FCM原理研究生PPT學習教案

1、會計學1FCM原理研究生原理研究生FCM HistoryFCM History1934 Moldavanl first try1934 Moldavanl first try（從固定式細胞分析（從固定式細胞分析- -流動式）流動式）1953 1953 Crosland-Taylor:laminar flowCrosland-Taylor:laminar flow（解決難題）（解決難題）1956 Coulter1956 Coulter（初次應用（初次應用 ）1965 Kamentsky: spectrometer principle(Ortho1965 Kamentsky: spectromet

2、er principle(Ortho（開拓）（開拓）1967 Vandilla and LosAlamos group: Feulgen,1967 Vandilla and LosAlamos group: Feulgen, DNA Histogram DNA Histogram（完善）（完善）1969 Hulett:Sorter(Icp-22)1969 Hulett:Sorter(Icp-22)1973 B-D:First commercial FCM-FACS I1973 B-D:First commercial FCM-FACS I（發(fā)展）（發(fā)展）1979 SSMU: FCM Devel

3、oping1979 SSMU: FCM Developing（推廣）（推廣）1980 BJNU: First FCM (FACS III) in China1980 BJNU: First FCM (FACS III) in ChinaAbout 800 FCMs in ChinaAbout 800 FCMs in China第1頁/共126頁第2頁/共126頁FCM HistoryFCM History1934 Moldavanl first try1934 Moldavanl first try（從固定式細胞分析（從固定式細胞分析- -流動式）流動式）1953 1953 Crosland-

4、Taylor:laminar flowCrosland-Taylor:laminar flow（解決難題）（解決難題）1956 Coulter1956 Coulter（初次應用（初次應用 ）1965 Kamentsky: spectrometer principle(Ortho1965 Kamentsky: spectrometer principle(Ortho（開拓）（開拓）1967 Vandilla and LosAlamos group: Feulgen,1967 Vandilla and LosAlamos group: Feulgen, DNA Histogram DNA Hist

5、ogram（完善）（完善）1969 Hulett:Sorter(Icp-22)1969 Hulett:Sorter(Icp-22)1973 B-D:First commercial FCM-FACS I1973 B-D:First commercial FCM-FACS I（發(fā)展）（發(fā)展）1979 SSMU: FCM Developing1979 SSMU: FCM Developing（推廣）（推廣）1980 BJNU: First FCM (FACS III) in China1980 BJNU: First FCM (FACS III) in ChinaAbout 800 FCMs in

6、 ChinaAbout 800 FCMs in China第3頁/共126頁COULTERCOULTER效應原理效應原理+電極板電極板導電液體導電液體第4頁/共126頁FCM HistoryFCM History1934Moldavanl first try1934Moldavanl first try（從固定式細胞分析（從固定式細胞分析- -流動式）流動式）1953 1953 Crosland-Taylor:laminar flowCrosland-Taylor:laminar flow（解決難題）（解決難題）1956 Coulter1956 Coulter（初次應用（初次應用 ）1965

7、Kamentsky: spectrometer principle(Ortho1965 Kamentsky: spectrometer principle(Ortho（開拓）（開拓）1967 Vandilla and LosAlamos group: Feulgen,1967 Vandilla and LosAlamos group: Feulgen, DNA Histogram DNA Histogram（完善）（完善）1969 Hulett:Sorter(Icp-22)1969 Hulett:Sorter(Icp-22)1973 B-D:First commercial FCM-FACS

8、I1973 B-D:First commercial FCM-FACS I（發(fā)展）（發(fā)展）1979 SSMU: FCM Developing1979 SSMU: FCM Developing（推廣）（推廣）1980 BJNU: First FCM (FACS III) in China1980 BJNU: First FCM (FACS III) in ChinaAbout 800 FCMs in ChinaAbout 800 FCMs in China第5頁/共126頁第6頁/共126頁FCM HistoryFCM History1934Moldavanl first try1934Mold

9、avanl first try（從固定式細胞分析（從固定式細胞分析- -流動式）流動式）1953 1953 Crosland-Taylor:laminar flowCrosland-Taylor:laminar flow（解決難題）（解決難題）1956 Coulter1956 Coulter（初次應用（初次應用 ）1965 Kamentsky: spectrometer principle(Ortho1965 Kamentsky: spectrometer principle(Ortho（開拓）（開拓）1967 Vandilla and LosAlamos group: Feulgen,196

10、7 Vandilla and LosAlamos group: Feulgen, DNA Histogram DNA Histogram（完善）（完善）1969 Hulett:Sorter(Icp-22)1969 Hulett:Sorter(Icp-22)1973 B-D:First commercial FCM-FACS I1973 B-D:First commercial FCM-FACS I（發(fā)展）（發(fā)展）1979 SSMU: FCM Developing1979 SSMU: FCM Developing（推廣）（推廣）1980 BJNU: First FCM (FACS III) in

11、 China1980 BJNU: First FCM (FACS III) in ChinaAbout 800 FCMs in ChinaAbout 800 FCMs in China第7頁/共126頁19791979年年 國家科委重點項目：國家科委重點項目： 研制國內(nèi)第一臺激光流研制國內(nèi)第一臺激光流式細胞儀式細胞儀19821982年年 國內(nèi)第一臺三參數(shù)激光流式細胞儀誕生國內(nèi)第一臺三參數(shù)激光流式細胞儀誕生19841984年國家科委組織科研成果的鑒定驗收年國家科委組織科研成果的鑒定驗收19851985年年 獲國家衛(wèi)生部科技成果乙等獎獲國家衛(wèi)生部科技成果乙等獎19851985年年-1990-199

12、0年年 靈敏度、信噪比、更多參數(shù)靈敏度、信噪比、更多參數(shù) 流式分選儀研制開發(fā)流式分選儀研制開發(fā) 計算機四參數(shù)軟件計算機四參數(shù)軟件 樣品制備、醫(yī)學生物學應用樣品制備、醫(yī)學生物學應用第8頁/共126頁BD公司不同型號流式細胞儀FACSCaliburLSRIIFACSAriaFACSCountFACSVantage&DiVaFACSCanto第9頁/共126頁Coulter公司公司不同型號流式細胞儀不同型號流式細胞儀EPICS XL/XL-MCL 臺式機 CytomicsTM FC 500系列 最新型EPICS Altra細胞分選儀 大型科研型 第10頁/共126頁 FCM是以流式細胞儀為檢

