紫外-可見光譜及熒光光譜

1、紫外紫外-可見光譜與熒光可見光譜與熒光光譜分析方法光譜分析方法主要內(nèi)容光譜產(chǎn)生的原理光譜儀的基本構(gòu)造光譜分析的應(yīng)用光譜儀的操作方法光譜的產(chǎn)生：輻射躍遷光吸收和光發(fā)射分子的電子光譜：通過光與分子的相互作用，基態(tài)分子吸收光躍遷到電子激發(fā)態(tài)和電子激發(fā)態(tài)發(fā)射光躍遷到基態(tài)的光物理過程吸收光譜發(fā)射光譜（紫外可見吸收光譜）（熒光光譜、磷光光譜）分子的電子吸收光譜和電子發(fā)射光譜為電子激發(fā)態(tài)的結(jié)構(gòu)、能學(xué)和動態(tài)學(xué)的研究提供了重要的信息（1）光譜的產(chǎn)生光是什么？分子為什么會/能吸收光？圖：電磁波（一個小的有機(jī)分子的“尺寸”比一個波長要小得多）作為電磁波：可對帶電粒子（例如電子與核）和磁偶極子（如電子自旋和核自旋）施

2、加電力和磁力光是一種電磁波，可以看成是由在光傳播方向上互相垂直的兩個平面上相互作用的交變電場與交變磁場組成的。 光與分子的相互作用看作是振蕩偶極子（電子）和輻射場（振蕩電場）產(chǎn)生的一種能量交換過程。偶極子理解光與分子相互作用的關(guān)鍵概念是： 光的振蕩電場可以使電子運(yùn)動，也就是被激發(fā)的電子表現(xiàn)得象是一個振蕩的偶極子。這種偶極子的振蕩相當(dāng)于化學(xué)鍵中的電子相對于物質(zhì)中帶正電的原子核的運(yùn)動，也就是電子圍繞分子的核骨架振動。在分子的電子云中任一給定點(diǎn)，光波引起的電場強(qiáng)度變化將是時間的函數(shù)即：零 （吸引）最大值 零 （產(chǎn)生一個相反的場） （排斥）最大值 零重合 （正、負(fù)電中心） 分開圖： 電場誘導(dǎo)產(chǎn)生偶極矩

3、 0 0ii凈效應(yīng)：瞬時偶極矩偶極矩光與分子之間的相互作用取決于共振能量： E E h=hc/光子能量：E=hv h:普朗克常數(shù) 6.62617610-34焦耳秒 v: 頻率 c:光速 : 波長 電子能級的一個基本特點(diǎn)：能級量子化電子的躍遷能級差約為1 20 eV，比分子振動能級差要大幾十倍 kT = 25 meV 體系熱能的標(biāo)度E電子躍遷所處的波長范圍（能量）電子躍遷類型：電子躍遷類型： （1）* 躍遷躍遷 指處于成鍵軌道上的指處于成鍵軌道上的電子吸收光子后被激發(fā)躍遷到電子吸收光子后被激發(fā)躍遷到*反鍵軌道反鍵軌道 （2）n* 躍遷躍遷 指分子中處于非鍵軌道上的指分子中處于非鍵軌道上的n電子吸

4、收能量后向電子吸收能量后向*反鍵軌道的躍遷反鍵軌道的躍遷 （3）* 躍遷躍遷 指不飽和鍵中的指不飽和鍵中的電子吸收光波能量后躍遷到電子吸收光波能量后躍遷到*反鍵軌道。反鍵軌道。 （4）n* 躍遷躍遷 指分子中處于非鍵軌道上的指分子中處于非鍵軌道上的n電子吸收能量后向電子吸收能量后向*反鍵軌道的躍遷。反鍵軌道的躍遷。（2）光吸收與光發(fā)射光譜相關(guān)的一些基本概念你做過吸收和發(fā)射光譜嗎？你為什么要做吸收和發(fā)射光譜？你理解的吸收和發(fā)射光譜是什么？S0S1T1T2S2VRVRVRISCISCICFPCRCREXhhEXEXhVRIC光反應(yīng)產(chǎn)物吸收光譜與測試吸收光譜與測試 一個基態(tài)分子M吸收能量為h的一個光

