瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)(4)

1、瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)血涂片檢查瘧原蟲是診斷和鑒定瘧原蟲種別血涂片檢查瘧原蟲是診斷和鑒定瘧原蟲種別的主要方法，也是瘧疾流行病學(xué)調(diào)查的重的主要方法，也是瘧疾流行病學(xué)調(diào)查的重要部分，血涂片制作和染色的好壞足以影要部分，血涂片制作和染色的好壞足以影響檢查的結(jié)果，必須把握好響檢查的結(jié)果，必須把握好“三關(guān)三關(guān)”。 玻片清潔。清潔的玻片無(wú)油脂，無(wú)劃痕，玻片清潔。清潔的玻片無(wú)油脂，無(wú)劃痕，無(wú)灰塵，玻片上有油跡，使厚血膜容易脫落，無(wú)灰塵，玻片上有油跡，使厚血膜容易脫落，薄血膜涂布不均勻。在用手指持玻片時(shí)，只薄血膜涂布不均勻。在用手指持玻片時(shí)，只能夾持玻片的兩側(cè)邊緣，不要接觸玻片的表能夾持玻片的兩側(cè)邊緣，

2、不要接觸玻片的表面，以避免手指上的油污染玻片。面，以避免手指上的油污染玻片。一、玻片清潔一、玻片清潔 新的載玻片先用熱肥皂水洗滌，再用清新的載玻片先用熱肥皂水洗滌，再用清水沖洗，然后用軟而潔凈的毛巾擦干待用。水沖洗，然后用軟而潔凈的毛巾擦干待用。5%5%的肥皂水煮沸法：的肥皂水煮沸法： 將洗衣肥皂削成小片，加水配成約將洗衣肥皂削成小片，加水配成約5%5%的的肥皂水，煮沸后將玻片一張一張地平放進(jìn)肥肥皂水，煮沸后將玻片一張一張地平放進(jìn)肥皂水內(nèi)，微火煮約一刻鐘，然后滅火待肥皂皂水內(nèi)，微火煮約一刻鐘，然后滅火待肥皂水稍冷后，將潔干毛巾擦凈后待用。水稍冷后，將潔干毛巾擦凈后待用。( (二二) )使用過(guò)的

3、載玻片的清潔方法有兩種：使用過(guò)的載玻片的清潔方法有兩種：清潔液浸泡法：清潔液浸泡法：清潔液配制如下：清潔液配制如下： 重鉻酸鉀重鉻酸鉀 8080g 濃硫酸濃硫酸 100ml100ml 水水( (清凈水清凈水)1000ml)1000ml二、制片二、制片1.1.薄血膜涂制薄血膜涂制2.2.厚血膜涂制厚血膜涂制 薄血膜薄血膜 厚血膜厚血膜 標(biāo)記處標(biāo)記處1.1.薄血膜涂制：薄血膜涂制：1.1.薄血膜涂制薄血膜涂制(1)(1)先用先用75%75%酒精棉球?qū)⒍瓜?，待酒精干后用采酒精棉球?qū)⒍瓜荆凭珊笥貌裳樠杆俅倘攵菇露诉吘壧?。血針迅速刺入耳垂近下端邊緣處?2)(2)用左手的拇指與食指以

4、及右手的中指向相對(duì)的方用左手的拇指與食指以及右手的中指向相對(duì)的方向?qū)⒍馆p輕擠壓出血。向?qū)⒍馆p輕擠壓出血。(3)(3)取一張潔凈的載玻片，將它的左取一張潔凈的載玻片，將它的左1/31/3的表面接觸的表面接觸耳垂上的血滴（不要將玻片接觸耳垂上的皮膚），耳垂上的血滴（不要將玻片接觸耳垂上的皮膚），使一小滴血在玻片上。血量使一小滴血在玻片上。血量1-1.51-1.5mmmm3 3 .1/4 .1/4火柴頭火柴頭大小。大小。 薄血膜涂好后，再輕擠耳垂擠出約火柴頭大一血薄血膜涂好后，再輕擠耳垂擠出約火柴頭大一血滴，將這一滴血滴在玻片的中心滴，將這一滴血滴在玻片的中心1/31/3處然后用推片的處然后用推