13、測手段的一項能快速、精確的對單個細胞理化特性進行多參數(shù)定量分析和分選的技術。FALS SensorLaser第11頁/共126頁 流動的 可以是活細胞的 定量的 多參數(shù)的 高統(tǒng)計學精度的 分選細胞第12頁/共126頁第一節(jié)第一節(jié) 流式細胞術的原理流式細胞術的原理 一一 工作原理：工作原理： FCMFCM是一種在計算機技術支持下的高度是一種在計算機技術支持下的高度自動化的細胞顯微熒光脈沖分光光度儀。自動化的細胞顯微熒光脈沖分光光度儀。第13頁/共126頁一一、 FCMFCM儀器的一般儀器的一般結構結構( (一一) )流動室與液流驅(qū)動系統(tǒng)流動室與液流驅(qū)動系統(tǒng)( (二二) )激發(fā)光源與光束成形系統(tǒng)激

14、發(fā)光源與光束成形系統(tǒng)( (三三) )細胞信號檢測與分析處理系統(tǒng)細胞信號檢測與分析處理系統(tǒng) 第14頁/共126頁 基本工作原理基本工作原理速度速度 軌跡軌跡第15頁/共126頁 層流是液體穩(wěn)定流動的必要條件層流是液體穩(wěn)定流動的必要條件,管道中管道中層流的形成要滿足雷諾數(shù)層流的形成要滿足雷諾數(shù) dV Re = 2300， 式中式中、分別為液體的密度和粘滯系數(shù)，分別為液體的密度和粘滯系數(shù)，d d和和V V分別為管道的直徑和液體的平均流速。分別為管道的直徑和液體的平均流速。FCMFCM利用層流技術利用層流技術, ,使細胞流動穩(wěn)定使細胞流動穩(wěn)定, ,并具有并具有自聚焦作用自聚焦作用, ,為細胞分析分選提

15、供技術保證為細胞分析分選提供技術保證. . ( (一一) )流動室與液流驅(qū)動系統(tǒng)流動室與液流驅(qū)動系統(tǒng) 層流技術層流技術第16頁/共126頁第17頁/共126頁Injector TipSheath fluid流動室流動室 2-3mm方形石英方形石英內(nèi)徑內(nèi)徑200-300 m m 流速慢流速慢,細胞信號大細胞信號大,提高檢測靈敏度和精提高檢測靈敏度和精度度,小型化。小型化。通過流動室后細通過流動室后細胞一個一個排列胞一個一個排列成單行成單行,依次通過依次通過檢測區(qū)檢測區(qū).把流動室把流動室稱為稱為單細胞流單細胞流發(fā)生器發(fā)生器.第18頁/共126頁流動室流動室Laser Flow Cell孔徑孔徑50

16、-20050-200 m m 檢測區(qū)離噴口檢測區(qū)離噴口200200 m m有分選功能有分選功能 第19頁/共126頁第20頁/共126頁第21頁/共126頁液流驅(qū)動系統(tǒng)液流驅(qū)動系統(tǒng)（示意圖）（示意圖）流速與壓力的關系服從流速與壓力的關系服從BernoulliBernoulli方程，即方程，即 P=(1/2)P=(1/2) V V2 2 ( (忽略高度的變化忽略高度的變化) )。改變氣壓。改變氣壓, ,就可獲得不同的流速。就可獲得不同的流速。 流體動力自聚焦流體動力自聚焦排氣泡排氣泡第22頁/共126頁 FACSVantage Fluid System第23頁/共126頁激光（激光（Laser,

17、light amplification by stimulatedemission of radiation)是一是一種相干光源。種相干光源。單譜線，高強度單譜線，高強度. （二）激發(fā)（二）激發(fā)光源與光束光源與光束成形系統(tǒng)成形系統(tǒng)1-2us第24頁/共126頁E0E0E0E1E1E1 吸收吸收自發(fā)輻射自發(fā)輻射受激輻射受激輻射hvhvhvhvhv 當物質(zhì)受到強烈激勵當物質(zhì)受到強烈激勵,使某一能級的粒子數(shù)大量積聚使某一能級的粒子數(shù)大量積聚,發(fā)生粒子數(shù)反分布發(fā)生粒子數(shù)反分布.如有光束入射如有光束入射,入射光子與粒子發(fā)生入射光子與粒子發(fā)生完全彈性碰撞完全彈性碰撞,使粒子從激發(fā)態(tài)躍遷到基態(tài)同時發(fā)生一使粒

18、子從激發(fā)態(tài)躍遷到基態(tài)同時發(fā)生一個光子個光子.光子的能量與入射光子能量相同光子的能量與入射光子能量相同,有一致的方向有一致的方向和恒定的位相關系和恒定的位相關系,這種發(fā)射稱受激發(fā)射這種發(fā)射稱受激發(fā)射.第25頁/共126頁 球透鏡和柱面透鏡球透鏡和柱面透鏡 ：20200 m 橢圓形光斑，短軸和細胞流平行，長橢圓形光斑，短軸和細胞流平行，長軸與細胞流垂直。軸與細胞流垂直。 光束成形與細胞受照方式光束成形與細胞受照方式第26頁/共126頁 激發(fā)光焦斑這種橢圓形光斑的檢測區(qū)保證每個細胞分別受到光照且受檢時受到一致的光照 光束成形與細胞受照方式光束成形與細胞受照方式第27頁/共126頁低速低速 高速高速不

