細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)

1、METHODS AND TECHNIQUES本章內(nèi)容提要 第一節(jié)第一節(jié) 顯微鏡技術(shù)顯微鏡技術(shù) 一、光學(xué)顯微鏡一、光學(xué)顯微鏡 二、電子顯微鏡二、電子顯微鏡 三、顯微操作技術(shù)三、顯微操作技術(shù) 第二節(jié)第二節(jié) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù) 第三節(jié)第三節(jié) 細(xì)胞分離技術(shù)細(xì)胞分離技術(shù) 第四節(jié)第四節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞雜交細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞雜交第一節(jié) 顯微技術(shù)光學(xué)顯微鏡與電子顯微鏡、光學(xué)顯微鏡（一）普通光學(xué)顯微鏡1. 構(gòu)成： 照明系統(tǒng) 光學(xué)放大系統(tǒng) 機(jī)械裝置2. 原理：經(jīng)物鏡形成倒立實(shí)像，經(jīng)目鏡放大成虛像。Structure of Microscope3. 分辨力：指分辨物體最小間隔的能力。 光學(xué)

2、顯微鏡的分辨力光學(xué)顯微鏡的分辨力 R=0.61/NA 其中其中為入射光線波長；為入射光線波長； NA為鏡口率為鏡口率 sin/2； n=介質(zhì)折射率； =鏡口角（樣品對(duì)物鏡鏡口的張角） 。表一 幾種介質(zhì)的折射率顯微鏡的幾個(gè)光學(xué)特點(diǎn)：顯微鏡的幾個(gè)光學(xué)特點(diǎn)： 介質(zhì)折射率越接近鏡頭玻璃的（ 1. 7 ）越好； sin /2的最大值小于1；鏡口率最大約1.6； 普通光線的波長為400700nm，光鏡分辨力約為0.2m，人眼的分辨力為0.2mm，因此顯微鏡的最大有效倍數(shù)為1000X。倒置顯微鏡 inverse microscope 物鏡與照明系統(tǒng)顛倒； 用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，通常具有相差或DIC物鏡，有的

3、還具有熒光裝置。 （二）熒光顯微鏡 Fluorescence microscope特點(diǎn)：光源為短波光；有兩個(gè)特殊的濾光片；照明方式通常為落射式。Fluorescence image, DNA in blue and Microtubules in green 用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。（三）相差顯微鏡 把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個(gè)特殊之處。 環(huán)形光闌（annular diaphragm）：位于光源與聚光器之間。1. 相位板（annular ph

4、aseplate）：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4。（四）暗視野顯微鏡 dark field microscope 聚光鏡中央有擋光片，視野背景是黑的，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，物體邊緣是亮的。 可觀察 4200nm的微粒子，分辨率比普通顯微鏡高50倍。用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本。（五）激光共聚焦掃描顯微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM 用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描； 能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)； 分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍； 用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。las

5、er confocal scanning microscope, LCSM激光共聚焦掃描顯微鏡光路圖LCSM Image of a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue) /（六）當(dāng)代顯微鏡的發(fā)展趨勢 采用組合方式，集普通光鏡、相差、熒光、暗視野、DIC、攝影裝置于一體； 自動(dòng)化與電子化。二、電子顯微鏡（一）透射電子顯微鏡一）透射電子顯微鏡transmission electron microscope, TEM1. 原理 以電子束作光源，

6、電磁場作透鏡。電子束波長與加速電壓(通常50120KV)的平方根成反比； 由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成； 分辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達(dá)百萬倍； 用于觀察超微結(jié)構(gòu)（小于0.2m）。表二、不同光線的波長TEM LIGHT PATHWAYTRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE，TEM2. 制樣技術(shù)1）超薄切片）超薄切片 超薄切片厚度僅50nm左右，用超薄切片機(jī)（ultramicrotome）制作。 通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式切片，重金屬（鈾、鉛）鹽染色。2）負(fù)染技術(shù) 用重金

7、屬鹽(如磷鎢酸) 染色；吸去染料干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸的出地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果，分辨力可達(dá)1.5nm左右。Negative Stained Archaebacteria 3）冰凍蝕刻 freeze-etching亦稱冰凍斷裂。標(biāo)本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開，升溫后，冰升華，暴露斷面結(jié)構(gòu)。向斷面噴涂一層蒸汽鉑和碳。然后將組織溶掉，把鉑和碳的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜（replica）。an onion root tip cell with no etching. 斷面的三種處理方法： 蝕刻（ etching ）、不蝕刻（no etching ）、深度蝕刻（deep