5、片的一角由血滴中央向周圍旋轉(zhuǎn)涂成直徑約一厘米的圓形一角由血滴中央向周圍旋轉(zhuǎn)涂成直徑約一厘米的圓形血膜，旋轉(zhuǎn)涂制時(shí)間不宜過(guò)短，以免形成纖維蛋白束，血膜，旋轉(zhuǎn)涂制時(shí)間不宜過(guò)短，以免形成纖維蛋白束，遮蓋了瘧原蟲。遮蓋了瘧原蟲。 厚血薄涂好后，應(yīng)平放待干，防蒼蠅舔食血膜厚血薄涂好后，應(yīng)平放待干，防蒼蠅舔食血膜或灰塵落在上面。受檢者的編號(hào)可用鉛筆或鋼筆寫在或灰塵落在上面。受檢者的編號(hào)可用鉛筆或鋼筆寫在薄血膜的邊緣上，也可用蠟筆寫在厚血膜一端。薄血膜的邊緣上，也可用蠟筆寫在厚血膜一端。血片制作和染色質(zhì)量規(guī)范 項(xiàng)目血 膜好中差血片制作 厚血量位置直徑外觀4.05.0mm3玻片右1/381.0cm圓形厚膜均勻

6、，邊緣整齊略多或略少稍偏右0.70.8或1.01.2cm圓形稍不均不整齊過(guò)多或過(guò)少偏右過(guò)多0.7或1.2cm厚薄不勻影響著色薄血量位置長(zhǎng)寬外觀1.52.0 mm3玻片1/21/3處1.52.0cm舌狀厚薄均勻略多或略少稍偏右或偏左稍大或稍小舌狀稍不勻過(guò)多或過(guò)少偏右或偏左過(guò)多過(guò)大或過(guò)小厚薄不勻呈波浪型染色外觀鏡下蘭紫色白細(xì)胞瘧原蟲漿呈蘭色，核深紅深蘭色胞漿淡蘭或深蘭，核紅色紅色或灰白色胞漿不易見(jiàn)，核淡紅或蘭色清潔度外觀鏡下光潔無(wú)油灰無(wú)沉渣稍有油污稍有沉渣油灰粘連沉渣多或有雜菌 血片制作和染色質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn) 1.血片制作質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)： 好：厚薄血膜均好，或薄血膜好，厚血膜中。 中：薄血膜中，厚血膜好

7、或中。 差：薄血膜差，或厚薄血膜均差。 2.血片制作和染色合格率要求：分別以血片制作、染色和清潔度的好、中、差合并計(jì)算合格率。 (1)血片制作合格率應(yīng)在85%以上。 (2)染色合格率應(yīng)在85%以上。 (3)清潔度合格率應(yīng)在80%以上。三、染色三、染色 常用的染色方法有姬姆薩氏和瑞氏兩種常用的染色方法有姬姆薩氏和瑞氏兩種 ( (一一) )吉氏染色法：吉氏染色法： 吉氏染劑是最可靠的血膜染劑，其優(yōu)點(diǎn)是吉氏染劑是最可靠的血膜染劑，其優(yōu)點(diǎn)是易于掌握很少染色過(guò)度，染好后的血膜褪色較易于掌握很少染色過(guò)度，染好后的血膜褪色較慢慢. . 為了保證染色良好，使瘧原蟲的紅核和蘭胞漿分明，為了保證染色良好，使瘧原蟲

8、的紅核和蘭胞漿分明，感染的紅血球上的薛氏小點(diǎn)清楚，在稀釋染劑原液時(shí)，感染的紅血球上的薛氏小點(diǎn)清楚，在稀釋染劑原液時(shí)，所用的蒸餾水必須加緩沖液（緩沖蒸餾水）。新鮮蒸餾所用的蒸餾水必須加緩沖液（緩沖蒸餾水）。新鮮蒸餾水可能接近中性，但貯存在一個(gè)時(shí)期后，由于吸收了空水可能接近中性，但貯存在一個(gè)時(shí)期后，由于吸收了空氣中的二氧化碳而變?yōu)樗嵝?，因此蒸餾水中必須加緩沖氣中的二氧化碳而變?yōu)樗嵝?，因此蒸餾水中必須加緩沖液，使其達(dá)到我們需要的酸堿度。液，使其達(dá)到我們需要的酸堿度。稀釋染劑所用的蒸餾水的稀釋染劑所用的蒸餾水的phph以以7.0-7.27.0-7.2為最適宜，現(xiàn)用為最適宜，現(xiàn)用現(xiàn)配，可按下表配制：現(xiàn)配