19、同樣本速率形成的樣本流不同樣本速率形成的樣本流第28頁/共126頁PMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBandpassFiltersLaser 1234Flow cell （三）細胞信號檢測與分析處理系統(tǒng)（三）細胞信號檢測與分析處理系統(tǒng)光電光電管管細胞散色光的波長是與激發(fā)光波長一致的細胞散色光的波長是與激發(fā)光波長一致的. .前向散色光信號前向散色光信號: :光電二極管光電二極管側向及熒光信號用光電倍增管側向及熒光信號用光電倍增管PMT可將可將散色光及熒光信號轉(zhuǎn)換成電脈沖信號散色光及熒光信號轉(zhuǎn)換成電脈沖信號, ,電脈電脈沖信號通過模數(shù)轉(zhuǎn)換器沖信號通過模數(shù)轉(zhuǎn)換器(ADC)(ADC

20、)量化為數(shù)字信號量化為數(shù)字信號. .第29頁/共126頁Longpass Shortpass Bandpass460 500 540460 500 540460 500 540光收集系統(tǒng)：濾光片第30頁/共126頁第31頁/共126頁信號轉(zhuǎn)換系統(tǒng)信號轉(zhuǎn)換系統(tǒng): :光光 電電 數(shù)字信號數(shù)字信號第32頁/共126頁( (四四)FCM)FCM細胞分選裝置細胞分選裝置488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFSC SensorFluorescence detector 超聲振蕩器超聲振蕩器:20-40KC液流斷離點液流

21、斷離點:離噴口離噴口5-8mmf=v/4.5d液滴沖電液滴沖電:幅度荷電多少幅度荷電多少,寬寬度多少液滴帶同時帶電度多少液滴帶同時帶電.靜電高壓偏轉(zhuǎn)板靜電高壓偏轉(zhuǎn)板:幾千伏電壓幾千伏電壓分選細胞的收集裝置分選細胞的收集裝置: :9696孔板孔板, ,載玻片或試管載玻片或試管第33頁/共126頁通道式分選電荷式分選細胞分選系細胞分選系統(tǒng)統(tǒng)第34頁/共126頁二二、細胞信號的檢測與分析細胞信號的檢測與分析 制備好的單細胞懸液經(jīng)儀器檢測區(qū)時受到制備好的單細胞懸液經(jīng)儀器檢測區(qū)時受到激發(fā)光的照射激發(fā)光的照射. .激光照射在細胞上時可產(chǎn)生激光照射在細胞上時可產(chǎn)生散色光信號和熒光信號散色光信號和熒光信號.

22、.第35頁/共126頁FALS SensorLaserForward Angle Light Scatter (FSC)( (一一) )細胞散色光信號細胞散色光信號細胞對光的散色現(xiàn)象與細胞樣品制備無關細胞對光的散色現(xiàn)象與細胞樣品制備無關. .第36頁/共126頁90 Degree Light Scatter (SSC)FALS Sensor90LS SensorLaser細胞對光的散色現(xiàn)象與細胞樣品制備無關細胞對光的散色現(xiàn)象與細胞樣品制備無關. .第37頁/共126頁FSC第38頁/共126頁SSC第39頁/共126頁細胞散色光信號細胞散色光信號第40頁/共126頁( (二二) )細胞熒光測量

23、細胞熒光測量 未經(jīng)染色的樣品細胞 在激發(fā)光的照射下可測到有微弱的熒 光信號. 經(jīng)過各種特異染色的細胞在激 發(fā)光的照射下可測到較強的熒光信號.第41頁/共126頁自發(fā)熒光信號與特異染色的熒光信號分析圖自發(fā)熒光信號與特異染色的熒光信號分析圖自發(fā)熒光信號自發(fā)熒光信號第42頁/共126頁特異染色的熒光信號特異染色的熒光信號第43頁/共126頁細胞熒光信細胞熒光信號號AMPAMP 經(jīng)過經(jīng)過PMTPMT將光學信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娒}沖信號，并增加將光學信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娒}沖信號，并增加PMTPMT的電壓及的電壓及增益，可將脈沖信號進行放大。放大方式有兩種：增益，可將脈沖信號進行放大。放大方式有兩種： 線性放大線性放大(L

24、in):(Lin):對數(shù)放大對數(shù)放大(Log):(Log):熒光熒光信號的測量：信號的測量：第44頁/共126頁 熒光檢測器檢測特定熒光的特定發(fā)射波長熒光檢測器檢測特定熒光的特定發(fā)射波長 線性放大線性放大 對數(shù)放大對數(shù)放大細胞熒光信號細胞熒光信號第45頁/共126頁熒光光譜重疊熒光光譜重疊 FITC和PE熒光光譜重疊第46頁/共126頁Uncompensated vs CompensatedFL1FL2 利用電子技術或計算機軟件等方法將串入相鄰熒光通道的信號加以扣除的技術稱“”熒光補償熒光補償?shù)?7頁/共126頁熒光補熒光補償償?shù)?8頁/共126頁三三、FCMFCM測量數(shù)據(jù)的存貯、測量數(shù)據(jù)的存

25、貯、 顯示和分析顯示和分析（一）（一）FCMFCM數(shù)據(jù)的存貯數(shù)據(jù)的存貯（二）（二）FCMFCM數(shù)據(jù)的顯示方式數(shù)據(jù)的顯示方式（三）（三）FCMFCM數(shù)據(jù)的分析數(shù)據(jù)的分析第49頁/共126頁（一）（一）FCMFCM數(shù)據(jù)的存貯數(shù)據(jù)的存貯 List ModeList Mode方式就是用表格的方式方式就是用表格的方式將每一個被測細胞的眾多原始測量數(shù)將每一個被測細胞的眾多原始測量數(shù)據(jù)全部記錄下來，成為一個數(shù)據(jù)文件據(jù)全部記錄下來，成為一個數(shù)據(jù)文件。第50頁/共126頁1.1.單參數(shù)直方圖（單參數(shù)直方圖（HistogramHistogram）2.2.雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示：雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示： 二維點圖二維點圖(Dot

26、Plot)(Dot Plot) 等高線圖等高線圖(Contour Plot)(Contour Plot) 二維密度圖二維密度圖(Density Plot)(Density Plot) 假三維圖假三維圖(Pseudo 3D Plot)(Pseudo 3D Plot)3.3.三維圖三維圖(3D Plot)(3D Plot)（二）（二）FCMFCM數(shù)據(jù)的顯示方式數(shù)據(jù)的顯示方式第51頁/共126頁. . 單參數(shù)直方圖的顯單參數(shù)直方圖的顯示示 以分布直方圖以分布直方圖( distribution ( distribution histogram )histogram )來顯示，橫軸為該參數(shù)測量強來顯示，