5、子，使占據(jù)軌道的一個電子躍遷到空軌道而處于電子激發(fā)態(tài)M*，這種光激發(fā)過程可表示為 MhM* 通過吸收光譜的測定，可以確定與躍遷相關(guān)的兩個軌道的能級間隔。 吸收光譜吸收光譜以被吸收的光子的能量(波長、波數(shù)和能量eV)為橫坐標(biāo)，吸光度D或、log為縱坐標(biāo)，給出分子對具有不同能量光給出分子對具有不同能量光子的吸收特性子的吸收特性。被吸收的光子能量等于激發(fā)態(tài)的能量。吸光度被吸收的光子的能量(波長、波數(shù)和能量eV) : 摩爾消光系數(shù)。是評價物質(zhì)吸收光的能力的重要物理量I0IAhvlI0:入射光強(qiáng)度I: 透射光強(qiáng)度是分子的一個基本性質(zhì)，與物質(zhì)的種類和入射光的波長有關(guān), 不依賴于濃度和光程長度。其大小與躍遷

6、是否滿足選擇定則密切相關(guān).Lambert定律定律指出：被透明介質(zhì)所吸收的入射光的百分?jǐn)?shù)與入射光的強(qiáng)度無關(guān)。（激光光源除外）Beer定律定律指出：被吸收的光的量正比于光程中吸光分子的濃度。LambertBeer定律定律I = I010clA = log(I0/I) = cl（稀溶液）A：吸光值(2) 能量吸收光譜通常用吸收光的波長(nm)、波數(shù) (cm1)或光子能量(eV)表示激發(fā)態(tài)能量。波長通常用峰值波長max(nm)，有時也可采用帶邊波長edge(nm)表示。波長、波數(shù)和eV之間能量換算關(guān)系如下： (cm1) = 1/(cm) = 1107/(nm) E(eV) = 1240/(nm)OD

7、= log(I0/I)(1) 吸光度(absorbance)或光密度(optical density)OD = 2 = 0.01 1% transmitance or 99% absorbance 98% transmitance or 2% absorbance吸收光譜用峰值的值或者用譜帶的積分強(qiáng)度表示吸收強(qiáng)度吸收強(qiáng)度。用于表示這種積分強(qiáng)度的物理量是振子強(qiáng)度振子強(qiáng)度(oscillator strength)： = 4.32 109d 4.32109max 1/2 式中max為峰值摩爾消光系數(shù)，1/2為半峰寬。積分吸收強(qiáng)度與描述電子躍遷的基本理論單位振動強(qiáng)度有關(guān)，最大允許的躍遷強(qiáng)度的數(shù)值為1。

8、應(yīng)用這個方程式可以計算任何一個吸收帶的振動強(qiáng)度，并且可以將這個計算至與1比較，來判斷產(chǎn)生這一能帶的電子躍遷是允許的還是禁阻的。一些基本概念（1）發(fā)色團(tuán)（Chromophoric group）： 分子中能吸收紫外光或可見光的結(jié)構(gòu)系統(tǒng)叫做發(fā)色團(tuán)或色基。象C=C、C=O、CC等都是發(fā)色團(tuán)。發(fā)色團(tuán)的結(jié)構(gòu)不同，電子躍遷類型也不同。（2）助色團(tuán)（Auxochromic group）： 有些原子或基團(tuán)，本身不能吸收光波，但它與一定的發(fā)色團(tuán)相連時，則可使發(fā)色團(tuán)所產(chǎn)生的吸收峰移動，這樣的原子或基團(tuán)叫做助色團(tuán)。如：-OH、-NH2、-SH及一些鹵素等。 紅移和藍(lán)移有機(jī)化合物的吸收譜帶常有機(jī)化合物的吸收譜帶常常因引

9、入取代基或改變?nèi)艹Ｒ蛞肴〈蚋淖內(nèi)軇┦棺畲笪詹ㄩL劑使最大吸收波長max和和吸收強(qiáng)度發(fā)生變化吸收強(qiáng)度發(fā)生變化: max向長波方向移動稱向長波方向移動稱為為紅移紅移，向短波方向移動，向短波方向移動稱為稱為(或紫移或紫移)。吸收。吸收強(qiáng)度即摩爾吸光系數(shù)強(qiáng)度即摩爾吸光系數(shù)增大增大或減小的現(xiàn)象分別稱為增或減小的現(xiàn)象分別稱為增色效應(yīng)或減色效應(yīng)，如圖色效應(yīng)或減色效應(yīng)，如圖所示。所示。吸收光譜的測定裝置示意圖: 光源發(fā)射的多波長連續(xù)光經(jīng)過單色儀分光，按波長順序進(jìn)入樣品池，透過樣品池的透射光用光電倍增管和光子計數(shù)器測定強(qiáng)度，用計算機(jī)控制操作并處理數(shù)據(jù)。光源單色儀樣品池光子計數(shù)器計算機(jī)繪圖儀打印機(jī)光電倍增管

