體內(nèi)藥物分析薄層色譜法ppt課件

1、 色譜法色譜法 色譜法是一種物理或物理化學(xué)的分別分析方法，其分別原理主要是利用物質(zhì)在流動(dòng)相和固定相中的分配系數(shù)、或吸附才干等的差別而得到分別。 隨著臨床藥學(xué)的迅速開(kāi)展，色譜法在體內(nèi)藥物分析中的運(yùn)用更為廣泛，具有不可取代的重要位置，已成為體內(nèi)藥物分別檢測(cè)最重要的方法 液相色譜法是運(yùn)用最廣的分別分析方法，液相色譜法是運(yùn)用最廣的分別分析方法， 特別是對(duì)于復(fù)雜樣品的分析尤為重要。液相色特別是對(duì)于復(fù)雜樣品的分析尤為重要。液相色譜法的分支很多，譜法的分支很多， 廣義的液相色譜法包括：高廣義的液相色譜法包括：高效液相色譜法、薄層色譜法、超臨界流體色譜效液相色譜法、薄層色譜法、超臨界流體色譜法、毛細(xì)管電泳法等

2、類別，法、毛細(xì)管電泳法等類別， 而它們又各自包括而它們又各自包括多種方法。多種方法。 色譜法包括紙色譜、薄層色譜、凝膠色譜、氣相色譜和液相色譜 第一節(jié)第一節(jié) 薄層色譜法薄層色譜法TLCTLC 是指將固定相均勻地涂布在具有光潔外表的玻璃、塑料或金屬膜等外表上構(gòu)成薄層，將被分別物質(zhì)點(diǎn)在薄層板的一端，置展開(kāi)室中，展開(kāi)劑借毛細(xì)管作用從薄層點(diǎn)樣的一端展開(kāi)到另一端，在此過(guò)程中不同物質(zhì)可以進(jìn)展色譜分別。 根據(jù)不同的分別機(jī)制，薄層色譜法可以分為根據(jù)不同的分別機(jī)制，薄層色譜法可以分為吸附薄層色譜、分配薄層色譜、離子交換薄層色吸附薄層色譜、分配薄層色譜、離子交換薄層色譜和凝膠薄層色譜。譜和凝膠薄層色譜。薄層色譜的

3、特點(diǎn)：薄層色譜的特點(diǎn)：可以同時(shí)平行分別多個(gè)樣品；分析本錢(qián)低；對(duì)樣品預(yù)可以同時(shí)平行分別多個(gè)樣品；分析本錢(qián)低；對(duì)樣品預(yù)處置要求低；薄層板一次性運(yùn)用，對(duì)樣品要求不高；處置要求低；薄層板一次性運(yùn)用，對(duì)樣品要求不高；對(duì)固定相、展開(kāi)劑的選擇自在度大。對(duì)固定相、展開(kāi)劑的選擇自在度大。傳統(tǒng)的傳統(tǒng)的TLC法缺陷：法缺陷：展開(kāi)時(shí)間長(zhǎng)、展開(kāi)劑體積需求大和分別結(jié)果差等。其展開(kāi)時(shí)間長(zhǎng)、展開(kāi)劑體積需求大和分別結(jié)果差等。其色譜結(jié)果易受鋪板質(zhì)量、點(diǎn)樣技術(shù)、展開(kāi)劑配制、層色譜結(jié)果易受鋪板質(zhì)量、點(diǎn)樣技術(shù)、展開(kāi)劑配制、層析環(huán)境中展開(kāi)劑的飽和度、環(huán)境溫、濕度等要素的影析環(huán)境中展開(kāi)劑的飽和度、環(huán)境溫、濕度等要素的影響，有時(shí)難于反復(fù)；顯

4、色易受均勻性、靈敏度、穩(wěn)定響，有時(shí)難于反復(fù)；顯色易受均勻性、靈敏度、穩(wěn)定性等影響，這均使測(cè)定結(jié)果偏向較大。性等影響，這均使測(cè)定結(jié)果偏向較大。 是近年來(lái)迅速開(kāi)展的一種高效、快速、操作是近年來(lái)迅速開(kāi)展的一種高效、快速、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高和重現(xiàn)性好的薄層色簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高和重現(xiàn)性好的薄層色譜新技術(shù)，它采用更細(xì)、更均勻的改性硅膠和纖譜新技術(shù)，它采用更細(xì)、更均勻的改性硅膠和纖維素等為固定相，對(duì)吸附劑進(jìn)展疏水和親水改性，維素等為固定相，對(duì)吸附劑進(jìn)展疏水和親水改性，可以實(shí)現(xiàn)正相和反相薄層色譜分別，提高了色譜可以實(shí)現(xiàn)正相和反相薄層色譜分別，提高了色譜的選擇性，已廣泛用于各個(gè)領(lǐng)域。的選擇性，已