27、橫軸為該參數(shù)測量強度相對值，單位是道數(shù)。強度分布可以是線度相對值，單位是道數(shù)。強度分布可以是線性的，也可以是對數(shù)的?？v軸一般是細胞數(shù)性的，也可以是對數(shù)的。縱軸一般是細胞數(shù)或細胞出現(xiàn)的頻數(shù)或細胞出現(xiàn)的頻數(shù)。Single-Parameter Histogram Displays第52頁/共126頁單參數(shù)直方圖的顯示單參數(shù)直方圖的顯示第53頁/共126頁. .雙參數(shù)數(shù)據(jù)的顯示雙參數(shù)數(shù)據(jù)的顯示 細胞雙參數(shù)測定不僅能提供二個參數(shù)各細胞雙參數(shù)測定不僅能提供二個參數(shù)各自與細胞數(shù)量的關系，更重要的是獲得了自與細胞數(shù)量的關系，更重要的是獲得了這二參數(shù)之間的相關關系，其中包含了更這二參數(shù)之間的相關關系，其中包含了

28、更多的生物學信息。多的生物學信息。雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示最常用雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示最常用的是二維的散點圖的是二維的散點圖( Dot Plot )( Dot Plot )。在二維。在二維圖上，圖上，X X軸代表第一個測量參數(shù)，軸代表第一個測量參數(shù)，Y Y軸代表軸代表第二個測量參數(shù)。每個點代表一個細胞第二個測量參數(shù)。每個點代表一個細胞. .Two-Parameter Data Displays第54頁/共126頁點圖點圖(dot plot)第55頁/共126頁第56頁/共126頁 用等高線來表示細胞數(shù)，在一條等高線上細胞數(shù)相同，用等高線來表示細胞數(shù)，在一條等高線上細胞數(shù)相同，不同的等高線上細胞數(shù)不同。不同的等高

29、線上細胞數(shù)不同。二維等高圖二維等高圖第57頁/共126頁 縱軸與橫軸分別代表被測細胞的兩個測量參縱軸與橫軸分別代表被測細胞的兩個測量參數(shù)數(shù),Z,Z軸為細胞數(shù)。軸為細胞數(shù)。假三維等高圖假三維等高圖第58頁/共126頁. .多參數(shù)數(shù)據(jù)的顯示多參數(shù)數(shù)據(jù)的顯示 在單一圖上同時顯示多參數(shù)是不可能的。在單一圖上同時顯示多參數(shù)是不可能的。實際工作中是實際工作中是用若干個單參數(shù)直方圖和各種用若干個單參數(shù)直方圖和各種不同組合的雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示來反映各種信息不同組合的雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示來反映各種信息的。的。多參數(shù)測量另一重要意義是通過有關參多參數(shù)測量另一重要意義是通過有關參數(shù)進行數(shù)進行“設門設門”分析分析 ( gati

30、ng analysis )( gating analysis )可以是單參數(shù)設門，也可以是雙參數(shù)設門可以是單參數(shù)設門，也可以是雙參數(shù)設門。單參數(shù)設門調(diào)出雙參數(shù)顯示簡稱單參數(shù)設門調(diào)出雙參數(shù)顯示簡稱“一調(diào)二一調(diào)二”。不難理解也有不難理解也有“一調(diào)一一調(diào)一”和和“二調(diào)一二調(diào)一”和和“二調(diào)二二調(diào)二”等。等。Multiple-Parameter Data Displays第59頁/共126頁 三維坐標勻為參數(shù)（散射光或熒光）而三維坐標勻為參數(shù)（散射光或熒光）而非細胞數(shù)。非細胞數(shù)。多參數(shù)直方圖多參數(shù)直方圖第60頁/共126頁 一般利用所得參數(shù)的兩兩組合并利用設門（一般利用所得參數(shù)的兩兩組合并利用設門（Ga

31、te)技術，來分析參數(shù)之間的相互關系。技術，來分析參數(shù)之間的相互關系。多參數(shù)顯示多參數(shù)顯示第61頁/共126頁Pseudo 3D Plot3D Plot多參數(shù)顯示多參數(shù)顯示第62頁/共126頁通過雙參數(shù)調(diào)閱單參數(shù)通過雙參數(shù)調(diào)閱單參數(shù)第63頁/共126頁通過單參數(shù)調(diào)閱雙通過單參數(shù)調(diào)閱雙參數(shù)參數(shù)第64頁/共126頁. . 單參數(shù)分布直方圖的設區(qū)分析單參數(shù)分布直方圖的設區(qū)分析. . 細胞細胞DNADNA含量分布直方圖的數(shù)據(jù)分析含量分布直方圖的數(shù)據(jù)分析. . 雙參數(shù)數(shù)據(jù)的設門分區(qū)分析雙參數(shù)數(shù)據(jù)的設門分區(qū)分析. . 多參數(shù)數(shù)據(jù)的分析多參數(shù)數(shù)據(jù)的分析（三）（三）FCMFCM數(shù)據(jù)的分析數(shù)據(jù)的分析第65頁/共

32、126頁. .單參數(shù)分布直方圖的設區(qū)分析單參數(shù)分布直方圖的設區(qū)分析 這是單參數(shù)數(shù)據(jù)分析中最簡單的一種這是單參數(shù)數(shù)據(jù)分析中最簡單的一種方法。由于方法。由于FCMFCM一次測量的細胞數(shù)多，配一次測量的細胞數(shù)多，配合設門和調(diào)用等手段獲得感興趣的細胞參合設門和調(diào)用等手段獲得感興趣的細胞參數(shù)分布直方圖。這種統(tǒng)計分布直方圖一般數(shù)分布直方圖。這種統(tǒng)計分布直方圖一般可直觀地反映出眾多有用的信息可直觀地反映出眾多有用的信息。第66頁/共126頁. .單參數(shù)分布直方圖的設區(qū)分析單參數(shù)分布直方圖的設區(qū)分析第67頁/共126頁 通過細胞通過細胞DNADNA含量測定，了解細胞增殖含量測定，了解細胞增殖群體中群體中G G

