樣質(zhì)量-烘干空鋁盒質(zhì)量）*100%植物可溶性糖(soluble sugar)測定:蒽酮比色法糖在硫酸的作用下生成糠醛，糠醛再與蒽酮作用，形成一種綠色的絡(luò)合物。在低濃度時(shí)，625nm的OD值與糖含量成正相關(guān)。該實(shí)驗(yàn)方法簡便，但沒有專一性，對于絕大部分的碳水化合物都能與蒽酮反應(yīng)，產(chǎn)生顏色。實(shí)驗(yàn)用品721型分光光度計(jì)，分析天平，研缽，恒溫水浴鍋，燒杯，刻度試管，大試管，移液管，漏斗，

17、玻璃棒，試管架，吸耳球，濾紙 試劑：活性炭，酒精（80%） 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液： 稱取已在80烘箱中烘至恒重葡萄糖100mg,配制成500mL溶液，即得每mL含糖為200g的標(biāo)準(zhǔn)溶液。蒽酮試劑：稱取1g經(jīng)過純化的蒽酮，溶解于1000mL稀硫酸中即得。稀硫酸溶液由760mL濃硫酸（比重1.84）稀釋成1000mL而成。實(shí)驗(yàn)步驟1.可溶性糖的提?。悍Q取0.5g的新鮮植物葉片，于研缽中加80%酒精4ml，仔細(xì)研磨成勻漿，倒入離心管內(nèi)，置于80水浴中不斷攪拌30min，離心10分鐘(5000轉(zhuǎn)/min)，收集上清液于10ml的刻度試管中，其殘?jiān)?ml80%酒精重復(fù)提1次，合并上清液。在上清液中加0.5g

18、活性炭，80水浴脫色30min，定容至10ml，過濾后取濾液(稀釋10倍或20倍后)測定。2.顯色及比色：吸取上述糖提取液1mL， 放入一干潔的試管中，加蒽酮試劑5mL混合之，于沸水浴中煮沸10分鐘，取出冷卻，然后于分光光度計(jì)上進(jìn)行測定，波長為625nm，測得吸光度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得濾液中得糖含量（或經(jīng)直線回歸公式計(jì)算），然后再行計(jì)算樣品中含糖百分?jǐn)?shù)。3.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液將其稀釋成一系列不同濃度的溶液，濃度分別為每mL含糖0、30、60、90、120、150、180g。按上述方法分別測得其吸光度，然后繪制A625糖濃度曲線，或進(jìn)行直線回歸求得直線方程。試劑（ml) 管號 1 2 3 4 5 6 7葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 0 0.15 0.3 0.45 0.6 0.75 0.980%酒精 1.0 0.85 0.7 0.55 0.4 0.25 0.1蒽酮-硫酸試劑 5 5 5 5 5 5 5葡萄糖濃度（ul/ml) 0 30 60 90 120 150 180樣品中含糖量：設(shè)V為植物樣品稀釋后的體積（m L）；C為提取液的含糖量(g/ m L)；W為植物組織鮮重(g)可溶性糖含量( C