生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康纳锘瘜W(xué)是醫(yī)學(xué)教育中的一門(mén)實(shí)踐性較強(qiáng)的基礎(chǔ)學(xué)科。 實(shí)驗(yàn)教學(xué)是過(guò)程的重 要組成部分，是理論教學(xué)的延伸和補(bǔ)充。實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖牵?、初步學(xué)會(huì)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本操作技能及實(shí)驗(yàn)研究的基本方法。2、熟悉生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理，了解一些臨床生化檢驗(yàn)項(xiàng)目。3、培養(yǎng)嚴(yán)肅認(rèn)真的工作方法、實(shí)事求是的科學(xué)態(tài)度、團(tuán)結(jié)協(xié)作的工作作風(fēng) 和觀察分析、思考、獨(dú)立解決問(wèn)題的能力。二、實(shí)驗(yàn)基本要求實(shí)驗(yàn)教學(xué)包括實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備、實(shí)驗(yàn)操作、整理實(shí)驗(yàn)結(jié)果、書(shū)寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告等環(huán)節(jié)， 為了提高實(shí)驗(yàn)效果，實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，要求學(xué)生必須做到以下幾點(diǎn)。（一）實(shí)驗(yàn)前1、仔細(xì)閱讀實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，了解實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅浞掷斫鈱?shí)驗(yàn)原理，熟悉實(shí)驗(yàn)步

2、驟、操作程序和注意事項(xiàng)。2、預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)各個(gè)步驟可能得到的結(jié)果，對(duì)預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果能做出合理的解釋。3、注意和估計(jì)實(shí)驗(yàn)中可能發(fā)生的誤差，并制定防止誤差的措施。（二）實(shí)驗(yàn)時(shí)1、保持實(shí)驗(yàn)室肅靜，不能進(jìn)行與實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)的活動(dòng)。2、在教師或?qū)嶒?yàn)技術(shù)人員的指導(dǎo)下，熟悉儀器的構(gòu)造、性能及操作規(guī)程。3、實(shí)驗(yàn)器材擺放整齊，有條不紊、裝置正確。4、按照實(shí)驗(yàn)步驟，嚴(yán)肅認(rèn)真的循序操作，不能隨意更動(dòng)。5、愛(ài)護(hù)公物，注意節(jié)省實(shí)驗(yàn)器材和藥品。注意安全，嚴(yán)防觸電、火災(zāi)、酸 堿灼傷及中毒事故的發(fā)生。6、仔細(xì)、耐心地觀察實(shí)驗(yàn)田中出現(xiàn)的現(xiàn)象，隨時(shí)客觀的記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以 免發(fā)生錯(cuò)誤或遺漏。實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)始終保持一致，如有變動(dòng)，應(yīng)加文字說(shuō)明。（三）

3、實(shí)驗(yàn)后1、整理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，書(shū)寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告，按時(shí)交給指導(dǎo)教師評(píng)閱。2、整理實(shí)驗(yàn)儀器和清洗玻璃儀器，關(guān)閉儀器、設(shè)備和電源。清點(diǎn)實(shí)驗(yàn)器材,辦理借還手續(xù)。3、做好實(shí)驗(yàn)室清潔衛(wèi)生工作，關(guān)閉水、氣閥門(mén)，切斷電源，關(guān)閉門(mén)窗，確 保安全。實(shí)驗(yàn)一生化實(shí)驗(yàn)基本操作一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)基本操作訓(xùn)練， 學(xué)會(huì)熟練進(jìn)行進(jìn)行玻璃儀器洗滌；吸量管使用；溶液的混合；離心機(jī)使用；7 2 1型分光光度儀使用。二、實(shí)驗(yàn)用品燒杯、試管；吸量管、移液管；旋渦混合（振蕩）器、玻璃棒；離心機(jī)使用；7 2 1型 分光光度儀三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及步驟（一）玻璃儀器的洗滌在生化實(shí)驗(yàn)中，玻璃儀器潔凈與否，是獲得準(zhǔn)確結(jié)果的重要環(huán)節(jié)。潔凈的玻璃儀器內(nèi)壁 應(yīng)十分明亮光潔