33、0 0/G/G1 1、S S、G G2 2/M/M細胞各占的比例，進細胞各占的比例，進而分析其細胞動力學各參數(shù)。這是而分析其細胞動力學各參數(shù)。這是FCMFCM的重的重要應用之一。要應用之一。細胞細胞DNADNA含量分布直方圖的數(shù)含量分布直方圖的數(shù)據(jù)分析通常有兩種方法，據(jù)分析通常有兩種方法， 作圖分析法和計作圖分析法和計算機擬合法算機擬合法( ( Curve fittingCurve fitting ) )。. .細胞細胞DNADNA含量分布直方圖的數(shù)據(jù)分析含量分布直方圖的數(shù)據(jù)分析第68頁/共126頁細胞細胞DNADNA含量分布直方圖的數(shù)據(jù)分析含量分布直方圖的數(shù)據(jù)分析第69頁/共126頁細胞細胞

34、DNADNA含量分布直方圖的數(shù)據(jù)分析含量分布直方圖的數(shù)據(jù)分析第70頁/共126頁第71頁/共126頁計算機擬合法適用范大，應用中要注意以計算機擬合法適用范大，應用中要注意以下一些方面：下一些方面：1 1）FCMFCM儀器儀器CVCV值與細胞熒光染色的好壞會值與細胞熒光染色的好壞會 直接影響曲線擬合的結果。直接影響曲線擬合的結果。2 2）在細胞群體中數(shù)量較少的細胞亞群，）在細胞群體中數(shù)量較少的細胞亞群， 如如G G2 2/M/M細胞群的分析誤差一般大于細細胞群的分析誤差一般大于細 胞數(shù)量多的亞群。胞數(shù)量多的亞群。3 3）曲線擬合有時會出現(xiàn)偏離生物學意義的）曲線擬合有時會出現(xiàn)偏離生物學意義的 分析

35、結果。這種情況下，可改變參量或分析結果。這種情況下，可改變參量或 選用其他數(shù)學模型重新分析選用其他數(shù)學模型重新分析。第72頁/共126頁. .雙參數(shù)數(shù)據(jù)的設門分區(qū)分析雙參數(shù)數(shù)據(jù)的設門分區(qū)分析 在雙參數(shù)的顯示圖上，細胞結構和細在雙參數(shù)的顯示圖上，細胞結構和細胞功能相同的細胞亞群總表現(xiàn)為集中分布胞功能相同的細胞亞群總表現(xiàn)為集中分布的趨勢，不同細胞亞群有其各自的分布區(qū)的趨勢，不同細胞亞群有其各自的分布區(qū)域。設門分區(qū)可以是方形、矩形、圓形、域。設門分區(qū)可以是方形、矩形、圓形、橢園形甚至各種不規(guī)則圖形，按細胞亞群橢園形甚至各種不規(guī)則圖形，按細胞亞群實際的分布情況而定。實際的分布情況而定。 第73頁/共1

36、26頁點圖點圖 縱軸與橫軸分別代表被測細胞的兩個測量參數(shù),在圖中每一個點代表一個細胞第74頁/共126頁雙參數(shù)數(shù)據(jù)的設門分區(qū)分析雙參數(shù)數(shù)據(jù)的設門分區(qū)分析第75頁/共126頁 多參數(shù)數(shù)據(jù)分析的關鍵在于如何正確通過設多參數(shù)數(shù)據(jù)分析的關鍵在于如何正確通過設門和調(diào)用獲取有價值的單參數(shù)顯示和門和調(diào)用獲取有價值的單參數(shù)顯示和/ /或雙參或雙參數(shù)顯示。由于多參數(shù)相關測量包含的信息量數(shù)顯示。由于多參數(shù)相關測量包含的信息量大，故經(jīng)常會用多個單參數(shù)和大，故經(jīng)常會用多個單參數(shù)和/ /或雙參數(shù)顯示或雙參數(shù)顯示來全面反映其中的各種信息。來全面反映其中的各種信息。由于樣品細胞由于樣品細胞的種類、處理過程、染色方法等的差異

37、，不的種類、處理過程、染色方法等的差異，不可能規(guī)定不變的數(shù)據(jù)處理步驟。細致認真的可能規(guī)定不變的數(shù)據(jù)處理步驟。細致認真的數(shù)據(jù)處理可獲得大量的正確結果。數(shù)據(jù)處理可獲得大量的正確結果。. .多參數(shù)數(shù)據(jù)的分析多參數(shù)數(shù)據(jù)的分析第76頁/共126頁第77頁/共126頁流式細胞術流式細胞術 FCM如何采用層流技術？如何采用層流技術？FCM細胞散色光信號細胞散色光信號FCM的熒光補償?shù)臒晒庋a償FCM的數(shù)據(jù)儲存方式的數(shù)據(jù)儲存方式FCM的不同顯示方式的不同顯示方式 第78頁/共126頁 流式細胞術樣品制備流式細胞術樣品制備 Flow Cytometry Sample Preparation第79頁/共126頁第8

38、0頁/共126頁第81頁/共126頁流式細胞術操作流程：培養(yǎng)細胞新鮮組織石蠟包埋單細胞懸液制備熒光抗體標記上機檢測表型測定細胞分選繼續(xù)培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)FISHPCR統(tǒng)計學分析統(tǒng)計學分析第82頁/共126頁FCMFCM的細胞樣品制備技術三個部分：的細胞樣品制備技術三個部分：一、單分散細胞懸液制備一、單分散細胞懸液制備二、選擇性分離細胞亞群二、選擇性分離細胞亞群三、細胞熒光染色三、細胞熒光染色第83頁/共126頁 流式細胞術對細胞的分析檢測流式細胞術對細胞的分析檢測 必須必須 基于基于單個細胞單個細胞的基礎上，這是的基礎上，這是 流式細胞流式細胞術帶來的特殊要求術帶來的特殊要求。一、單個分散細胞懸液的

