第五章基因工程載體

1、1第五章第五章. 基因工程載體基因工程載體2載體類型基因工程所用的載體都經(jīng)過(guò)人工重新構(gòu)建 細(xì)菌質(zhì)粒載體 噬菌體衍生載體 Cosmid載體（粘粒） 噬菌體M13衍生載體 Phagemid載體 酵母質(zhì)粒載體 真核病毒載體3克隆載體與表達(dá)載體克隆載體：攜帶外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞并 使外源DNA大量擴(kuò)增。表達(dá)載體：表達(dá)外源基因編碼的蛋白質(zhì)，載體克隆位點(diǎn)的上游應(yīng)含有啟動(dòng)子，下游含有轉(zhuǎn)錄終止序列。4第一 節(jié). 質(zhì)粒 Plasmid質(zhì)粒是存在于細(xì)菌細(xì)胞染色體外、能自主復(fù)制的小分子環(huán)狀雙鏈DNA分子。又稱為cccDNA（Covalently Closed Circular DNA）。5野生型質(zhì)粒的大小一般在2

2、-200Kb 基因工程常用質(zhì)粒在2-4Kb之間 質(zhì)粒并不是細(xì)菌生長(zhǎng)所必須的，但可為宿主執(zhí)行一定的遺傳功能，如抗生素的抗性、重金屬離子的抗性、細(xì)菌毒素的分泌等。6質(zhì)粒質(zhì)粒 (plasmid)71 .質(zhì)粒類型: 嚴(yán)緊型質(zhì)粒(stringent plasmid)1-5個(gè)拷貝/細(xì)胞 松弛型質(zhì)粒(relaxed plasmid):數(shù)十個(gè)/細(xì)胞質(zhì)粒在細(xì)胞中的拷貝數(shù)有時(shí)與寄主的種類有關(guān)。82. 質(zhì)粒載體必須具備的條件（1）分子量相對(duì)較小，能在細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)定存）分子量相對(duì)較小，能在細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)定存在，有較高的拷貝數(shù)。在，有較高的拷貝數(shù)。（2）具有一個(gè)以上的遺傳標(biāo)志，便于對(duì)宿）具有一個(gè)以上的遺傳標(biāo)志，便于對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行

3、選擇，如抗生素的抗性基因，主細(xì)胞進(jìn)行選擇，如抗生素的抗性基因，-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（Lac Z）等。）等。9（3）具有多個(gè)限制性內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)，便）具有多個(gè)限制性內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)，便于外源基因的插入。如果在這些位點(diǎn)有外于外源基因的插入。如果在這些位點(diǎn)有外源基因的插入，會(huì)導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失源基因的插入，會(huì)導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，而便于篩選?；睿阌诤Y選。10質(zhì)粒性質(zhì)不相容性（不親和性） 具有相同或相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)及特征的兩種不同質(zhì)粒，不能穩(wěn)定的存在于同一受體細(xì)胞內(nèi)，這種現(xiàn)象稱作質(zhì)粒的不相容性。 113. 質(zhì)粒載體的選擇性標(biāo)記 抗菌素抗性 新陳代謝特性12 抗菌素名稱抗菌素名稱 抗

4、菌素作用方式抗菌素作用方式 宿主菌抗性機(jī)理宿主菌抗性機(jī)理氨芐青霉素（氨芐青霉素（Amp） 干擾細(xì)菌細(xì)胞壁合成干擾細(xì)菌細(xì)胞壁合成 編碼編碼 -內(nèi)酰胺酶內(nèi)酰胺酶,切割切割A(yù)mp -內(nèi)酰胺環(huán)內(nèi)酰胺環(huán)氯霉素（氯霉素（Cml） 抑菌劑抑菌劑,與與50S結(jié)合結(jié)合,干擾干擾 編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶,使使氯霉素氯霉素 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)合成合成 乙?；Щ钜阴；Щ羁敲顾兀敲顾兀↘an） 殺菌劑殺菌劑,與與70S結(jié)合結(jié)合,mRNA 編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶, 發(fā)生錯(cuò)讀發(fā)生錯(cuò)讀 修飾修飾Kan失活失活鏈霉素鏈霉素（Sm） 殺菌劑殺菌劑,與與30S結(jié)合結(jié)合,mRNA 編碼特異修飾酶編碼特

