色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

1、戴 琛生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心生物化學(xué)與分子生物學(xué)系Tel: 84390590,mail: 色譜色譜- -質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)原理質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)原理LTQ Orbitrap LTQ Orbitrap 儀器儀器應(yīng)用領(lǐng)域應(yīng)用領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)色譜法由俄國(guó)植物學(xué)家茨維特分離色譜法由俄國(guó)植物學(xué)家茨維特分離植物色素植物色素時(shí)采用。時(shí)采用。 將植物葉子的萃取物倒入填有碳酸鈣的直立玻璃管內(nèi)，加入石油醚使將植物葉子的萃取物倒入填有碳酸鈣的直立玻璃管內(nèi)，加入石油醚使自由流下，結(jié)果色素中各組分互相分離形成各種不同顏色的譜帶，因自由流下，結(jié)果色素中各組分互相分離形成各種不同顏色的譜帶，因得名為色譜法。以后

2、此法逐漸應(yīng)用于得名為色譜法。以后此法逐漸應(yīng)用于無(wú)色物質(zhì)的分離無(wú)色物質(zhì)的分離，“色譜色譜”二字雖二字雖已失去原來(lái)已失去原來(lái)含義，但仍被人們沿用至今。含義，但仍被人們沿用至今。定義：色譜是一種把混合物中定義：色譜是一種把混合物中多組分分離多組分分離的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。即利用化合物的即利用化合物的物理化學(xué)性質(zhì)物理化學(xué)性質(zhì)建立的分離分析方法。建立的分離分析方法。實(shí)質(zhì)：分離實(shí)質(zhì)：分離目的：定性或定量分析目的：定性或定量分析填入玻璃管或不銹鋼管內(nèi)靜止不動(dòng)的一相（固體或液體）填入玻璃管或不銹鋼管內(nèi)靜止不動(dòng)的一相（固體或液體）稱為稱為固定相固定相；自上而下運(yùn)動(dòng)的一相（一般是氣體或液體）稱為自上而下運(yùn)動(dòng)的一

3、相（一般是氣體或液體）稱為流動(dòng)相流動(dòng)相； 裝有固定相的管子（玻璃管或不銹鋼管）稱為裝有固定相的管子（玻璃管或不銹鋼管）稱為色譜柱色譜柱。當(dāng)流動(dòng)相中樣品混合物經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，就會(huì)與固當(dāng)流動(dòng)相中樣品混合物經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，就會(huì)與固定相發(fā)生作用，由于定相發(fā)生作用，由于各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相相互作用的類型、強(qiáng)弱也有差異異，與固定相相互作用的類型、強(qiáng)弱也有差異，因此在同一推動(dòng)力的作用下，不同組分在固定相因此在同一推動(dòng)力的作用下，不同組分在固定相滯留時(shí)間長(zhǎng)短不同，從而滯留時(shí)間長(zhǎng)短不同，從而按先后不同的次序按先后不同的次序從固從固定相中流出定相中流出。分配色譜分配色譜：利用在

4、流動(dòng)相和固定相中分配系數(shù)的不同：利用在流動(dòng)相和固定相中分配系數(shù)的不同分離；分離；吸附色譜吸附色譜：利用物理吸附性能的差異分離；：利用物理吸附性能的差異分離；離子交換色譜離子交換色譜：利用離子交換能力的差別分離；：利用離子交換能力的差別分離；空間排阻色譜空間排阻色譜：利用排阻作用力的不同分離：利用排阻作用力的不同分離在常用的色譜中，常是在常用的色譜中，常是幾種分離機(jī)制共同作用幾種分離機(jī)制共同作用的的結(jié)果。結(jié)果。注意注意在柱溫條件下有一定蒸氣壓且穩(wěn)定性好的樣品在柱溫條件下有一定蒸氣壓且穩(wěn)定性好的樣品都能測(cè)定，只要在都能測(cè)定，只要在 196 450 196 450 溫度范圍內(nèi)有溫度范圍內(nèi)有27 27