8、 etching ）培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)面的深度蝕刻電鏡照片，示 Clathrin衣被（二）掃描電子顯微鏡 20世紀(jì)60年代問世，用來觀察標(biāo)本表面結(jié)構(gòu)； 分辨力為610nm，因人眼的分辨力（區(qū)別熒光屏上距離最近兩個(gè)光點(diǎn)的能力）為0.2mm，掃描電鏡的有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000X。Scanning electron microscope（ SEM） 工作原理：是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級(jí)電子，次級(jí)電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級(jí)電子由探測器收集，信號(hào)經(jīng)放大用來調(diào)制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。 為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級(jí)電子，標(biāo)本在固定、脫水

9、后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級(jí)電子信號(hào)。SEM LIGHT PATHWAY人類紅細(xì)胞人類紅細(xì)胞酵母酵母人類精子人類精子三、顯微操作技術(shù)micromanipulation technique 是在倒置顯微鏡下利用顯微操作器進(jìn)行細(xì)胞或早期胚胎操作的一種方法。 包括細(xì)胞核移植、顯微注射、嵌合體技術(shù)、胚胎移植以及顯微切割等。 細(xì)胞核移植技術(shù)已有幾十年的歷史，1952 年，Briggs和King等將不同階段的蛙胚細(xì)胞核注入去核的蛙卵，構(gòu)建核移植胚。Gordon（1962）證明原腸胚以后的細(xì)胞核移植能發(fā)育到成體。1997年，Wilmut等克隆了綿羊Dolly。 顯微操作儀顯微操作

10、儀轉(zhuǎn)基因顯微操作過程 第二節(jié) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色方法用于對(duì)某些細(xì)胞成分進(jìn)行定性和定位研究。（一）固定（一）固定物理固定：血膜空氣干燥、冷凍干燥。1. 化學(xué)固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和鋨酸等試劑。顯示多糖常用乙醇固定，顯示酶類多用甲醛丙酮緩沖液固定。一、細(xì)胞化學(xué)技術(shù)一、細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（二）顯示方法金屬沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應(yīng)產(chǎn)物最終生成CoS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。Schiff反應(yīng)：醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變?yōu)榧t色。用于顯示糖和脫氧核糖核酸（Feulgen反應(yīng)）。聯(lián)苯胺反應(yīng)：過氧化酶分解H202。產(chǎn)生新生氧，后者再將無色聯(lián)

11、苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍(lán)，進(jìn)而變成棕色化合物。脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。茚三酮反應(yīng)：顯示蛋白質(zhì)。二、免疫細(xì)胞化學(xué) immunocytochemistry 是利用抗體同特定抗原專一結(jié)合的原理，對(duì)抗原進(jìn)行定位測定的技術(shù)。常用的標(biāo)記物有熒光素和酶。 免疫熒光法（immunofluorescent technique）：如異硫氰酸熒光素、羅丹明等。 酶標(biāo)免疫法（enzyme-labeled antibody method）：如辣根過氧化物酶。三、放射自顯影術(shù) 用于研究標(biāo)記化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等等。 原理：將放射性同位素標(biāo)記的化合物導(dǎo)

12、入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時(shí)間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)放射性曝光，使乳膠感光。 一般用14C和3H標(biāo)記。常用3H-TDR來顯示DNA，用3H-UDR顯示RNA；用3H氨基酸研究蛋白質(zhì)，用3H甘露糖、3H巖藻糖研究多糖。14C半衰期為5730年，3H為12.5年。免疫組化染色結(jié)果四、分子雜交技術(shù) 具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)條件下，通過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來測定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補(bǔ)關(guān)系。 （一）原位雜交（一）原位雜交（in situ hybridization）。）。 用于檢測染色體上的特殊D