10、在雙光路系統(tǒng)中，一個光路上為溶劑池，另一個光路上為樣品池，經(jīng)過單色儀的單色光交替透過兩個吸收池測得log (I0 /I )隨波長的變化。 吸收光譜儀吸收光譜儀雙光路分光光度計的光學(xué)系統(tǒng)機(jī)械轉(zhuǎn)動P使單色光以從長波到短波波長順序連續(xù)通過出射狹縫(S2)長波區(qū)：鎢燈（3402500 nm）短波區(qū)：氘燈（185360 nm）石英棱鏡反射鏡樣品池參比池光電倍增管（PbS光電池 長波）實(shí)驗(yàn)操作相關(guān)吸收池吸收池有石英池和光學(xué)玻璃池，石英池在紫外-可見區(qū)和近紅外區(qū)的透過率很高，可測紫外-可見吸收光譜和近紅外吸收光譜，光學(xué)玻璃在紫外區(qū)有吸收，不能用來測定紫外區(qū)吸收光譜。 （區(qū)分吸收池）各種有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑在紫外

11、區(qū)有吸收，吸收端波長(nm)如下：乙腈(190)、水(191)、戊烷(190)、己烷(195)、異辛烷(197)、環(huán)己烷(198)、甲醇(203)、乙醇(204)、乙醚(215)、二氯甲烷(230)、四氫呋喃(235)、氯仿(245)、乙酸(251)、乙酸乙酯(254)、四氯化碳(266)、DMF(270)、苯(278)、甲苯(285)、四氯乙烯(290)、吡啶(305)、二硫化碳(380)和CH3NO2(380)。這些吸收帶的長波區(qū)是溶劑透過光的可利用的光譜區(qū)。溶劑的極性對于吸收帶的位置產(chǎn)生影響。 （純化溶劑）光致電子激發(fā)態(tài)是很活潑的可以經(jīng)過分子內(nèi)輻射與無輻射躍遷回到基態(tài)，還可以與猝滅劑進(jìn)行

12、分子間能量轉(zhuǎn)移、電子轉(zhuǎn)移和化學(xué)反應(yīng)而猝滅。 ？發(fā)射光譜與測試發(fā)射光譜與測試熒光光譜法基本原理熒光光譜法基本原理 分子的激發(fā)與失活分子的激發(fā)與失活分子的多重態(tài)分子的多重態(tài)單重態(tài)：單重態(tài)： 一個所有電子自旋都配一個所有電子自旋都配對的分子的電子狀態(tài)。大多數(shù)有對的分子的電子狀態(tài)。大多數(shù)有機(jī)物分子的基態(tài)是單重態(tài)。當(dāng)基機(jī)物分子的基態(tài)是單重態(tài)。當(dāng)基態(tài)一對電子中的一個被激發(fā)到較態(tài)一對電子中的一個被激發(fā)到較高能級，其自旋方向不會立刻改高能級，其自旋方向不會立刻改變，分子仍處于單重態(tài)。變，分子仍處于單重態(tài)。三重態(tài)：三重態(tài)： 有兩個電子的自旋不配有兩個電子的自旋不配對而平行的狀態(tài)。激發(fā)三重態(tài)能對而平行的狀態(tài)。激發(fā)

13、三重態(tài)能量較激發(fā)單重態(tài)低。量較激發(fā)單重態(tài)低。S0S1T1T2S2VRVRVRISCISCICFPCRCREXhhEXEXhVRIC光反應(yīng)產(chǎn)物Jablonski diagram發(fā)射光譜發(fā)射光譜磷光光譜磷光光譜熒光光譜熒光光譜無輻射躍遷無輻射躍遷振動弛豫：內(nèi)轉(zhuǎn)換：系間竄越：外轉(zhuǎn)換：熒光熒光磷光磷光光源樣品池光子計數(shù)器計算機(jī)繪圖儀打印機(jī)光電倍增管激發(fā)單色儀發(fā)射單色儀熒光光譜有熒光發(fā)射譜和熒光激發(fā)譜測定熒光發(fā)射譜熒光發(fā)射譜時，利用激發(fā)單色儀固定固定激發(fā)光的波長ex，這時只有具有ex波長的光子進(jìn)入樣品池，使基態(tài)分子M處于M*。M*發(fā)射的光用發(fā)射單色儀分光，給出發(fā)射光的強(qiáng)度隨波長變化曲線。測定熒光激發(fā)譜熒