5、 1330 Pa1330 Pa蒸氣壓且不分解的物質(zhì)蒸氣壓且不分解的物質(zhì)原則上都能測(cè)定，原則上都能測(cè)定，不論它是氣體、液體和固體。不論它是氣體、液體和固體。 對(duì)于揮發(fā)性低和受熱易分解的物質(zhì)，若能對(duì)于揮發(fā)性低和受熱易分解的物質(zhì)，若能通過(guò)化學(xué)衍生方法使其轉(zhuǎn)化為通過(guò)化學(xué)衍生方法使其轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性大、熱穩(wěn)定性揮發(fā)性大、熱穩(wěn)定性好的好的衍生物衍生物，同樣可用氣相色譜分離和分析。，同樣可用氣相色譜分離和分析。 GC GC 專長(zhǎng)：同系物專長(zhǎng)：同系物 GC GC 主要用于分離和定量主要用于分離和定量，可廣泛應(yīng)用在環(huán)，可廣泛應(yīng)用在環(huán)保、臨床、藥物、農(nóng)藥、食品、污染物等方面的測(cè)保、臨床、藥物、農(nóng)藥、食品、污染物等方面

6、的測(cè)定。定。液相色譜對(duì)不宜汽化的高分子，熱穩(wěn)定性差、對(duì)不宜汽化的高分子，熱穩(wěn)定性差、化學(xué)性質(zhì)極為活潑或強(qiáng)腐蝕性物質(zhì)不能化學(xué)性質(zhì)極為活潑或強(qiáng)腐蝕性物質(zhì)不能用用GC測(cè)定。應(yīng)用范圍受到限制，在所測(cè)定。應(yīng)用范圍受到限制，在所有的有機(jī)物分析中只有有的有機(jī)物分析中只有1520%能用能用GC進(jìn)行分離分析。進(jìn)行分離分析。對(duì)于對(duì)于極性和高分子量極性和高分子量化合物，液相色譜化合物，液相色譜（LC）則是其關(guān)鍵的分離技術(shù)。）則是其關(guān)鍵的分離技術(shù)。 1 1 樣品中所含組分的最少個(gè)數(shù)樣品中所含組分的最少個(gè)數(shù)2 2 保留值保留值-定性分析定性分析3 3 色譜峰面積（或峰高）色譜峰面積（或峰高）-定量分析定量分析4 4 色

7、譜峰的保留值和區(qū)域?qū)挾壬V峰的保留值和區(qū)域?qū)挾?評(píng)價(jià)色譜柱的分離效能評(píng)價(jià)色譜柱的分離效能5 5 根據(jù)相鄰色譜峰之間的距離來(lái)選擇合適的色譜分離條件根據(jù)相鄰色譜峰之間的距離來(lái)選擇合適的色譜分離條件保留時(shí)間反相色譜C18，C8，CN極性大的組分先出峰，極性小的組分后出峰。正相色譜NH2，硅膠柱，CN極性大的組分后出峰，極性小的組分先出峰。UVDAD熒光Q：UV檢測(cè)器是不是通用檢測(cè)器？UV：共軛體系FLD：1共軛雙鍵體系 2剛性平面結(jié)構(gòu) 3給電子取代基質(zhì)譜基本知識(shí)什么是質(zhì)譜？質(zhì)譜分析法是通過(guò)對(duì)被測(cè)樣品離子質(zhì)譜分析法是通過(guò)對(duì)被測(cè)樣品離子質(zhì)荷比質(zhì)荷比（m/zm/z）的測(cè)定來(lái)進(jìn)行分析的一種方法。的測(cè)定來(lái)進(jìn)行