39、制備技術一、單個分散細胞懸液的制備技術（一）（一）實體組織實體組織的單細胞懸液的制備的單細胞懸液的制備（二）石蠟包埋組織單細胞懸液的制備（二）石蠟包埋組織單細胞懸液的制備第84頁/共126頁 常用的分散細胞的方法如下常用的分散細胞的方法如下 1 1、酶消化法、酶消化法 2 2、機械法、機械法 3 3、化學試劑處理法、化學試劑處理法（一）實體組織的單細胞懸液的制備（一）實體組織的單細胞懸液的制備第85頁/共126頁（1 1）原理原理（2 2）常用的酶類試劑）常用的酶類試劑（3 3）酶反應的條件酶反應的條件（4 4）酶消化法的一般步驟酶消化法的一般步驟1 1、酶消化法、酶消化法：第86頁/共126

40、頁（）（）原理原理：這種方法是利用：這種方法是利用酶酶的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)大分子大分子不能進入活細胞膜不能進入活細胞膜，但能夠，但能夠破壞破壞細細胞與細胞之間的胞與細胞之間的膠原纖維膠原纖維，水解細胞間的，水解細胞間的粘多糖粘多糖成分，分解細胞間的細胞成分，分解細胞間的細胞緊密連結緊密連結裝置裝置的蛋白性物質(zhì)，而使細胞能從組織塊的蛋白性物質(zhì)，而使細胞能從組織塊上游離到懸浮液中，制備成細胞懸液。上游離到懸浮液中，制備成細胞懸液。、酶消化法、酶消化法第87頁/共126頁A.A.蛋白酶類：蛋白酶類：如胃蛋白酶、胰蛋白酶、如胃蛋白酶、胰蛋白酶、鏈蛋白酶等，其中胰蛋白酶鏈蛋白酶等，其中胰蛋白酶( Tryps

41、in )( Trypsin )最常用。最常用。B.B.膠原酶膠原酶( Collagenase( Collagenase）：膠原酶能降解幾種）：膠原酶能降解幾種分子類型的膠原。分子類型的膠原。 其它常用的酶還有彈性蛋白酶，透明質(zhì)酸酶其它常用的酶還有彈性蛋白酶，透明質(zhì)酸酶和木瓜蛋白酶等。和木瓜蛋白酶等。 不同類型的組織其化學組成不相同使用不同類型的組織其化學組成不相同使用不同種類的酶，見表不同種類的酶，見表1-11-1。（）常用的酶類劑（）常用的酶類劑第88頁/共126頁表表1-1 1-1 酶種類的選擇酶種類的選擇胰蛋白酶胰蛋白酶 鏈蛋白酶鏈蛋白酶 膠元酶膠元酶人結腸肉瘤人結腸肉瘤 人前列腺人前列

42、腺 小鼠骨髓瘤小鼠骨髓瘤大鼠腎臟大鼠腎臟 人瘤腮腺人瘤腮腺 小鼠乳腺腫小鼠乳腺腫瘤瘤人扁桃體人扁桃體 大鼠乳腺大鼠乳腺 小鼠睪丸小鼠睪丸倉鼠前列腺倉鼠前列腺 倉鼠腎臟倉鼠腎臟 大鼠睪丸大鼠睪丸小鼠肝臟小鼠肝臟 倉鼠胰腺倉鼠胰腺 人脾臟人脾臟倉鼠腮腺倉鼠腮腺 人何杰金氏腫瘤人何杰金氏腫瘤大鼠大鼠結腸肉瘤結腸肉瘤第89頁/共126頁 為使組織細胞分散下來，須注意為使組織細胞分散下來，須注意條件條件的選擇和影響因素：的選擇和影響因素： A.A. 配制酶溶液試劑時要兼顧酶反應的配制酶溶液試劑時要兼顧酶反應的適宜條件與活細胞要求的生理環(huán)境，適宜條件與活細胞要求的生理環(huán)境，其中其中包括包括滲透壓，滲透壓，

43、pHpH值值( (緩沖液緩沖液) )，各種各種離子濃離子濃度，酶激動劑等。度，酶激動劑等。 B.B. 酶溶液的適用濃度：酶溶液的適用濃度：胃蛋白酶胃蛋白酶 0.5% 0.5% 膠原酶膠原酶 0.1%0.1%胰蛋白酶胰蛋白酶 0.25%( 0.25%( 含含1-10g/ml DNase )1-10g/ml DNase )（）酶反應的條件（）酶反應的條件第90頁/共126頁 C. C. 酶消化過程的最佳酶消化過程的最佳溫度溫度與持續(xù)與持續(xù)時間時間：37,15-2037,15-20分鐘，分鐘，不同組織不同酶而異。不同組織不同酶而異。二次消化二次消化反復數(shù)次反復數(shù)次, ,直至組織塊完全消失。直至組織塊

44、完全消失。每克組織每克組織10-15ml10-15ml。 （）酶反應的條件（）酶反應的條件第91頁/共126頁D. 終止酶消化反應的方法和措施：加酶抑制劑（如大豆胰蛋白酶抑制劑等）；降低酶反應溫度，將細胞懸液管移至冰水浴中；對于蛋白酶，加入少量血清以減弱酶對細胞的不利影響。通過反復離心漂洗，移去酶消化液，徹底終止酶消化過程等。（）酶反應的條件（）酶反應的條件第92頁/共126頁 A. A. 新鮮組織塊放入冰冷的培養(yǎng)液（或生理鹽水）。新鮮組織塊放入冰冷的培養(yǎng)液（或生理鹽水）。 B. B. 壞死部分，纖維、脂肪及血管等剔除。壞死部分，纖維、脂肪及血管等剔除。 C. C. 剪為剪為1.0mm1.0m