14、光激發(fā)譜時，選擇發(fā)射譜中的某個發(fā)射波長發(fā)射波長em作為觀測波長, 測定不同波長的激發(fā)光對發(fā)射觀測波長的貢獻(xiàn)。發(fā)射光熒光光譜儀熒光光譜儀激發(fā)光譜和熒光光譜激發(fā)光譜和熒光光譜 熒光光譜的特點(diǎn)：熒光光譜的特點(diǎn)：斯托克斯位移（斯托克斯位移（Stokes shift)。與激。與激發(fā)光譜相比，熒光光譜的波長總是出現(xiàn)發(fā)光譜相比，熒光光譜的波長總是出現(xiàn)在更長的波長處；在更長的波長處；熒光光譜與激發(fā)波長無關(guān)。無論用熒光光譜與激發(fā)波長無關(guān)。無論用=250和和350nm作激發(fā)光源，所得熒光作激發(fā)光源，所得熒光光譜形狀和峰的位置都是相同；光譜形狀和峰的位置都是相同；吸收光譜與發(fā)射光譜大致成鏡像對稱。吸收光譜與發(fā)射光譜

15、大致成鏡像對稱。Em： ex202 ex20Ex： em/220 em 20（3）吸收光譜和發(fā)射光譜的形狀E h你所見到的吸收光譜和發(fā)射光譜 : “銳線” ?為什么不是與吸收的光或發(fā)射的光的頻率有關(guān)的“銳線”?AbsEmA 原子B 具有分立的支態(tài)的分子C 具有不可分辨的支態(tài)的分子銳線光譜帶振動結(jié)構(gòu)寬帶光譜低壓氣相原子低壓氣相剛性分子溶劑分子典型例子紫外吸收光譜的應(yīng)用紫外吸收光譜的應(yīng)用 物質(zhì)的紫外吸收光譜基本上是其分子中生色團(tuán)及助色團(tuán)的特征，而不是整個分子的特征。如果物質(zhì)組成的變化不影響生色團(tuán)和助色團(tuán)，就不會顯著地影響其吸收光譜，如甲苯和乙苯具有相同的紫外吸收光譜。另外，外界因素如溶劑的改變也會

16、影響吸收光譜，在極性溶劑中某些化合物吸收光譜的精細(xì)結(jié)構(gòu)會消失，成為一個寬帶。所以，只根據(jù)紫外光譜是不能完全確定物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，還必須與紅外吸收光譜、核磁共振波譜、質(zhì)譜以及其他化學(xué)、物理方法共同配合才能得出可靠的結(jié)論。 1 化合物的初步鑒定 利用紫外光譜可以推導(dǎo)有機(jī)化合物的分子骨架中是否含有共軛結(jié)構(gòu)體系，如CCCC、CCCO、苯環(huán)等。利用紫外光譜鑒定有機(jī)化合物遠(yuǎn)不如利用紅外光譜有效，因?yàn)楹芏嗷衔镌谧贤鉀]有吸收或者只有微弱的吸收，并且紫外光譜一般比較簡單，特征性不強(qiáng)。利用紫外光譜可以用來檢驗(yàn)一些具有大的共軛體系或發(fā)色官能團(tuán)的化合物，可以作為其他鑒定方法的補(bǔ)充。 如果一個化合物在紫外區(qū)是透明的，則

17、說明分子中不存在共軛體系，不含有醛基、酮基或溴和碘。可能是脂肪族碳?xì)浠衔?、胺、腈、醇等不含雙鍵或環(huán)狀共軛體系的化合物。如果在210250nm有強(qiáng)吸收，則可能含有兩個雙鍵的共軛體系，如共軛二烯或，-不飽和酮等。同樣在260，300，330nm處有高強(qiáng)度吸收帶，在表示有三個、四個和五個共軛體系存在。如果在260300nm有中強(qiáng)吸收（2001 000），則表示體系中可能有苯環(huán)存在。如果苯環(huán)上有共軛的生色基團(tuán)存在時，則可以大于10 000。如果在250300nm有弱吸收帶則可能含有簡單的非共軛并含有n電子的生色基團(tuán)，如羰基等。 2 純度檢測 如果有機(jī)化合物在紫外可見光區(qū)沒有明顯的吸收峰，而雜質(zhì)在紫外