13、NA序列。最初是使用放射性DNA探針，后來又發(fā)明了免疫探針法。人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片 第三節(jié) 細(xì)胞分離技術(shù)一、離心技術(shù) 是分離細(xì)胞器及各種大分子基本手段。 轉(zhuǎn)速1025kr/min的離心機(jī)稱為高速離心機(jī)。 轉(zhuǎn)速25kr/min，離心力89Kg者稱為超速離心機(jī)。 超速離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá)100000r/min，離心力超過500kg。 （一）差速離心 Differential centrifugation 特點(diǎn)： 介質(zhì)密度均一； 速度由低向高，逐級(jí)離心。 用途：分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。 沉降順序：核線粒體溶酶體與過氧化物酶體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體核蛋白體。 可將細(xì)胞器初步分離，常需

14、進(jìn)一步通過密度梯離心再行分離純化。 Low speedHigh speedDifferential centrifugation（二）密度梯度離心 用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過離心力場的作用使細(xì)胞和細(xì)胞成分分層、分離。 類型：速度沉降、等密度沉降。 常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。 分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求： 1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時(shí)，粘度不高； 2）PH中性或易調(diào)為中性； 3）濃度大時(shí)滲透壓不大； 4）對(duì)細(xì)胞無毒。Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation二、流式細(xì)胞術(shù) 用途：對(duì)單個(gè)

15、細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析與分選快速定量分析與分選的一門技術(shù)。 原理：包在鞘液中的細(xì)胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個(gè)細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，送入計(jì)算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分離純度可達(dá)99%。包被細(xì)胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細(xì)胞計(jì)（flow cytometer）。第四節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞雜交（一）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 群體培養(yǎng)群體培養(yǎng)（mass culture）：將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長，匯合（confluence）后形成均勻的單細(xì)胞層； 克隆培養(yǎng)克隆培養(yǎng)（clonal

16、culture）：培養(yǎng)高度稀釋的細(xì)胞懸液，細(xì)胞貼壁生長，每一個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)細(xì)胞集落，稱為克隆。一、細(xì)胞培養(yǎng)一、細(xì)胞培養(yǎng)群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右） 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng) （primary culture）：即：培養(yǎng)來自動(dòng)物機(jī)體的細(xì)胞群。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的容器中培養(yǎng)稱為傳代或傳代培養(yǎng)（passage），每代細(xì)胞分裂約3-6次。細(xì)胞系細(xì)胞系（cell line）：原代培養(yǎng)細(xì)胞成功傳代即為細(xì)胞系。細(xì)胞株細(xì)胞株（cell strain）：從培養(yǎng)細(xì)胞中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群。 克隆克隆（clone）：亦稱無性系。指由同一個(gè)祖先細(xì)胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。表三、實(shí)驗(yàn)室中常用的幾種細(xì)

17、胞系細(xì)胞系名稱細(xì)胞類型來源3T3成纖維細(xì)胞小鼠HeLa宮頸癌上皮細(xì)胞Henrietta Lacks BHK21成纖維細(xì)胞敘利亞倉鼠PtKl上皮細(xì)胞袋鼠L6成肌細(xì)胞大鼠PCI2嗜鉻細(xì)胞大鼠SP2漿細(xì)胞小鼠SP20骨髓瘤漿細(xì)胞小鼠CHO卵巢細(xì)胞中國地鼠Henrietta Lacks, American black ,died of cancer of uterine cervix in 1951 （二）植物細(xì)胞培養(yǎng)外植體培養(yǎng)外植體培養(yǎng)：誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織。用于研究植物的生長發(fā)育、分化和變異；進(jìn)行無性繁殖；制取代謝產(chǎn)物。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)：適合于進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，制取植物代謝產(chǎn)物。原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)：培養(yǎng)脫壁后的細(xì)胞，特點(diǎn)：比較容易攝取外來的遺傳物質(zhì)，如DNA；便于進(jìn)行細(xì)胞融合，形成雜交細(xì)胞；適宜條件下可產(chǎn)生細(xì)胞壁，經(jīng)誘導(dǎo)分化成完整植株。單倍體培養(yǎng)單倍體培養(yǎng)：通過花藥或花粉培養(yǎng)可獲得單倍體植株。Plant Cell CultureAnimal Cell Culture二、細(xì)胞融合 通過培養(yǎng)和介導(dǎo)，兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞合并成一個(gè)雙核或多核細(xì)胞的過程稱為細(xì)胞融合（cell fusion）或細(xì)胞雜交。 同核體同核體：相同基因型的細(xì)胞融合而成。 異核體：異核體：不同基因型的細(xì)胞融合