45、m3 3大小于冰冷的培養(yǎng)液大小于冰冷的培養(yǎng)液( ( 或生理鹽水或生理鹽水 ) )。 D. D. 漂洗剪碎的組織塊，以洗去剪碎的細胞碎片。漂洗剪碎的組織塊，以洗去剪碎的細胞碎片。 E. E. 加入酶消化液（一般加入酶消化液（一般g g組織加消化液組織加消化液10-15ml )10-15ml )。 F. F. 消化消化15-2015-20分鐘分鐘( 37( 37，間斷振蕩或吹打，間斷振蕩或吹打) )，消化，消化 時間視不同組織，不同種類的酶而異。時間視不同組織，不同種類的酶而異。 G. G. 終止消化，收集、過濾、低速離心除去碎片。終止消化，收集、過濾、低速離心除去碎片。 H. H. 單細胞懸液進

46、行熒光染色，上機檢測或保存?zhèn)溆?。單細胞懸液進行熒光染色，上機檢測或保存?zhèn)溆?。（）酶消化法的一般程序和步驟：（）酶消化法的一般程序和步驟：第93頁/共126頁 有剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨法等有剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨法等 它是利用機械方法，物理方法給予組織它是利用機械方法，物理方法給予組織 較大的壓力或用超聲振蕩使細胞從組織間較大的壓力或用超聲振蕩使細胞從組織間 分散開來。分散開來。. . 機械法：機械法：第94頁/共126頁貼壁粘連貼壁粘連作用作用鈣鎂離子鈣鎂離子結合掉，從而使細結合掉，從而使細胞分散。胞分散。常用試劑有常用試劑有EDTAEDTA、EGTAEGTA、TPBTPB等。等。 . . 化學試

47、劑處理法：化學試劑處理法： EDTAEDTA是一種螯合劑。實際運用時采用是一種螯合劑。實際運用時采用螯合劑加酶學法（主要是采用胰蛋白酶）。螯合劑加酶學法（主要是采用胰蛋白酶）。這樣的分散細胞方法效果要比單獨采用化這樣的分散細胞方法效果要比單獨采用化學試劑法好。學試劑法好。其他常用的化學試劑還有其他常用的化學試劑還有Triton-x-100Triton-x-100，四苯硼等。四苯硼等。第95頁/共126頁機械法往往常成嚴重的細胞損傷，而結果卻是較機械法往往常成嚴重的細胞損傷，而結果卻是較低的細胞產(chǎn)量。低的細胞產(chǎn)量。 如用低速離心去碎片，用尼龍網(wǎng)過濾團塊等，如用低速離心去碎片，用尼龍網(wǎng)過濾團塊等，

48、也可利用電子學技術處理的方法排除團塊和碎片也可利用電子學技術處理的方法排除團塊和碎片的干擾。的干擾。 酶學法、化學法對實體組織的分散效果較理想，酶學法、化學法對實體組織的分散效果較理想，但會造成所測化學成份的不良影響。但會造成所測化學成份的不良影響。FCMFCM所測細胞所測細胞是單個分散狀態(tài)；對細胞團塊，細胞碎片盡可能是單個分散狀態(tài)；對細胞團塊，細胞碎片盡可能少；細胞的活性不受損害，以保證下一步的熒光少；細胞的活性不受損害，以保證下一步的熒光染色處理不受影響。染色處理不受影響。 小結小結第96頁/共126頁 檢測石臘包埋組織，對細胞成份及特性檢測石臘包埋組織，對細胞成份及特性進行進行定量定性分

49、析定量定性分析是近年來流式細胞術在臨是近年來流式細胞術在臨床腫瘤學的應用和基礎生物學的應用，因此，床腫瘤學的應用和基礎生物學的應用，因此，石臘包埋組織單細胞懸液制備技術的建立使石臘包埋組織單細胞懸液制備技術的建立使大量存檔的臨床資料重新得到研究與利用，大量存檔的臨床資料重新得到研究與利用，從而擴大了流式細胞術的應用范圍從而擴大了流式細胞術的應用范圍。（二）石臘包埋組織單細胞懸液的制備（二）石臘包埋組織單細胞懸液的制備第97頁/共126頁常用的方法有以下幾種：常用的方法有以下幾種：. .利用細胞之間密度或體積的差異分離利用細胞之間密度或體積的差異分離. .利用細胞的吸咐力特性分離利用細胞的吸咐力

50、特性分離. .利用單克隆抗體分離細胞亞群利用單克隆抗體分離細胞亞群. .利用選擇性破壞和保留一部分細胞亞群利用選擇性破壞和保留一部分細胞亞群. .利用利用FCMFCM分析技術區(qū)分細胞亞群分析技術區(qū)分細胞亞群. .利用流式細胞分選術分選細胞亞群利用流式細胞分選術分選細胞亞群二、選擇性分離細胞亞群二、選擇性分離細胞亞群第98頁/共126頁（1 1）自然沉降法）自然沉降法（2 2）密度梯度離心法，電泳法，離心鼓淘汰法。）密度梯度離心法，電泳法，離心鼓淘汰法。 用淋巴細胞分離液根據(jù)各細胞亞群的比重不用淋巴細胞分離液根據(jù)各細胞亞群的比重不 同可以分離出淋巴細胞、粒細胞等。同可以分離出淋巴細胞、粒細胞等。

51、. .利用細胞之間密度或體積的差異分離利用細胞之間密度或體積的差異分離第99頁/共126頁（1 1）玻璃和磁鐵吸咐法：純化淋巴胞）玻璃和磁鐵吸咐法：純化淋巴胞（2 2）花環(huán)沉降法：）花環(huán)沉降法：T T、B B淋巴細胞的化淋巴細胞的化（3 3）吸咐法：純化單核細胞）吸咐法：純化單核細胞. .利用細胞的吸咐力特性分離利用細胞的吸咐力特性分離第100頁/共126頁第101頁/共126頁. .利用單克隆抗體分離細胞亞群利用單克隆抗體分離細胞亞群陽性選擇陽性選擇陰性選擇陰性選擇MACS-Magnetic CellMACS-Magnetic CellSorting Sorting 磁珠磁珠分離分離第102