18、區(qū)有較強(qiáng)的吸收，則可利用紫外光譜檢驗(yàn)化合物的純度。如果有機(jī)化合物在紫外可見光區(qū)沒有明顯的吸收峰，而雜質(zhì)在紫外區(qū)有較強(qiáng)的吸收，則可利用紫外光譜檢驗(yàn)化合物的純度。 在相同條件下配制樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液， 在最佳波長最佳處測得二者的吸光度A樣和A標(biāo)，進(jìn)行比較，按式計算樣品溶液中被測組分的濃度。標(biāo)標(biāo)樣cAcXA2.1 比較法2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最佳處分別測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度A，然后以濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，在完全相同的條件下測定試液的吸光度，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得試液的濃度。該法適用于大批量樣品的測定。 3 定量分析 朗伯-比爾定律 朗伯-比爾定律是

19、紫外-可見吸收光譜法進(jìn)行定量分析的理論基礎(chǔ)，它的數(shù)學(xué)表達(dá)式為: A = l c4 氫鍵強(qiáng)度的測定 溶劑分子與溶質(zhì)分子締合生成氫鍵時，對溶質(zhì)分子的UV光譜有較大的影響。對于羰基化合物，根據(jù)在極性溶劑和非極性溶劑中吸收帶的差別，可以近似測定氫鍵的強(qiáng)度。溶劑分子與溶質(zhì)分子締合生成氫鍵時，對溶質(zhì)分子的UV光譜有較大的影響。對于羰基化合物，根據(jù)在極性溶劑和非極性溶劑中吸收帶的差別，可以近似測定氫鍵的強(qiáng)度。 紫外/可見光譜在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用濃度測定構(gòu)象變化研究相互作用研究蛋白質(zhì)主鏈的紫外吸收肽鍵在250 nm的遠(yuǎn)紫外區(qū)有較大吸收蛋白質(zhì)濃度測定190nm 10000 l/mol.cm190nm比280nm

20、大100倍但溶劑吸收也較大溶劑的吸收蛋白質(zhì)中氨基酸的紫外吸收光譜1mM0.1mM0.1mM二硫鍵在250 nm附近有弱吸收色氨酸酪氨酸苯丙氨酸確定蛋白質(zhì)的消光系數(shù)可以根據(jù)蛋白質(zhì)序列預(yù)測蛋白質(zhì)的消光系數(shù) ProtParam:/tools/protparam.htmlTyr的吸收譜與pH有關(guān)pH titration can be used to determine- whether Tyr is internal or external- polarity of environmentmax at pH 6: 274 nmmax at pH 13: 295 n

21、m蛋白質(zhì)構(gòu)象變化研究Absorption spectra of Poly-L-Lys HCl: random coil at pH 6.0, 25C(bold);-Helix at pH 10.8, 25C(dotted); -strand at pH 10.8, 52C(dashed).蛋白質(zhì)折疊/變性研究核糖核酸酶熒光法的應(yīng)用熒光法的應(yīng)用熒光法靈敏度高，熒光法靈敏度高，檢測限比吸收光譜法低檢測限比吸收光譜法低13個數(shù)量級，個數(shù)量級，可用于痕量分析?？捎糜诤哿糠治?。選擇性好，由于能發(fā)生熒光的化學(xué)體系不多。選擇性好，由于能發(fā)生熒光的化學(xué)體系不多。線性范圍寬。線性范圍寬。應(yīng)用范圍不如吸收光譜法廣

22、，因?yàn)橛械姆肿硬话l(fā)熒光。應(yīng)用范圍不如吸收光譜法廣，因?yàn)橛械姆肿硬话l(fā)熒光。Environmental SensitivityFluorophores can be affected by a large number of environmental factors including such parameters as pH, ionic strength, non-covalent interactions, light intensity, temperature and so on. Both the excitation and emission wavelengths and th

23、e quantum yield can all be changed by environmental factors.溫度熒光一般隨溫度上升而減弱熒光實(shí)驗(yàn)需要恒溫Protein intrinsic fluorescenceTrp fluorescence can be selectively excited at 295-305 nm. (to avoid excitation of Tyr) Trp fluorescence is very sensitive to its local environment It is possible to see changes in emissio

24、n spectra in response to conformational changes, subunit association, substrate binding, denaturation, and anything that affects the local environment surronding the indole ring. Also, Trp appears to be uniquely sensitive to collisional quenching, either by externally added quenchers, or by nearby g

25、roups in the protein.Fluorescence of tryptophan depends upon the dipolar nature of the solvent290330370410450wavelength, nmABCDEabcabcdabcdabcabcCa-parvalbumin: tryptophan is buried, 305 nmCa-free parvalbumin: tryptophan is exposed to solvent Tryptophan in various solvents: hexane, trehalose glass,