8、分析的一種方法。 被分析的樣品首先要被分析的樣品首先要離子化離子化，然后利用不同離子，然后利用不同離子在在電場(chǎng)或磁場(chǎng)電場(chǎng)或磁場(chǎng)運(yùn)動(dòng)行為的不同，把離子按運(yùn)動(dòng)行為的不同，把離子按m/zm/z分開(kāi)分開(kāi)而得到質(zhì)譜，并得到樣品的而得到質(zhì)譜，并得到樣品的定性定量定性定量結(jié)果。結(jié)果。m/z15294357859911314271如何理解質(zhì)譜的發(fā)展質(zhì)譜的發(fā)展40年代年代同位素測(cè)定和無(wú)機(jī)元素分析同位素測(cè)定和無(wú)機(jī)元素分析50年代年代有機(jī)物分析有機(jī)物分析60年代年代氣相色譜氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用質(zhì)譜聯(lián)用80年代年代新的質(zhì)譜技術(shù)新的質(zhì)譜技術(shù)接口技術(shù)（基質(zhì)輔助激光解吸電離源，接口技術(shù)（基質(zhì)輔助激光解吸電離源，電噴霧電離源，

9、大氣壓化學(xué)電離源）電噴霧電離源，大氣壓化學(xué)電離源）新質(zhì)譜儀（液相色譜新質(zhì)譜儀（液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，質(zhì)譜聯(lián)用儀，傅里葉變換質(zhì)譜儀等）傅里葉變換質(zhì)譜儀等）目前質(zhì)譜分析法已廣泛地應(yīng)用于化學(xué)、化工、材料、環(huán)境、藥物、刑偵、目前質(zhì)譜分析法已廣泛地應(yīng)用于化學(xué)、化工、材料、環(huán)境、藥物、刑偵、生命科學(xué)、運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。生命科學(xué)、運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。 1911年年 世界第一臺(tái)質(zhì)譜裝置（世界第一臺(tái)質(zhì)譜裝置（J.J. Thomson） 70年代年代計(jì)算機(jī)技術(shù)引入計(jì)算機(jī)技術(shù)引入質(zhì)譜特點(diǎn) 質(zhì)譜不屬波譜范圍；質(zhì)譜不屬波譜范圍； 質(zhì)譜為通用型檢測(cè)器；質(zhì)譜為通用型檢測(cè)器； 質(zhì)譜是分子離子及碎片離子的質(zhì)量與其相對(duì)強(qiáng)度的質(zhì)

10、譜是分子離子及碎片離子的質(zhì)量與其相對(duì)強(qiáng)度的譜譜, 譜圖與分子結(jié)構(gòu)有關(guān)；譜圖與分子結(jié)構(gòu)有關(guān)； 質(zhì)譜法進(jìn)樣量少質(zhì)譜法進(jìn)樣量少, 靈敏度高靈敏度高, 分析速度快；分析速度快； 質(zhì)譜法可提供分子量質(zhì)譜法可提供分子量, 確定確定分子式分子式。 質(zhì)譜簡(jiǎn)化流程（GMSD）質(zhì)譜儀的基本結(jié)構(gòu)質(zhì)譜儀的基本結(jié)構(gòu) 質(zhì)譜儀包括質(zhì)譜儀包括進(jìn)進(jìn)樣系統(tǒng)樣系統(tǒng)、電離系統(tǒng)電離系統(tǒng)、質(zhì)量分析系統(tǒng)和檢質(zhì)量分析系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)系統(tǒng)。 計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)真空系統(tǒng) 加速區(qū)進(jìn)樣系統(tǒng)離子源質(zhì)量分析器檢測(cè)器 真空系統(tǒng)質(zhì)譜儀的離子產(chǎn)生及經(jīng)過(guò)系統(tǒng)必須處于質(zhì)譜儀的離子產(chǎn)生及經(jīng)過(guò)系統(tǒng)必須處于高真空狀高真空狀態(tài)態(tài)。若真空度過(guò)低，則會(huì)造成離子源燈絲損壞、。