5、廣泛用于各個(gè)領(lǐng)域。高效薄層色譜法高效薄層色譜法high performance thin-layer chromatography (HPTLC) 與傳統(tǒng)與傳統(tǒng)TLC相比，高效薄層色譜法在薄層制備、展相比，高效薄層色譜法在薄層制備、展開(kāi)方式、分析鑒定手段以及相配套的儀器設(shè)備等方面進(jìn)開(kāi)方式、分析鑒定手段以及相配套的儀器設(shè)備等方面進(jìn)展了展了 許多改革，其中最根本的是固定相的改良。許多改革，其中最根本的是固定相的改良。 而在而在TLC、HPTLC和和UPTLC三種規(guī)三種規(guī)格的預(yù)制硅膠薄層板中，又以格的預(yù)制硅膠薄層板中，又以HPTLC最最能表達(dá)出薄層色譜分析效率高且經(jīng)濟(jì)適能表達(dá)出薄層色譜分析效率高且經(jīng)

6、濟(jì)適用的特點(diǎn)。其運(yùn)用在目前的科研和日常用的特點(diǎn)。其運(yùn)用在目前的科研和日常分析中越來(lái)越得到普及。無(wú)定形分析中越來(lái)越得到普及。無(wú)定形HPTLC硅膠的平均粒徑和粒徑分布范圍相對(duì)硅膠的平均粒徑和粒徑分布范圍相對(duì)TLC有較大改善，以較短的展開(kāi)間隔和有較大改善，以較短的展開(kāi)間隔和時(shí)間就可以獲得較高的實(shí)際塔板數(shù)和分時(shí)間就可以獲得較高的實(shí)際塔板數(shù)和分別度。別度。 由于成分斑點(diǎn)更為集中，因此所由于成分斑點(diǎn)更為集中，因此所需的有效涂層厚度也大為減少，檢測(cè)靈需的有效涂層厚度也大為減少，檢測(cè)靈敏度也因此較敏度也因此較TLC有一個(gè)數(shù)量級(jí)的提高。有一個(gè)數(shù)量級(jí)的提高。C18：弱極性Diol: 二醇醚改性CN：丙基腈改性NH

7、2：丙氨基改性兩個(gè)根本要求：兩個(gè)根本要求：第一，點(diǎn)樣位置需準(zhǔn)確；第一，點(diǎn)樣位置需準(zhǔn)確；第二，尤其對(duì)于定量分析，點(diǎn)樣體積需求準(zhǔn)確和準(zhǔn)確。第二，尤其對(duì)于定量分析，點(diǎn)樣體積需求準(zhǔn)確和準(zhǔn)確。點(diǎn)樣點(diǎn)樣 為了提高分別效率，原點(diǎn)在展開(kāi)方向應(yīng)該盡能夠小，對(duì)于HPTLC，應(yīng)小于1.5mm，點(diǎn)狀點(diǎn)樣：體積遭到嚴(yán)厲限制。在點(diǎn)狀點(diǎn)樣：體積遭到嚴(yán)厲限制。在HPTLC板上點(diǎn)狀點(diǎn)樣體板上點(diǎn)狀點(diǎn)樣體積通常為積通常為0.1-1L。溶劑在板上分散會(huì)。溶劑在板上分散會(huì)“環(huán)形色譜。環(huán)形色譜。非接觸噴霧式條帶狀點(diǎn)樣：均勻，可提高解析度和檢測(cè)限。非接觸噴霧式條帶狀點(diǎn)樣：均勻，可提高解析度和檢測(cè)限。由于由于HPTLC分散小，分散小，10*

8、10cm板可點(diǎn)板可點(diǎn)16個(gè)樣品個(gè)樣品薄層色譜有別于其他色譜技術(shù)，除了都有固定相和流動(dòng)相外，還存在氣相。氣相會(huì)對(duì)分別結(jié)果產(chǎn)生顯著影響。展開(kāi)室預(yù)先用展開(kāi)劑飽和展開(kāi)間隔由于TLC中流動(dòng)相的速度不是固定的，而是隨展開(kāi)時(shí)間和展開(kāi)間隔添加而降低，所以展開(kāi)間隔有一定限制。通常在HPTLC板上5cm展距分辨率較高 展開(kāi)1、顯色劑顯色法：噴霧顯色，借助噴霧器噴、顯色劑顯色法：噴霧顯色，借助噴霧器噴細(xì)霧至板面潮濕。細(xì)霧至板面潮濕。2、紫外線照射法：如、紫外線照射法：如AFTB1在在WL365nm察看；察看；3、對(duì)本身是有色的斑點(diǎn)那么不需顯色。、對(duì)本身是有色的斑點(diǎn)那么不需顯色。 顯色顯色1、定性：斑點(diǎn)顯色后量出高度