26、glycerol, waterFluorescence spectral shifts can be very large序號序號儀器名稱儀器名稱購置日購置日期期單價單價管理者管理者銷售商銷售商運(yùn)行狀況運(yùn)行狀況配件配件維修記錄維修記錄202053015301熒光熒光2004.112004.11178200.00178200.00吳曉霞吳曉霞島津沈陽辦島津沈陽辦1360433039113604330391良好良好恒溫水浴恒溫水浴無無2121紫外分光光度計紫外分光光度計2000.122000.12113781.00113781.00吳曉霞吳曉霞島津沈陽辦島津沈陽辦13604330391136043

27、30391良好良好無無2222P-750P-750熒光熒光2000.122000.12117943.00117943.00吳曉霞吳曉霞日本分光日本分光041182364123041182364123換工作站換工作站無無232325502550紫外紫外2004.112004.11341550.00341550.00吳曉霞吳曉霞島津沈陽辦島津沈陽辦1360433039113604330391良好良好半導(dǎo)體元件半導(dǎo)體元件242425502550紫外紫外2007.12007.1168000.00168000.00吳曉霞吳曉霞島津沈陽辦島津沈陽辦1360433039113604330391良好良好恒溫水

28、浴恒溫水浴無無252517001700紫外紫外2004.112004.11吳曉霞吳曉霞島津沈陽辦島津沈陽辦1360433039113604330391良好良好無無262617001700紫外紫外2004.112004.11吳曉霞吳曉霞島津沈陽辦島津沈陽辦1360433039113604330391良好良好無無一、開機(jī)前準(zhǔn)備 1實(shí)驗(yàn)室溫度應(yīng)保持在1530之間，相對濕度應(yīng)保持在45%80%之間。 2確認(rèn)樣品室內(nèi)無樣品。 二、開機(jī) 1開啟總電源及UV-2550電源。 2開啟計算機(jī)電源，雙擊桌面上的UVProbe圖標(biāo)進(jìn)入操作系統(tǒng)。 3在UVProbe界面上點(diǎn)擊Connect鍵，聯(lián)機(jī)并初始化。整個過程需

29、花45分鐘。（電源再次打開時，需隔10分鐘或更長的時間。）SHIMADZU UV-2550型紫外可見分光光度儀操作規(guī)程 三、操作過程 1在主菜單上選擇測定的方式： （1）點(diǎn)擊Kinetics鍵進(jìn)入動力學(xué)測定方式：一般測定吸收值隨時間的變化，通常用于酶反應(yīng)隨時間的變化。 （2）點(diǎn)擊Spectrum鍵進(jìn)入光譜測定方式：可進(jìn)行紫外可見近紅外區(qū)的光譜測定。（3）點(diǎn)擊Photometric鍵進(jìn)入光度測定（定量）方式：可進(jìn)行多波長、單波長、峰高定量。校準(zhǔn)曲線可使用多點(diǎn)、單點(diǎn)、K因子等方法。 2參數(shù)的設(shè)定：點(diǎn)擊菜單欄上的M鍵，點(diǎn)擊Measurement標(biāo)簽，根據(jù)提示在對話框中選擇波長測定范圍、掃描速度、采樣

30、間隔等參數(shù)；點(diǎn)擊Instrument Parameters標(biāo)簽，選擇測定種類（吸收值、透射能量、反射率）及通帶（狹縫）等條件。 3基線校正：所有參數(shù)設(shè)置完成后，兩個樣品架均不放置樣品或兩個均放上同樣的空白溶液，點(diǎn)擊“Baseline”，開始進(jìn)行基線校正，儀器掃描完成后，點(diǎn)擊“ Go To WL”將波長轉(zhuǎn)到800nm，點(diǎn)擊“Auto Zero”把800nm的波長設(shè)為0。點(diǎn)擊“Start”再次掃描，若得出曲線值均小于0.001，則認(rèn)為基線平坦，若數(shù)值較大，則將800nm吸光度設(shè)為0重新進(jìn)行基線掃描。 4樣品測定：樣品放入樣品室后，點(diǎn)擊Start鍵即開始測定。完成后，取一個文件名并保存。四、報告輸出