11、若真空度過(guò)低，則會(huì)造成離子源燈絲損壞、本底增高、圖譜復(fù)雜化、干擾離子源的調(diào)節(jié)、加本底增高、圖譜復(fù)雜化、干擾離子源的調(diào)節(jié)、加速極放電等問(wèn)題。速極放電等問(wèn)題。一般質(zhì)譜儀都采用一般質(zhì)譜儀都采用機(jī)械泵機(jī)械泵預(yù)抽真空后，再用高效預(yù)抽真空后，再用高效率率擴(kuò)散泵擴(kuò)散泵連續(xù)地運(yùn)行以保持真空?，F(xiàn)代質(zhì)譜儀采連續(xù)地運(yùn)行以保持真空?，F(xiàn)代質(zhì)譜儀采用用分子泵分子泵可獲得更高的真空度?？色@得更高的真空度。二級(jí)真空系統(tǒng)！二級(jí)真空系統(tǒng)！真空系統(tǒng)為早期的維護(hù)反饋提供數(shù)字化控制雙分子渦輪泵可快速抽真空和進(jìn)行穩(wěn)定操作進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)目的是進(jìn)樣系統(tǒng)目的是高效重復(fù)地將樣品引入到高效重復(fù)地將樣品引入到離子源中并且不能造成真空度的降低。離子

12、源中并且不能造成真空度的降低。進(jìn)樣方式：進(jìn)樣方式：1 直接進(jìn)樣直接進(jìn)樣2 儀器聯(lián)用的進(jìn)樣儀器聯(lián)用的進(jìn)樣 （GC、LC、CE）為什么質(zhì)譜要與色譜聯(lián)用？LC 靈敏度：靈敏度：ug/mLmg/mLUV檢測(cè)器缺乏通用性檢測(cè)器缺乏通用性MS靈敏度：pg/mLng/mL高選擇性，以m/z進(jìn)行區(qū)分直接進(jìn)樣需要一定的純度直接進(jìn)樣需要一定的純度色譜的分離能力色譜的分離能力質(zhì)譜的定性功能質(zhì)譜的定性功能實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜混合物更實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜混合物更準(zhǔn)確的定量和定性分準(zhǔn)確的定量和定性分析。而且也簡(jiǎn)化了樣析。而且也簡(jiǎn)化了樣品的前處理過(guò)程，使品的前處理過(guò)程，使樣品分析更簡(jiǎn)便。樣品分析更簡(jiǎn)便。長(zhǎng)期以來(lái)，LC與MS聯(lián)用被認(rèn)為是“不可能

13、的結(jié)合”傳統(tǒng)的傳統(tǒng)的HPLC系統(tǒng)中遇到的流量（系統(tǒng)中遇到的流量（0.52 mL/min的正、反相溶劑流速）和質(zhì)譜儀要求的正、反相溶劑流速）和質(zhì)譜儀要求的真空之間存在的難以協(xié)調(diào)性似乎太大了。的真空之間存在的難以協(xié)調(diào)性似乎太大了。將流量達(dá)將流量達(dá)2 mL/min的液體引進(jìn)的液體引進(jìn)MS的真空系統(tǒng)需要的真空系統(tǒng)需要使用一個(gè)合適的使用一個(gè)合適的接口接口Desolvate sample flow for introduction into mass spectrometer.（去溶劑）Baffle the first vacuum region of the MS from atmospheric pr

14、essure in the source. (真空過(guò)渡)Ionize the analyte or transport ion in solution to thegas phase. （離子化）Pump away neutrals and opposite charged ions which would otherwise interfere with the analysis of the desired polarity. （去除干擾）電子轟擊電離源電子轟擊電離源 electron impact ionization source, EI化學(xué)電離源化學(xué)電離源 chemical ioni