52、頁/共126頁 氯化銨選擇性破壞紅細胞氯化銨選擇性破壞紅細胞. .利用選擇性破壞和保留一部分細胞亞群利用選擇性破壞和保留一部分細胞亞群第103頁/共126頁用散射光信號用散射光信號區(qū)分淋巴、區(qū)分淋巴、粒、單核細胞粒、單核細胞. .利用利用FCMFCM分析技術區(qū)分細胞亞群分析技術區(qū)分細胞亞群第104頁/共126頁干細胞（干細胞（CD34CD34+ +）的分選）的分選. .利用流式細胞分選術分選細胞亞群利用流式細胞分選術分選細胞亞群488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescenc

53、e detector第105頁/共126頁分離結果的驗證指標有兩方面：分離結果的驗證指標有兩方面：收獲率和純度收獲率和純度 收獲率收獲率 是指分離后所得的細胞亞群數(shù)是指分離后所得的細胞亞群數(shù)占原細胞樣品中該亞群細胞數(shù)的百分比。占原細胞樣品中該亞群細胞數(shù)的百分比。 純度純度 是指分離后的樣品中該亞群細胞是指分離后的樣品中該亞群細胞所占的百分比所占的百分比。小結小結第106頁/共126頁三、細胞熒光染色技術三、細胞熒光染色技術 流式細胞術流式細胞術快速分析單細胞快速分析單細胞的各種生物學的各種生物學特性和各種生化成份并特性和各種生化成份并定量測定定量測定這些參數(shù)是這些參數(shù)是通過熒光細胞化學方法實現(xiàn)

54、的通過熒光細胞化學方法實現(xiàn)的。第107頁/共126頁（一）細胞化學的定義和原則（一）細胞化學的定義和原則（二）細胞懸液中熒光細胞化學方法的特點（二）細胞懸液中熒光細胞化學方法的特點（三）熒光細胞化學的評價標準（三）熒光細胞化學的評價標準（四）（四）FCM熒光細胞化學的分類熒光細胞化學的分類（五）細胞（五）細胞DNA熒光熒光染色染色（六）細胞（六）細胞RNA熒光熒光染色染色（七）細胞蛋白質(zhì)（七）細胞蛋白質(zhì)熒光熒光染色染色（八）其它（八）其它熒光熒光染色方法染色方法三、細胞熒光染色技術三、細胞熒光染色技術第108頁/共126頁. . 熒光細胞化學過程的特異性熒光細胞化學過程的特異性 FCMFCM的

55、熒光細胞化學過程要求有足夠的的熒光細胞化學過程要求有足夠的 特異性，熒光染料與細胞成分是否為特異特異性，熒光染料與細胞成分是否為特異 性結合。嚴格控制各種反應條件是保證反性結合。嚴格控制各種反應條件是保證反 應特異性的重要因素。應特異性的重要因素。 （三）熒光細胞化學的評價標準（三）熒光細胞化學的評價標準. . 熒光細胞化學的化學定量關系熒光細胞化學的化學定量關系 在相同的條件下，熒光反應產(chǎn)物（熒光在相同的條件下，熒光反應產(chǎn)物（熒光強度）與所研究的生化成份的含量或活性之強度）與所研究的生化成份的含量或活性之間有嚴格的化學定量關系間有嚴格的化學定量關系。第109頁/共126頁熒光熒光染色染色定量

56、關系定量關系熒光染色的特異性熒光染色的特異性第110頁/共126頁1. 1. 共價結合的反應過程共價結合的反應過程 FeulgenFeulgen反應，反應，F(xiàn)ITCFITC與蛋白質(zhì)分子中的與蛋白質(zhì)分子中的 自由氨基形成的硫碳氨基鍵等。自由氨基形成的硫碳氨基鍵等。2. 2. 插入性結合方式的反應過程插入性結合方式的反應過程 EBEB，PIPI，7-7-氨基放線菌素氨基放線菌素D( 7-AAD )D( 7-AAD )等。等。 結合緊密、穩(wěn)定，染料不會丟失脫落，結合緊密、穩(wěn)定，染料不會丟失脫落， 簡便，特異性較高，被廣泛應用簡便，特異性較高，被廣泛應用。3. 3. 結構親合方式的反應過程結構親合方式

57、的反應過程 吖啶橙與核酸單鏈結合，派若寧吖啶橙與核酸單鏈結合，派若寧Y Y與單與單 鏈核酸結合等。反應過程易受溶液鏈核酸結合等。反應過程易受溶液pHpH的的 影響。結合極弱影響。結合極弱, ,易丟失易丟失。（四）（四）FCMFCM熒光細胞化學的分類熒光細胞化學的分類第111頁/共126頁表表1-2 1-2 常用熒光探針的光譜特性常用熒光探針的光譜特性 分類分類 染料染料 激發(fā)譜激發(fā)譜 發(fā)射譜發(fā)射譜 FITC 紫紫 藍藍 綠綠 TRITC TRITC 藍藍 綠綠 紅紅 XRITC XRITC 綠綠 黃黃 紅紅 Texas Red Texas Red 綠綠 黃黃 紅紅 Phycocyanin Ph

58、ycocyanin 綠綠 黃黃 紅紅 Allophycocyanin Allophycocyanin 紅紅 紅紅細胞表面標記染料第112頁/共126頁 Propidium Iodide 藍藍- -綠綠 紅紅 Acridine Orange 藍藍 綠綠 Ethidium Bromide 藍藍- -綠綠 紅紅 Hoechst33258/33342 紫外紫外 藍藍 DAPI 紫外紫外 藍藍 DIPI 紫外紫外 藍藍 Mithramycin 紫紫- -藍藍 綠綠 Chromomycin A3 紫紫- -藍藍 綠綠 Acriflavine 藍藍 綠綠- -黃黃分類 染料 激發(fā)譜 發(fā)射譜細胞DNA染料第113頁/共126頁 細胞細胞RNA AcridineAcridine OrangeOrange 藍藍 綠綠 染料染料 Pyronine YPyronine Y 藍藍- -綠綠 紅紅 FITCFITC 紫紫- -藍藍 綠綠 TRITCTRITC 藍藍- -綠綠 紅紅 細胞蛋細胞蛋 Sulforhodamin