31、 點(diǎn)擊菜單欄上的Report鍵，根據(jù)需要選擇報告格式。點(diǎn)擊菜單欄上的Print preview鍵預(yù)覽，點(diǎn)擊菜單欄上的Print鍵，輸出報告。 五、關(guān)機(jī) 1在UVProbe界面上點(diǎn)擊Disconnect鍵，退出操作系統(tǒng)，并取出樣品池。 2關(guān)閉UV-2550主機(jī)，關(guān)閉計算機(jī)、打印機(jī)、總電源。 3在記錄本上記錄本次使用情況。 六、注意事項(xiàng) 樣品池內(nèi)溶液不要超過池容積的4/5，樣品池放入樣品室前外部用軟紙擦干。 注意事項(xiàng)1.光度計燈源壽命有限，若長時間不測量，應(yīng)通過UVProbe軟件斷開連接（點(diǎn)擊“Disconnect”），然后關(guān)閉光度計電源。2.使用分光光度計時要保證樣品室絕對干凈，小心放入樣品，放

32、入比色皿前一定要先用濾紙和擦鏡紙將比色皿外表面擦干凈，不要污染樣品池和光度計外表面。3.儀器自檢和掃描的過程中，不要打開樣品室蓋。4.軟件不會自動保存數(shù)據(jù)，所有的數(shù)據(jù)要保存都必須點(diǎn)擊“Save”或者“Save As”進(jìn)行另存。否則數(shù)據(jù)會丟失。光譜光譜1.打開計算機(jī)和RF-5301PC熒光分光光度計開關(guān)。 Windows啟動后，雙擊RF-530XPC，自檢。2.從“Acquire Mode”菜單中選擇Spectrum進(jìn)入Spectrum模式。 (1) 從另外的數(shù)據(jù)獲取模式中進(jìn)入Spectrum，會自動顯示光譜參數(shù)對話框。 (2) 如果當(dāng)前模式已經(jīng)是Spectrum模式，從“Configure”菜

33、單中選擇Parameters,可顯示Spectrum Parameters對話框。（如圖1） RF-5301PC型熒光分光光度計Spectrum ParametersSpectrum Type: Excitation Emission SynchronousEx Wavelength: 350 nmEM Wavelength Range: Start 370 End 680 Recording Range: Low 0.000 High 50.000Scanning Speed: Medium Sampling lnterval (nm): 0.2 Slit width(nm): EX 5 E

34、M 5 Sensitivity: High LowResponse Time sec: Auto Repeat Scan Auto File OK Cancel 圖 13.確定所有參數(shù)后點(diǎn)擊OK。4.將裝有蒸餾水的樣品池放入池槽中，點(diǎn)擊開始掃描。5.掃描結(jié)束后，會出現(xiàn)File Name 對話框，這時輸入文件名。將光標(biāo)移至Comment文本框，輸入注釋。點(diǎn)擊，將數(shù)據(jù)保存。6.點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵，會出現(xiàn)一個菜單，選擇Radar，從副菜單中選擇Both Axes，自動建立新的圖形限制。7.如果想擴(kuò)大光譜上某一特定區(qū)域，用鼠標(biāo)點(diǎn)此區(qū)域的左上角，并拖動鼠標(biāo)至我們想要擴(kuò)大的區(qū)域范圍?；蛘邚暮蠷ader的相同菜

35、單中選擇Limit（點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵），設(shè)定新的圖形限制，在出現(xiàn)的對話框中輸入上限及下限。8.點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵，讀取鼠標(biāo)所指位置的波長及熒光強(qiáng)度。之后選擇Cross HairDisplay。9.移動鼠標(biāo)所指區(qū)至想要的位置。10.選擇Display刪除鼠標(biāo)所指區(qū)域。11.在File菜單中選擇Save，儲存獲得的數(shù)據(jù)。定量分析定量分析1.從“Acquire Mode”菜單中選擇Quantitative，進(jìn)入Quantitative模式，會自動顯示Quantitative參數(shù)對話框。2.按圖2所示確定獲得參數(shù) 當(dāng)在method 下方選擇“Multi Point Working Curve”時，會出現(xiàn)Mult

36、i Point Curve對話框。按圖3所示進(jìn)行選擇。Quantitative PeramelersMethod: Concentration Multi point Working Curve Units: ppbEX Wavelength: 350.0 Range: 0.000 to 100.00EM Wavelength: 450.0 Recording RangeSlit Width nm: EX 5 EM 5 Low 0.000 High 1000.00Sensitivity: High Low Response Time: AutoAuto Scan Mode Repetition