5、異修飾酶 發(fā)生錯(cuò)讀發(fā)生錯(cuò)讀四環(huán)素（四環(huán)素（Tet） 抑菌劑抑菌劑,與與30S結(jié)合，阻止結(jié)合，阻止 編碼特異蛋白編碼特異蛋白,修飾細(xì)菌膜修飾細(xì)菌膜 蛋白合成蛋白合成 結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu),阻止阻止Tet通過(guò)細(xì)胞膜通過(guò)細(xì)胞膜13復(fù)制起點(diǎn)氨芐青霉素抗性基因14常用的質(zhì)粒載體1.pBR3222.220載體是我國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所自行構(gòu)建的大腸桿菌溫控表達(dá)載體。3.pUC系列:如pUC118、pUC119，兩者之間的差別在于多克隆位點(diǎn)不同。151617184.融合表達(dá)載體如GST融合表達(dá)系統(tǒng)。載體中含有細(xì)菌的谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST）基因，外源基因克隆在GST基因的下游。當(dāng)基因表達(dá)時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物為GST與目的

6、蛋白的融合體。19融合表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn) 表達(dá)效率高 融合蛋白易純化： 抗GST的蛋白質(zhì)作為特異性抗體， 用親和層析法從細(xì)胞裂解液中純化出融合蛋白； 可從融合蛋白中分離出單一的外源蛋白質(zhì)GST與外源蛋白之間克隆上蛋白酶的切割位點(diǎn)，可用適當(dāng)?shù)拿盖懈睢?0例如加裝一段編碼Ile-Glu-Gly-Arg寡肽序列的人工接頭片斷，該片斷可被具有蛋白酶活性的凝血因子a切割，從Arg后切開(kāi)。目的蛋白中出現(xiàn)此種序列的可能性極小，因此該方法用途廣泛。21QIAexpress 6His表達(dá)系統(tǒng) 重組蛋白質(zhì)的末端帶有6個(gè)組氨酸殘基，對(duì)帶有Ni離子的層析介質(zhì)有高度的親和力，易于純化。 6個(gè)組氨酸殘基質(zhì)量小，不影響蛋白質(zhì)的

7、結(jié)構(gòu)和功能，無(wú)需切除。 6個(gè)組氨酸殘基免疫原性差，重組蛋白可以直接用做抗原。22第二節(jié)第二節(jié) 噬菌體類噬菌體類 噬菌體是一類細(xì)菌病毒的總稱，英文噬菌體是一類細(xì)菌病毒的總稱，英文名為名為Bacteriophage,簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱phage。噬菌體可。噬菌體可以在脫離寄主細(xì)胞的狀態(tài)下保持自己的生以在脫離寄主細(xì)胞的狀態(tài)下保持自己的生命，但必須依賴寄主細(xì)胞才能復(fù)制生長(zhǎng)。命，但必須依賴寄主細(xì)胞才能復(fù)制生長(zhǎng)。23噬菌體（bacteriophage, phage） 噬菌體是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒。 病毒的特性： 個(gè)體微小，可以通過(guò)細(xì)菌濾器 沒(méi)有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，由蛋白質(zhì)和核酸組成 專性細(xì)胞內(nèi)寄

8、生的微生物 可分為12個(gè)科24噬菌體的生物學(xué)性狀25噬菌體的生物學(xué)性狀 形態(tài) 個(gè)體小，需用電子顯微鏡觀察 蝌蚪形、微球形和絲形The black bars are size bars representing 100 nm. 262728 用作克隆載體的噬菌體有兩類：一類是用作克隆載體的噬菌體有兩類：一類是噬菌體，另一類是噬菌體，另一類是M13噬菌體。噬菌體。 野生型野生型噬菌體經(jīng)過(guò)改造，已衍生出噬菌體經(jīng)過(guò)改造，已衍生出100多多種克隆載體。種克隆載體。 噬菌體載體分為插入型和替換噬菌體載體分為插入型和替換型型(置換型置換型)兩類。兩類。 目前應(yīng)用較廣的是目前應(yīng)用較廣的是EMBL系列、系列、g