9、，可按下表配制：緩沖蒸餾水的配制（緩沖蒸餾水的配制（mlml） ph ph 磷酸二氫鈉液磷酸二氫鉀液蒸餾水磷酸二氫鈉液磷酸二氫鉀液蒸餾水 6.66.637376363900900 6.86.849495151900900 7.07.063633737900900 7.27.273732727900900 7.47.481811919900900 在無(wú)條件的地方，此時(shí)也可用當(dāng)?shù)氐娘嬘盟蠓羞^(guò)在無(wú)條件的地方，此時(shí)也可用當(dāng)?shù)氐娘嬘盟蠓羞^(guò)濾后試染，試染結(jié)果如淋巴細(xì)胞的胞漿呈蘭色紅血濾后試染，試染結(jié)果如淋巴細(xì)胞的胞漿呈蘭色紅血球染色不很蘭就可使用。球染色不很蘭就可使用。 3.3.染色步驟染色步驟：固定

10、：用吉氏染液染色須先將薄血膜用甲醇或無(wú)水酒精固固定：用吉氏染液染色須先將薄血膜用甲醇或無(wú)水酒精固定。滴于薄血膜上，也可用玻棒沾取甲醇涂在薄血膜上，定。滴于薄血膜上，也可用玻棒沾取甲醇涂在薄血膜上，避免甲醇流至厚血膜，誤將其固定，可用蠟筆劃一條線，避免甲醇流至厚血膜，誤將其固定，可用蠟筆劃一條線，或者是斜放玻片，玻片上的甲醇蒸發(fā)干后即可染色?；蛘呤切狈挪Ｆ?，玻片上的甲醇蒸發(fā)干后即可染色。溶解血紅蛋白，在厚血膜上加溶解血紅蛋白，在厚血膜上加2-32-3滴蒸餾水，待血紅蛋白滴蒸餾水，待血紅蛋白充分溶解后傾去玻片上的水，待血膜干后即可染色。充分溶解后傾去玻片上的水，待血膜干后即可染色。染色：染色： 快

11、染：快染：5 5：1(20%)1(20%)，5 5滴水，滴水，1 1滴染液滴染液( (原液原液) )，染，染5 5分鐘清水分鐘清水沖洗即成。沖洗即成。 慢染：慢染：2020：1(5%)1(5%)，2020滴水，滴水，1 1滴染液滴染液( (原液原液) )，染，染3030分鐘用分鐘用清水沖洗。清水沖洗。 待片水干后鏡檢。待片水干后鏡檢。( (二二) )瑞氏染色法：瑞氏染色法： 瑞氏染劑粉瑞氏染劑粉 0.2g0.2g 甘油甘油( (中性中性) 3) 3ml (無(wú)中性的也可無(wú)中性的也可) 甲醇甲醇(中性中性) 97 ml 將瑞氏染粉放入乳缽中，加入甘油充分研磨，然后將瑞氏染粉放入乳缽中，加入甘油充分

12、研磨，然后加入甲醇加入甲醇10 ml，混合后倒入干燥、清潔的棕色玻璃瓶，混合后倒入干燥、清潔的棕色玻璃瓶?jī)?nèi)，分次將甲醇倒入乳缽內(nèi)，至乳缽內(nèi)染劑洗凈為止，內(nèi)，分次將甲醇倒入乳缽內(nèi)，至乳缽內(nèi)染劑洗凈為止，配制好的染液充分搖勻即可使用。配制好的染液充分搖勻即可使用。（1 1）先用蠟筆在厚薄血膜間劃一界限，然后用）先用蠟筆在厚薄血膜間劃一界限，然后用緩沖蒸留水滴緩沖蒸留水滴2-32-3滴在已干的厚血膜上，溶血后滴在已干的厚血膜上，溶血后傾去水滴。傾去水滴。（2 2）加瑞氏染液）加瑞氏染液5-85-8滴于薄血膜上，染色滴于薄血膜上，染色1-21-2分分鐘。鐘。（3 3）加）加5-85-8滴緩沖蒸留水于薄