37、s: 1 OK Cancel圖 2Multipoint Working CurveOrder of Curve Ist 2nd 3rdZero lnterception yes No OK Cancel 圖 33.確定所有參數(shù)后點(diǎn)擊確定所有參數(shù)后點(diǎn)擊鍵。鍵。4.將裝有空白樣品的樣品池放入池槽中，將裝有空白樣品的樣品池放入池槽中，點(diǎn)擊點(diǎn)擊設(shè)定零點(diǎn)設(shè)定零點(diǎn)。5.將第一個標(biāo)準(zhǔn)樣裝入池槽中并點(diǎn)擊將第一個標(biāo)準(zhǔn)樣裝入池槽中并點(diǎn)擊，會出現(xiàn)，會出現(xiàn)Standard Sample Data Edit對話框。輸入對話框。輸入標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣的濃度值標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣的濃度值并點(diǎn)擊并點(diǎn)擊鍵。鍵。6.重復(fù)第五步繼續(xù)處理第二個標(biāo)準(zhǔn)樣

38、。一旦獲得了足夠多的標(biāo)準(zhǔn)樣數(shù)重復(fù)第五步繼續(xù)處理第二個標(biāo)準(zhǔn)樣。一旦獲得了足夠多的標(biāo)準(zhǔn)樣數(shù)據(jù)，在屏幕上便會據(jù)，在屏幕上便會自動出現(xiàn)工作曲線自動出現(xiàn)工作曲線。點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵，在出現(xiàn)的。點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵，在出現(xiàn)的菜單中選擇菜單中選擇RaderBoth Axes，便可自動繪圖。，便可自動繪圖。7.在工作曲線繪制完成后，在工作曲線繪制完成后，可定量確定未知樣的濃度可定量確定未知樣的濃度。點(diǎn)擊。點(diǎn)擊鍵，出現(xiàn)鍵，出現(xiàn)Unknown Avquisition 屏幕。屏幕。8.將裝有未知樣品的池放入池槽中，點(diǎn)擊將裝有未知樣品的池放入池槽中，點(diǎn)擊開始濃度的定量測開始濃度的定量測定。定。9.在在File菜單中選擇菜單中選擇S

39、ave，儲存獲得的數(shù)據(jù)。，儲存獲得的數(shù)據(jù)。10.在出現(xiàn)的對話框中輸入標(biāo)準(zhǔn)樣和未知樣的文件名，點(diǎn)擊在出現(xiàn)的對話框中輸入標(biāo)準(zhǔn)樣和未知樣的文件名，點(diǎn)擊鍵。鍵。時間程序時間程序1.從從“Acquire Mode”菜單中選擇菜單中選擇Time Course，進(jìn)入，進(jìn)入Time Course 數(shù)據(jù)獲取模式，會自動顯示數(shù)據(jù)獲取模式，會自動顯示Time Course 參數(shù)對參數(shù)對話框。話框。2.按圖按圖4所示確定獲得參數(shù)。所示確定獲得參數(shù)。3.確定所有參數(shù)后點(diǎn)擊確定所有參數(shù)后點(diǎn)擊鍵。鍵。4.將裝有蒸餾水的樣品池放入池槽中，點(diǎn)擊將裝有蒸餾水的樣品池放入池槽中，點(diǎn)擊設(shè)設(shè)定零點(diǎn)。以下步驟是基于時間進(jìn)程數(shù)據(jù)是在菡餾水的定零點(diǎn)。以下步驟是基于時間進(jìn)程數(shù)據(jù)是在菡餾水的Raman峰的基礎(chǔ)上獲得的假設(shè)。峰的基礎(chǔ)上獲得的假設(shè)。5.點(diǎn)擊點(diǎn)擊Start鍵開始收集數(shù)據(jù)。在數(shù)據(jù)收集完之后，出現(xiàn)鍵開始收集數(shù)據(jù)。在數(shù)據(jù)收集完之后，出現(xiàn)File Name對話框，輸入獲得的數(shù)據(jù)的文件名。移動光對話框，輸入獲得的數(shù)據(jù)的文件名。移動光標(biāo)至文本框，輸入注釋。當(dāng)所有輸入完成后，點(diǎn)擊標(biāo)至文本框，輸入注釋。當(dāng)所有輸入完成后，點(diǎn)擊保存數(shù)據(jù)，若點(diǎn)擊保存數(shù)據(jù)，若點(diǎn)擊，所有輸入的數(shù)據(jù)，所有輸入的數(shù)據(jù)將丟失。將丟失。6.從從File菜單重選擇菜單重選擇，儲存獲得的數(shù)據(jù)。，儲存獲得的數(shù)據(jù)。Time Course ParemetersEX Wa