9、t系列和系列和Charon系列等。系列等。 29噬菌體（lambda phage) 噬菌體是可以感染細(xì)菌的病毒，是大腸桿菌的溫和型噬菌體。由外殼蛋白外殼蛋白與一個(gè)48.5kb的雙鏈線狀雙鏈線狀DNA分子組成。經(jīng)過(guò)改造形成的噬菌體載體有較高的轉(zhuǎn)化效率。30在在噬菌體DNA分子雙鏈的5端，各有一段由12個(gè)核苷酸組成的互補(bǔ)的單鏈凸出序列，即通常所說(shuō)的黏性末端。在寄主細(xì)胞內(nèi)，會(huì)通過(guò)黏性末端的互補(bǔ)作用，形成環(huán)型雙鏈DNA分子。這種由黏性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段稱為cos位點(diǎn)。（cos : cohensive end site)31 3CCCGCCGCTGGAGGGCGGCGACCT3 在黏性末端的12個(gè)堿

10、基中，有10個(gè)是GC。通過(guò)堿基配對(duì)線性分子環(huán)化起來(lái)，由此形成的雙鏈區(qū)，叫做cos位點(diǎn)。32 噬菌體基因組含50余個(gè)基因，功能相近的基因聚集成簇。有些基因?qū)κ删w的生長(zhǎng)不是必須的，可以被外源DNA片段取代。 噬菌體上有56種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，約300余切點(diǎn)。比如BamHI分別在第5505、22346、27972、34499和41732處有識(shí)別位點(diǎn)。 33噬菌體的生長(zhǎng)途徑 噬菌體有溶原和溶菌兩種生長(zhǎng)途徑。 溶原生長(zhǎng)途徑是指噬菌體的DNA整合在宿主染色體上，隨宿主染色體的復(fù)制而復(fù)制。以原噬菌體的形式潛伏起來(lái)。一旦宿主細(xì)胞處于某種條件下時(shí)， 噬菌體的DNA脫離染色體，重新進(jìn)入溶菌生長(zhǎng)途徑。34

11、溶菌生長(zhǎng)是指噬菌體在宿主細(xì)胞中黏性末端連接，成為環(huán)形DNA分子，借用宿主細(xì)胞的體系，合成病毒包裝所需的外殼蛋白，新復(fù)制的DNA與外殼蛋白包裝成新的病毒顆粒。宿主細(xì)胞膜在R蛋白和S蛋白的作用下破裂，釋放出大量子代噬菌體顆粒，感染新的細(xì)胞。35噬菌體的生活史噬菌體的生活史溶菌生長(zhǎng)途徑溶菌生長(zhǎng)途徑(lysis pathway)溶源菌生長(zhǎng)途徑溶源菌生長(zhǎng)途徑(lysogenic pathway)36M13噬菌體 單鏈DNA,基因組含6407個(gè)堿基.經(jīng)過(guò)基因改造后，形成M13mp系列。 可容納遠(yuǎn)大于自身基因組的外源DNA,(7倍). M13噬菌體感染細(xì)胞后,不裂解宿主細(xì)胞,但妨礙宿主細(xì)胞的生長(zhǎng),因此可見(jiàn)培

12、養(yǎng)平板上的混濁噬菌斑.37噬斑38 單鏈的M13噬菌體（）進(jìn)入受體菌后，以自身為模板，復(fù)制出互補(bǔ)鏈（），成為雙鏈的結(jié)構(gòu)，稱為復(fù)制型DNA。復(fù)制型DNA在細(xì)胞內(nèi)可達(dá)200個(gè)拷貝。此時(shí)， （）鏈被特異的蛋白質(zhì)阻斷，不再生成新的（）鏈。只能生成新的（）鏈。 （）鏈DNA被殼蛋白包裝組成病毒顆粒，擠出宿主細(xì)胞。39科斯質(zhì)粒載體 （cosmid） 又稱粘粒載體，簡(jiǎn)稱粘粒。 環(huán)形雙鏈DNA分子，一般為46Kb。 該載體含有DNA的cos序列（不少于280個(gè)bp）和pBR322質(zhì)粒的序列。該載體轉(zhuǎn)化效率高?？扇菁{高達(dá)45kb的外源DNA。以感染方式進(jìn)入宿主細(xì)胞,在宿主體內(nèi)象質(zhì)粒那樣復(fù)制.40 粘粒載體可像質(zhì)