9、，求得、定性：斑點(diǎn)顯色后量出高度，求得Rf值值2、定量方法、定量方法 目視直接比較法目視直接比較法 洗脫測(cè)定法洗脫測(cè)定法 薄層掃描法薄層掃描法定性定量定性定量薄層掃描法普通由薄層掃描儀完成。該儀器普薄層掃描法普通由薄層掃描儀完成。該儀器普通由以下部分組成計(jì)算機(jī)、光源、單色光器、通由以下部分組成計(jì)算機(jī)、光源、單色光器、監(jiān)測(cè)器、打印機(jī)、記錄儀。按測(cè)定方法分可分監(jiān)測(cè)器、打印機(jī)、記錄儀。按測(cè)定方法分可分為透射法、反射法。按其掃描方式可分為線性為透射法、反射法。按其掃描方式可分為線性掃描法、鋸齒掃描法、飛點(diǎn)掃描法或稱之為微掃描法、鋸齒掃描法、飛點(diǎn)掃描法或稱之為微光點(diǎn)快速掃描法。瑞士和日本島津類型儀器所光

10、點(diǎn)快速掃描法。瑞士和日本島津類型儀器所采用的是鋸齒掃描或飛點(diǎn)掃描法。目前是以鋸采用的是鋸齒掃描或飛點(diǎn)掃描法。目前是以鋸齒掃描和飛點(diǎn)掃描法為佳。齒掃描和飛點(diǎn)掃描法為佳。 瑞士卡瑪瑞士卡瑪CAMAG公司的儀器公司的儀器全自動(dòng)、 半自動(dòng)、 手動(dòng)點(diǎn)樣儀 條帶狀噴霧式樣品點(diǎn)樣CAMAG全自動(dòng)展開(kāi)儀全自動(dòng)展開(kāi)儀ADC2 薄層板切割器:西洋參在UV366下的色譜圖指紋圖譜Visualizer數(shù)碼成像系統(tǒng) 薄層色譜掃描儀、任務(wù)站薄層色譜掃描儀、任務(wù)站可進(jìn)展薄層色譜光密度分析可進(jìn)展薄層色譜光密度分析一整套儀器要一整套儀器要30多萬(wàn)人民幣多萬(wàn)人民幣例子：例子： 高效薄層色譜法測(cè)定高效薄層色譜法測(cè)定人血清中鹽酸胺碘

11、酮人血清中鹽酸胺碘酮 鹽酸胺碘酮為臨床上常用的抗心律失常藥物，其治療指數(shù)低平安范圍窄，且個(gè)體差別大，為了解治療效果與血藥濃度的關(guān)系，我們建立高效薄層色譜法(HPTLC)。本法操作簡(jiǎn)便易行，不失為臨床鹽酸胺碘酮監(jiān)測(cè)的有效方法。供試品溶液的制備 精細(xì)量取血清1. 0 mL置磨口試管中，參與 l.0 mL pH3鹽酸溶液，再加人3.0 mL的氯仿，振蕩，移出氯仿層。提取兩次。將兩次氯仿液合并，于55水浴上蒸干，點(diǎn)樣前用約0.1 mL 氯仿溶解。 薄層色譜條件薄層色譜條件 樣品與規(guī)范品分別點(diǎn)于同一含羧甲基纖維素鈉(為粘合劑)的硅膠60 GF254薄層板上，以無(wú)水乙醇一氨水(50：1)為展開(kāi)劑程度展開(kāi)，

12、取出晾干，置紫外燈(254nm)下確定斑點(diǎn)位置。斑點(diǎn)顏色為黑褐色 采用雙波長(zhǎng)反射法鋸齒掃描：測(cè)定波長(zhǎng)242nm，參比波長(zhǎng)370rim；背景補(bǔ)償；線性參數(shù)Sx：3；掃描步距Y=004；狹縫寬度0.4mm0.4mm。薄層掃描圖見(jiàn)圖2。薄層掃描條件薄層掃描條件 血清規(guī)范曲線的制備血清規(guī)范曲線的制備 分別精細(xì)汲取對(duì)照品分別精細(xì)汲取對(duì)照品溶液溶液(濃度為濃度為1.0gmL)0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0L加人加人磨口試管中，再加人血磨口試管中，再加人血清清l.0mL，按供試品溶液，按供試品溶液的制備方法操作的制備方法操作 取同一對(duì)照品溶液，分別點(diǎn)于5塊含羧甲基纖維素(為粘臺(tái)劑)的硅膠60GF 薄層板上(4種不同點(diǎn)樣量)依法展開(kāi)后掃描測(cè)定。吸收數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。板間誤差測(cè)定：板間誤差測(cè)定：穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、板內(nèi)誤差測(cè)定、儀器精細(xì)度測(cè)定、回收率實(shí)驗(yàn) 都很好中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志2019年年4月月血清中樂(lè)果的高效薄層色譜快速分析方法和氣相色譜方法比血清中樂(lè)果的高效薄層色譜快速分析方法和氣相色譜方法比對(duì)研討對(duì)研討 潘亞娟潘亞娟樣品預(yù)處置：樣品預(yù)處置：TLC法直接取離心后血清法直接取離心后血清測(cè)定測(cè)定TLC法：用微量注射器分別取樂(lè)果規(guī)范溶液