13、血膜上，用吸管混滴緩沖蒸留水于薄血膜上，用吸管混合均勻后把染液引到厚血膜上，使厚薄血膜同時(shí)合均勻后把染液引到厚血膜上，使厚薄血膜同時(shí)染色約染色約1010分鐘。分鐘。（4 4）用清水輕輕沖去染液，將玻片直立待干后）用清水輕輕沖去染液，將玻片直立待干后鏡檢鏡檢四、鏡檢四、鏡檢(1)(1)間日瘧原蟲薄血片形態(tài)間日瘧原蟲薄血片形態(tài)被寄生紅細(xì)胞的形態(tài)變化被寄生紅細(xì)胞的形態(tài)變化 大?。猴@著脹大大?。猴@著脹大 色澤：褪色色澤：褪色 斑點(diǎn)：紅色的薛氏小點(diǎn)，細(xì)小數(shù)目多，斑點(diǎn)：紅色的薛氏小點(diǎn)，細(xì)小數(shù)目多， 重復(fù)感染：不多見(jiàn)重復(fù)感染：不多見(jiàn)小滋養(yǎng)體小滋養(yǎng)體 胞漿：淡藍(lán)色，較大，稍粗厚，有一個(gè)空泡。胞漿：淡藍(lán)色，較大

14、，稍粗厚，有一個(gè)空泡。 核：紅色，通常一個(gè)，圓形。核：紅色，通常一個(gè)，圓形。 體積：較大，約占紅細(xì)胞直徑的三分之一。體積：較大，約占紅細(xì)胞直徑的三分之一。大滋養(yǎng)體大滋養(yǎng)體 胞漿：阿米巴樣，含數(shù)胞漿：阿米巴樣，含數(shù)個(gè)空泡，體積較大，淺個(gè)空泡，體積較大，淺藍(lán)色藍(lán)色 核：一個(gè)，呈點(diǎn)狀或桿狀，核：一個(gè)，呈點(diǎn)狀或桿狀， 瘧色素：短桿狀，細(xì)小，棕黃色瘧色素：短桿狀，細(xì)小，棕黃色 形狀：圓形，較小形狀：圓形，較小 胞漿：淡蘭色，胞漿：淡蘭色， 核：疏松，較大，核：疏松，較大， 常位于中央常位于中央 瘧色素：棕色，桿狀，均勻散在，瘧色素：棕色，桿狀，均勻散在，大配子體大配子體 形狀：圓形，較大形狀：圓形，較大

15、 胞漿：深蘭色胞漿：深蘭色 核：致密，位于一側(cè)核：致密，位于一側(cè) 瘧色素：棕黃色，均勻散在，數(shù)很多。瘧色素：棕黃色，均勻散在，數(shù)很多。(2)(2)間日瘧厚血片形態(tài)間日瘧厚血片形態(tài)小滋養(yǎng)體小滋養(yǎng)體 胞漿：大多呈胞漿：大多呈“感嘆號(hào)感嘆號(hào)”，“問(wèn)號(hào)問(wèn)號(hào)”，飛鳥等形狀。，飛鳥等形狀。 核：較大，多數(shù)是一個(gè)，核：較大，多數(shù)是一個(gè)， 胞漿多，形態(tài)變化很大，有分布斷裂成塊現(xiàn)胞漿多，形態(tài)變化很大，有分布斷裂成塊現(xiàn)象，核分裂成數(shù)個(gè)，較大，呈圓形或不規(guī)則的圓象，核分裂成數(shù)個(gè)，較大，呈圓形或不規(guī)則的圓形，零亂地分布在胞漿中，棕黃色短桿狀的瘧色形，零亂地分布在胞漿中，棕黃色短桿狀的瘧色素較多。素較多。 胞漿多，形態(tài)