13、粒一樣在細(xì)菌中繁殖，有的（pWE15/16）可以在哺乳動(dòng)物中繁殖。又能像DNA一樣體外包裝，并高效導(dǎo)入受體細(xì)胞。 屬松弛型質(zhì)粒，拷貝數(shù)較多。4142農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒 根癌農(nóng)桿菌含有一種內(nèi)源質(zhì)粒，當(dāng)農(nóng)桿菌與植物接觸時(shí)，這種質(zhì)粒會(huì)引發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤，故名Ti質(zhì)粒（tumor inducing plasmid）。 Ti質(zhì)粒為雙鏈環(huán)狀DNA分子，200250Kb之間。 Ti質(zhì)粒進(jìn)入植物細(xì)胞的只是一小部分，約25kb，稱為T-DNA（transfer DNA）。43 T-DNA兩端各有一個(gè)25bp的正向重復(fù)序列，在不同的Ti質(zhì)粒中是高度保守的，該序列對(duì)于T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合是不可缺少的。 利用大腸桿菌質(zhì)粒

14、與T-DNA的部分序列重組，構(gòu)建Ti質(zhì)粒克隆載體，可用于植物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移。44第三節(jié) 酵母細(xì)胞基因工程載體 酵母是最簡(jiǎn)單的單細(xì)胞真核生物。 酵母可對(duì)表達(dá)的多肽鏈進(jìn)行加工和修飾，如二硫鍵的正確形成、糖基化、除去N端的甲硫氨酸等。45酵母菌的克隆載體YIP 酵母整合型質(zhì)粒YRP 酵母復(fù)制型質(zhì)粒YEP 酵母附加子型載體CIP 酵母菌著絲粒型質(zhì)粒46上述質(zhì)粒均可在大腸桿菌和酵母菌中穩(wěn)定存在，即所謂的穿梭質(zhì)粒穿梭質(zhì)粒。這些質(zhì)粒含有兩種可供篩選的選擇性標(biāo)記。47YIp載體URA3 乳清苷酸脫羧酶48 酵母菌表達(dá)載體1.選擇性標(biāo)志 當(dāng)使用大腸桿菌做為宿主細(xì)胞時(shí)，多使用抗生素抗性作為篩選標(biāo)志。由于酵母菌對(duì)許

15、多抗生素不敏感，故需要其他的篩選標(biāo)志。野生型基因：URA3（尿嘧啶）、LEU2、HIS3、TRP1 （色氨酸） 這些基因可補(bǔ)償酵母菌細(xì)胞中某一種特定的代謝缺陷（營(yíng)養(yǎng)缺陷）492 .啟動(dòng)子含有可被RNA聚合酶II識(shí)別的酵母啟動(dòng)子 GAL、GAL10（半乳糖激酶） PHO5（堿性磷酸酶） ADH （醇脫氫酶） TP1 （丙糖磷酸異構(gòu)酶） PGK （磷酸甘油酸激酶） GAP （磷酸甘油醛脫氫酶） SUC （蔗糖酶）50注釋：細(xì)胞內(nèi)某些蛋白質(zhì)豐度較高，如PGK （磷酸甘油酸激酶）、GAP （磷酸甘油醛脫氫酶），各占細(xì)胞總蛋白的5%，屬于高含量的蛋白質(zhì)，它們的啟動(dòng)子為強(qiáng)啟動(dòng)子。51酵母分泌型表達(dá)載體 這

16、類載體可以使目的蛋白分泌到細(xì)胞外。 載體內(nèi)除含有一般表達(dá)質(zhì)粒的必要成分外，還需有一個(gè)控制蛋白質(zhì)分泌的信號(hào)序列。其編碼的多肽鏈叫做信號(hào)肽。信號(hào)肽內(nèi)多含疏水性氨基酸。52第四節(jié) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體53病毒侵入動(dòng)物細(xì)胞后，有兩種生長(zhǎng)狀態(tài) 溶細(xì)胞感染 病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)合成自身的核酸和結(jié)構(gòu)蛋白，裝配成完整的子代病毒顆粒，釋放到細(xì)胞外，擴(kuò)大感染，宿主細(xì)胞因?yàn)榇x障礙而死亡。 整合性感染 病毒核酸整合到宿主細(xì)胞的染色體中，隨細(xì)胞DNA的復(fù)制而擴(kuò)增。54病毒載體： （1）含有能夠被真核細(xì)胞識(shí)別的有效啟動(dòng)子 （2）在感染周期中能夠持續(xù)復(fù)制，達(dá)到很高的拷貝數(shù)。 （3）控制自己復(fù)制的元件 （4）有些載體可高效穩(wěn)定

