限制性核酸內(nèi)切酶(2)

1、限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶一、概念概念核酸酶：催化核酸酯鍵的水解 。核酸外切酶:作用于核酸鏈的末端（3端 或 5端),逐個水解下核苷酸。核酸內(nèi)切酶：從核酸分子內(nèi)部切斷3,5-磷酸二脂鍵。限制性內(nèi)切酶：在細菌細胞內(nèi)存在的一類能識別并水解外源雙鏈DNA的核酸內(nèi)切酶，可用于特意切割DNA,常作為工具酶。特性特性I I類內(nèi)切酶類內(nèi)切酶IIII類內(nèi)切酶類內(nèi)切酶IIIIII類內(nèi)切酶類內(nèi)切酶限制和修飾活限制和修飾活性性單一多功能的酶單一多功能的酶內(nèi)切酶和甲基化內(nèi)切酶和甲基化酶分開酶分開共同亞基的雙共同亞基的雙功能酶功能酶內(nèi)切酶的蛋白內(nèi)切酶的蛋白結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)3 3種不同的亞基種不同的亞基單一成分單一成分2

2、2種不同的種不同的亞基亞基限制作用所需限制作用所需要的輔助因子要的輔助因子ATPATP、 MgMg2+2+和和SAMSAMMgMg2+2+ ATPATP、MgMg2+2+和和SAMSAM寄主特異性位寄主特異性位點識別序列點識別序列EcoBEcoB：TGA(N)TGA(N)8 8TGCT TGCT EcoKEcoK：AAC(N)AAC(N)6 6GTGCGTGC回文序列回文序列 （IIsIIs型除外）型除外）EcoP1:AGACC EcoP1:AGACC EcoP15:CAGC EcoP15:CAGC AG AG切割位點切割位點在距離識別位點至在距離識別位點至少少1000bp 1000bp 處隨

3、機切開一條單處隨機切開一條單鏈。鏈。位于寄主特異位于寄主特異性位點或其附性位點或其附近近距寄主特異性位距寄主特異性位點點33端端2426bp2426bp處處酶催轉(zhuǎn)換酶催轉(zhuǎn)換不能不能能能能能DNADNA易位作用易位作用能能不能不能不能不能甲基化作用的位點甲基化作用的位點寄主特異性位點寄主特異性位點寄主特異性位寄主特異性位點點寄主特異性位點寄主特異性位點識別未甲基化的序列進識別未甲基化的序列進行切割行切割能能能能能能序列特異的切割序列特異的切割不是不是是是是是基因工程中的用途基因工程中的用途無用無用十分有用十分有用用途不大用途不大 限制性內(nèi)切酶以環(huán)狀或線性的雙鏈DNA為底物，在合適的反應條件下，識

4、別特定的核苷酸序列，使兩條核糖鏈上特定位置的磷酸二酯鍵斷裂，兩裂口之間的堿基對的氫鍵也隨之斷開，產(chǎn)生具有3-羥基和5-磷酸基的DNA片段。 EcoR的識別序列 GAATTC CTTAAG Hind 的識別序列 AAGCTT TTCGAA BamH的識別序列 GCATCC CCTAGG 從以上舉例的各種限制性酶切酶的識別序列看出，它們具有共同的規(guī)律性，呈旋轉(zhuǎn)對稱或二重互補對稱。 有的限制性酶切酶可識別兩種以上的核酸序列。 另外有一些限制性酶切酶隨然來源不同，但是具有相同的識別序列，這樣的限制性內(nèi)切酶被稱為同裂酶同裂酶。 同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點

5、一般不能再被原來的酶識別。一般不能再被原來的酶識別。五 限制性酶切酶切割DNA的位點從切割位點處切開雙鏈DNA，形成粘性末端（sticky end）或平齊末端（blunt end）。EcoR I 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 Pst I 5-CTGCAG-3 3-GACGTC-5 產(chǎn)生粘性末端產(chǎn)生粘性末端EcoR V 5-GATATC-3 3-CTATAG-5 產(chǎn)生平齊末端產(chǎn)生平齊末端 DNA DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDSSDS、EDTAEDTA等都會影響酶的活性。等都會影響酶的活性。 1. DNA1. DNA的純度的純度 純化

6、純化DNA DNA 加大酶的用量加大酶的用量 延長酶催化反應的保溫時間延長酶催化反應的保溫時間 擴大反應體積（擴大反應體積（2020 l l）一般采取以下措施一般采取以下措施大腸桿菌一般有兩種甲基化酶修飾質(zhì)粒大腸桿菌一般有兩種甲基化酶修飾質(zhì)粒dam甲基化酶（修飾甲基化酶（修飾GATC中的中的A）；）； dcm甲基化酶（修飾甲基化酶（修飾CCA/TGG的的C）。）?；蚬こ讨斜仨毷褂眉谆甘Щ钔蛔兓蚬こ讨斜仨毷褂眉谆甘Щ钔蛔兊木辍５木?。 不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應溫度不同。大不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應溫度不同。大多數(shù)是多數(shù)是3737o oC C，少數(shù)要求，少數(shù)要求40-6540-

7、65o oC C。酶酶最適最適溫度溫度o oC C酶酶最適最適溫度溫度o oC C酶酶最適最適溫度溫度o oC CApa I Apa I Bcl I Bcl I Mae II Mae II Taq ITaq I30 30 50 50 50 50 6565Apy I Apy I BstE II BstE II Mae IIIMae III30 30 60 60 5555Ban I Ban I Mae I Mae I Sma ISma I50 50 45 45 2525 DNADNA分子的不同構(gòu)型對限制性內(nèi)切酶分子的不同構(gòu)型對限制性內(nèi)切酶的活性也有很大的影響。某些限制性核酸的活性也有很大的影響。某

8、些限制性核酸內(nèi)切酶切割超螺旋的質(zhì)粒內(nèi)切酶切割超螺旋的質(zhì)粒DNADNA所需要的酶量所需要的酶量要比消化線性的要比消化線性的DNADNA量高出很多倍。量高出很多倍。是影響限制酶活性的重要因素。是影響限制酶活性的重要因素。商品化的限商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。制酶一般都帶有專用緩沖液?；瘜W組成化學組成MgClMgCl2 2、NaCl/KClNaCl/KCl：提供：提供MgMg2+2+和離子強度和離子強度Tris-HClTris-HCl：維持：維持pHpH二硫蘇糖醇（二硫蘇糖醇（DTTDTT）：保持酶穩(wěn)定性）：保持酶穩(wěn)定性牛血清白蛋白牛血清白蛋白BSABSA等：有助于酶的穩(wěn)定等：有助于酶的穩(wěn)定如果改變反應條件就會影響酶的專一性和切割效率，稱為星號活性。如果改變反應條件就會影響酶的