15、zation source, CI快原子轟擊電離源快原子轟擊電離源 fast atom bombardment source, FAB電噴霧電離源電噴霧電離源 electrospray ionization source, ESI大氣壓化學(xué)電離源大氣壓化學(xué)電離源 atmospheric pressure chemical ionization source, APCI基質(zhì)輔助激光解析電離源基質(zhì)輔助激光解析電離源 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization, MALDIEI源源主要用于揮發(fā)性樣品的電離（主要用于揮發(fā)性樣品的電離（GC-MS）。）。 原理

16、：由原理：由GC或直接進(jìn)樣桿進(jìn)入的樣品，以氣體形式或直接進(jìn)樣桿進(jìn)入的樣品，以氣體形式進(jìn)入離子源，由燈絲發(fā)出的電子與樣品分子發(fā)生碰進(jìn)入離子源，由燈絲發(fā)出的電子與樣品分子發(fā)生碰撞使樣品分子電離。撞使樣品分子電離。 所有的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖都是在所有的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖都是在70 eV下做出的。有機(jī)物下做出的。有機(jī)物分子可能被打掉一個(gè)電子形成分子離子，也可能會(huì)分子可能被打掉一個(gè)電子形成分子離子，也可能會(huì)發(fā)生化學(xué)鍵的斷裂形成碎片離子。發(fā)生化學(xué)鍵的斷裂形成碎片離子。由分子離子可以確定化合物分子量，由碎片離由分子離子可以確定化合物分子量，由碎片離子可以得到化合物的結(jié)構(gòu)信息。子可以得到化合物的結(jié)構(gòu)信息。1）結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，穩(wěn)定，

17、電離效率高，易于實(shí)現(xiàn)；2）質(zhì)譜圖再現(xiàn)性好，便于計(jì)算機(jī)檢索及比較；3）離子碎片多，可提供較多的分子結(jié)構(gòu)信息。4）當(dāng)樣品分子穩(wěn)定性不高時(shí)，分子離子峰的強(qiáng)度低，甚至不存在分子離子峰。ESI電噴霧電離源 ESI噴嘴橫截面ESIESI源結(jié)構(gòu)ESI源特點(diǎn)離子在液相產(chǎn)生軟電離模式, 可給出分子離子峰有益于熱不穩(wěn)定化合物的分析有益于中等到高等極性化合物分析有益于大分子（蛋白/多肽）帶多電荷大氣壓化學(xué)電離源（APCI）APCI源結(jié)構(gòu)APCIAPCI源特點(diǎn)離子在氣態(tài)產(chǎn)生不利于熱不穩(wěn)定化合物的分析有益于低極性到中等極性化合物的分析適合小分子（steroids-類固醇, 甾體化合物）比ESI更能容忍緩沖鹽軟電離模式，

18、僅產(chǎn)生單電荷離子離子化技術(shù)應(yīng)用覆蓋基質(zhì)輔助激光解析電離源基質(zhì)輔助激光解析電離源 MALDIMALDI MALDI適用于適用于生物大分子生物大分子，如肽類，如肽類，核酸類化合物?？傻玫胶怂犷惢衔??？傻玫綔?zhǔn)準(zhǔn)分子離子峰，分子離子峰，碎片離子和多電荷離子較少碎片離子和多電荷離子較少. MALDI可使熱敏感或不揮發(fā)的化合物由固相直接得到離子?？墒篃崦舾谢虿粨]發(fā)的化合物由固相直接得到離子。 待測(cè)物質(zhì)的溶液與基質(zhì)的溶液混合后蒸發(fā)，使分析物與基質(zhì)成為待測(cè)物質(zhì)的溶液與基質(zhì)的溶液混合后蒸發(fā)，使分析物與基質(zhì)成為晶體或半晶體晶體或半晶體，用一定波長(zhǎng)的脈沖式激光進(jìn)行照射時(shí)，基質(zhì)分子能，用一定波長(zhǎng)的脈沖式激光進(jìn)行照射