16、變化很大，有分布斷裂成塊現(xiàn)胞漿多，形態(tài)變化很大，有分布斷裂成塊現(xiàn)象，核分裂成數(shù)個(gè)，較大，呈圓形或不規(guī)則的圓象，核分裂成數(shù)個(gè)，較大，呈圓形或不規(guī)則的圓形，零亂地分布在胞漿中，棕黃色短桿狀的瘧色形，零亂地分布在胞漿中，棕黃色短桿狀的瘧色素較多。素較多。 間日瘧原蟲的配子體很大，幾乎同中性間日瘧原蟲的配子體很大，幾乎同中性白細(xì)胞同樣大小，胞漿完整致密呈圓形或橢白細(xì)胞同樣大小，胞漿完整致密呈圓形或橢圓形，圓形，雌雄配子體的形態(tài)與薄片上的形態(tài)完雌雄配子體的形態(tài)與薄片上的形態(tài)完全相同，配子體有時(shí)易與晚期滋養(yǎng)體相混淆，全相同，配子體有時(shí)易與晚期滋養(yǎng)體相混淆，但配子體的胞漿比較固實(shí)，色素顆粒多而分但配子體的胞

17、漿比較固實(shí)，色素顆粒多而分散并有沿邊緣分布現(xiàn)象。散并有沿邊緣分布現(xiàn)象。間日瘧雄配子體 間日瘧配體子體 1惡性瘧原蟲薄血膜-環(huán)狀體 環(huán)纖細(xì),約為RBC直徑的1/5 核1個(gè)，但2個(gè)常見(jiàn) 紅細(xì)胞常含2個(gè)以上原蟲 蟲體常位于紅細(xì)胞的邊緣 ，呈“鳥飛狀”2 惡性瘧原蟲大滋養(yǎng)體 一般不出現(xiàn)在外周血 體小結(jié)實(shí)，圓形，不活動(dòng) 瘧色素集中一團(tuán)，黑褐色 原蟲此時(shí)開(kāi)始集中在內(nèi)臟毛細(xì)血管3惡性瘧早期裂殖體4惡性瘧原蟲成熟裂殖體 裂殖子836個(gè)，通常1824個(gè)，排列不規(guī)則 瘧色素集中成一團(tuán) 蟲體占紅細(xì)胞體積的23至34 5 惡性瘧原蟲雌配子體 新月形，兩端較尖 核致密，深紅色，常位于中央 瘧色素黑褐色，分布于核周圍5

18、惡性瘧原蟲雄配子體 臘腸形，兩端鈍圓 胞質(zhì)色藍(lán)而略帶紅 核疏松，淡紅色，位于中央 瘧色素黃棕色，小桿狀，在核周圍較多 惡性瘧厚血片形態(tài) 環(huán)狀體 核1-2個(gè)，常呈“!”、飛鳥等形狀。大滋養(yǎng)體常呈圓形、瘧色素集成1-2個(gè)團(tuán)。裂殖體較小，裂殖子8-26個(gè)。配子體新月形，雄配子體臘腸形。五、是非區(qū)別五、是非區(qū)別 1. 1.生物的物質(zhì)生物的物質(zhì) 血液內(nèi)的有性成分，白血球殘塊、血小板碎血液內(nèi)的有性成分，白血球殘塊、血小板碎塊、紅血球內(nèi)何杰塊、紅血球內(nèi)何杰- -喬氏點(diǎn)、卡玻氏環(huán)，水生阿喬氏點(diǎn)、卡玻氏環(huán)，水生阿米巴、細(xì)菌、滴蟲等。米巴、細(xì)菌、滴蟲等。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：無(wú)瘧色素?zé)o瘧色素 湊合常不完善湊合常不完善 大小與瘧色素不符大小與瘧色素不符。染料雜質(zhì)、灰塵。染料雜質(zhì)、灰塵。特點(diǎn)：特點(diǎn)： 無(wú)生物體死亡的自如感覺(jué)無(wú)生物體死亡的自如感覺(jué) 常折光常折光 有湊合的痕跡。有湊合的痕跡。3.3.厚薄血膜之差厚薄血膜之差 薄血膜：用血少，瘧原蟲形態(tài)完整，便于觀察，薄血膜：用血少，瘧原蟲形態(tài)完整，便于觀察，利于鑒別蟲種，但費(fèi)時(shí)間，陽(yáng)性率低。利于鑒別蟲種，但費(fèi)時(shí)間，陽(yáng)性率低。 厚血膜：血量多而集中，省時(shí)間、準(zhǔn)確性高、厚血膜：血量多而集中，省時(shí)間、準(zhǔn)確性高、 但較難掌握。但較難掌握。六、瘧原蟲計(jì)數(shù)六、瘧原蟲計(jì)數(shù)1.1.視野平均法視野平均法：看的視