17、地整合到寄主基 因組上 （5）外殼蛋白識(shí)別細(xì)胞受體，可將外源基 因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞。551.SV40病毒病毒載體載體SV40：猿猴空泡病毒（Simian vacuolating virus 40) 環(huán)型雙鏈DNA分子，含5243bp。優(yōu)點(diǎn)：1.感染率高；2.拷貝數(shù)高；3.轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 高；缺點(diǎn)：1.宿主范圍窄；2.最終導(dǎo)致感染細(xì)胞死 亡； 3.制備耗時(shí)，成本較高。56SV40病毒載體的改建病毒的部分序列質(zhì)粒的部分序列 如PSV2 包括 病毒的復(fù)制起始區(qū)、早期啟動(dòng)子、 增強(qiáng)子序列、部分t抗原基因 pBR322的復(fù)制起始區(qū)、氨芐青霉素 抗性基因57病毒-質(zhì)粒載體 病毒的早期區(qū)段和復(fù)制起點(diǎn)+大腸桿菌的質(zhì)

18、粒分子重組而成。例如：pC10早期區(qū)段和復(fù)制起點(diǎn)（多瘤病毒）質(zhì)粒pBR322的部分區(qū)段 這種載體既可在大腸桿菌中復(fù)制，也可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制，稱之為穿梭載體。58改造后的病毒優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1.不需病毒顆粒的包裝過(guò)程，故可插入較大長(zhǎng) 度的DNA片段。2.不引起宿主細(xì)胞的裂解，可建立穩(wěn)定傳代的 細(xì)胞株。3.整合到宿主細(xì)胞的染色體中，重組基因不會(huì)丟失。 缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)染效率低于萬(wàn)分之一。59受納細(xì)胞：SV40感染CV-1或AGMK猿猴細(xì)胞后，產(chǎn)生感染性病毒顆粒，并使宿主細(xì)胞裂解，這種感染稱為裂解感染，而猿猴細(xì)胞則稱為受納細(xì)胞。60非受納細(xì)胞：SV40感染倉(cāng)鼠細(xì)胞后，不產(chǎn)生感染顆粒，病毒基因組整合到

19、宿主細(xì)胞染色體上，細(xì)胞被轉(zhuǎn)化（癌變），這種嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞為SV40病毒的非受納細(xì)胞。61逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒是一類單鏈RNA病毒。 宿主范圍廣，感染動(dòng)物或人的細(xì)胞。 感染效率高，理論上可達(dá)100。 具有強(qiáng)啟動(dòng)子。 不引起宿主細(xì)胞的死亡，可以維持許多代存在問(wèn)題：1.容量小，低于10kb。 2.可能引起細(xì)胞癌變。62腺病毒載體（AV） 線性雙鏈DNA病毒，經(jīng)過(guò)改造的腺病毒載體，缺失了大部分的病毒基因，更加安全。 63 優(yōu)點(diǎn)：基因組大，可插入大片段的外源基因，最多可 達(dá) 35kb； 可高效的感染不同類型的人體組織細(xì)胞； 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)不整合進(jìn)宿主的基因組，僅瞬間表達(dá)。 缺點(diǎn) 免疫原性強(qiáng)，可刺激機(jī)體

20、產(chǎn)生免疫反應(yīng)； 幾乎可感染所有的細(xì)胞，缺乏特異性。64腺相關(guān)病毒載體（AAV）：屬于非致病的微小 病毒科家族的成員，只有依賴于輔助病毒才能繁殖。 特點(diǎn)： 基因組小，只有幾個(gè)kb； 無(wú)致病性； 免疫原性弱； 裝載外源基因容量小，不超過(guò)5kb； 制備過(guò)程復(fù)雜 ；65痘苗病毒載體：痘苗病毒是動(dòng)物病毒中最大的一種，與天花病毒有密切的親緣關(guān)系。長(zhǎng)期被用作預(yù)防天花的疫苗。 病毒基因組中有很大的非必需區(qū)（28kb），可以切除，代之以較大的外源基因，或者同時(shí)插入幾個(gè)外源基因，構(gòu)成多價(jià)疫苗。66哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移的選擇標(biāo)記 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶：G418 二氫葉酸還原酶（DHFR）MTX（氨甲喋呤） 胸苷激酶（TK）： APT （氨基喋呤） 潮霉素-B-磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH）：潮霉素-B 黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（XGPRT）：霉酚酸 腺嘌呤核糖脫氨酶（ADA）：67嘌呤和嘧啶合成知識(shí)的回顧 哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的兩條合成途徑1 從頭合成：利用各種小分子，如氨基酸、C