19、時(shí)，基質(zhì)分子能有效的有效的吸收激光的能量吸收激光的能量，使，使基質(zhì)分子和樣品分子進(jìn)入氣相基質(zhì)分子和樣品分子進(jìn)入氣相并得到電并得到電離。離。 質(zhì)量分析器質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀的核心, 質(zhì)量分析器的作用是將離子源產(chǎn)生的離子按m/z順序進(jìn)行分離并排列。 目前常用的質(zhì)量分析器有：磁質(zhì)量分析器（Magnetic Sector Analyzer） 四極桿質(zhì)量分析器（quadrupole mass analyzer） 飛行時(shí)間質(zhì)量分析器（time of flight, TOF ） 離子阱質(zhì)量分析器（ion trap）41在一定的B、V下，不同m/z 的離子其R不同，由離子源產(chǎn)生的離子，經(jīng)過(guò)分析器后可實(shí)現(xiàn)質(zhì)量分離

20、。 離子進(jìn)入分析器后，由于磁場(chǎng)的作用，其運(yùn)動(dòng)軌道發(fā)生偏轉(zhuǎn)改作圓周離子進(jìn)入分析器后，由于磁場(chǎng)的作用，其運(yùn)動(dòng)軌道發(fā)生偏轉(zhuǎn)改作圓周運(yùn)動(dòng)。其運(yùn)動(dòng)軌道半徑運(yùn)動(dòng)。其運(yùn)動(dòng)軌道半徑R可由下式表示：可由下式表示： 上式中， m -離子質(zhì)量 Z -離子電荷量 V -離子加速電壓 B -磁感應(yīng)強(qiáng)度傳統(tǒng)的四極桿質(zhì)量分析器是由四根筆直的棒狀電極與軸線平行并等距離的置懸著構(gòu)成，棒的理想表面為雙曲面。在一定DC/VC作用下，只有m/z滿足一定要求的離子才能通過(guò)四極桿到達(dá)檢測(cè)器，其他離子被濾掉。+四極桿質(zhì)量分析器示意圖四極桿質(zhì)量分析器具有重量輕、體積小、造價(jià)低廉等優(yōu)點(diǎn)。用一個(gè)脈沖將離子源中的離子瞬間引出，經(jīng)加速電壓加速，它們

21、具有相同的動(dòng)能進(jìn)入漂移管，質(zhì)荷比小的離子具有最快的速度因而首先到達(dá)檢測(cè)器，質(zhì)荷比大的離子則最后到達(dá)檢測(cè)器。Ion SourceDrift RegionDetectorReflection特點(diǎn)： 1）檢測(cè)離子的質(zhì)荷比范圍非常寬；2）靈敏度高，適合于作串聯(lián)質(zhì)譜的第二級(jí)；3）掃描速度快，適合研究極快過(guò)程。質(zhì)譜儀常用的檢測(cè)器有直接電檢測(cè)器、電子倍增器、閃爍檢測(cè)器和微通道板等。 電子倍增器運(yùn)用質(zhì)量分析器出來(lái)的離子轟擊電子倍增管的陰極表面，使其發(fā)射出二次電子，再用二次電子依次轟擊一系列電極，使二次電子獲得不斷倍增，最后由陽(yáng)極接受電子流，使離子束信號(hào)得到放大。電子倍增器示意圖質(zhì)譜儀都配有完善的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，不僅能快速準(zhǔn)確的采集數(shù)據(jù)和處理數(shù)據(jù)，而且能監(jiān)控質(zhì)譜儀各單元的工作狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)質(zhì)譜儀的全自動(dòng)操作，并能代替人工進(jìn)行化合物的定性和定量分析軟件：XcaliburPDMetabolite ID質(zhì)荷比(m/z): 離子質(zhì)量(以相對(duì)原子量單位計(jì))與它所帶電荷(以電子電量為單位計(jì))的比值。峰(Peak