4、，無(wú)水珠附著在玻壁上。（二）吸量管的使用1 .刻度吸量管的正確使用方法用右手拇指和中指夾住管身， 將吸量管的尖端伸入試液深處，左手持洗耳球把試液吸入管內(nèi)至高過(guò)刻度以上時(shí)，迅速用右手食指按住吸量管的上口，以控制試液的泄放。吸液后應(yīng)盡量使吸量管保持垂直，使右眼與刻度等高，稍微輕抬食指或輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)吸量管，使試液面緩慢降落，至管內(nèi)試液彎月面的最低點(diǎn)與吸量管的刻度線相齊為止。然后將吸量管插到需加試劑的容器中，讓尖端與容器內(nèi)壁靠緊，松開(kāi)食指讓液體流出。液體流完后再等15秒鐘，捻動(dòng)一下吸量管后移去（如需吹的吸量管，則吹出尖端的液體后再捻轉(zhuǎn)一下吸量管移去）。2 .定量吸液器的使用方法（微量加樣器廣1）選擇適當(dāng)?shù)?/p>

5、吸液器： 吸液前先把吸嘴套在吸引管上，套上后要輕輕旋緊一下，以保證結(jié)合嚴(yán)密。2）持法：右手四指（除大拇指外）并攏握住吸液器外殼（使外殼突起部分搭在食指近 端），大拇指輕輕放在吸液器的按鈕上。3）取樣（吸液）：用大拇指按下按鈕到第一停止點(diǎn)，以排出一定容量的空氣，隨后把吸嘴尖浸入取樣液內(nèi)，徐徐松開(kāi)大拇指，讓按鈕慢慢自行復(fù)原，取樣即告完成。4）排液：將吸液器的吸嘴尖置于加樣容器壁上，用大拇指慢慢地將按鈕按下到第一停止點(diǎn)，停留1秒鐘（粘性較高的溶液停留時(shí)間應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)）。然后再把按鈕按到第二停止點(diǎn) 上，讓吸嘴沿管壁向上滑動(dòng)。當(dāng)吸嘴尖與容器壁或溶液離開(kāi)時(shí)，方可釋放按鈕，使其恢復(fù)到 初始位置。5）吸液器用后

6、應(yīng)及時(shí)取下吸嘴。將吸嘴用自來(lái)水沖洗后浸入盛水的容器內(nèi)（以防干涸），待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后集中仔細(xì)清洗。（三）溶液混勻1 .混勻的方法1） 使盛器作離心運(yùn)動(dòng)。2）左手持試管上端，用右手指輕擊試管下半部，使管內(nèi)溶液作旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。3）利用旋渦混合（振蕩）器混勻。4）不得已時(shí)可用干燥清潔的玻璃棒攪勻。（四）離心機(jī)使用1. TGL-20M臺(tái)式離心機(jī)使用方法操作程序：1）把離心機(jī)放置于平面桌或平面臺(tái)上，四只橡膠機(jī)腳應(yīng)堅(jiān)實(shí)接觸平面，目測(cè)使之平衡，用手輕搖一下離心機(jī)，檢查離心機(jī)是否放置平穩(wěn)。2）打開(kāi)門(mén)蓋，將離心管放入轉(zhuǎn)子體內(nèi)，離心管必須成偶數(shù)對(duì)稱(chēng)放入（離心管試液應(yīng)稱(chēng)量加入），注意把轉(zhuǎn)子體上螺釘旋緊，并重新檢查試管是否對(duì)稱(chēng)

7、放入、螺釘是否旋緊。3）關(guān)上門(mén)蓋，注意一定要使門(mén)蓋鎖緊，完畢用手檢查門(mén)蓋是否關(guān)緊。4）插上電源插座，按下電源開(kāi)關(guān)。5）設(shè)置轉(zhuǎn)子號(hào)、轉(zhuǎn)速、溫度、時(shí)間：（五）分光光度儀使用 721型1） 721分光光度計(jì)使用前應(yīng)預(yù)熱 20分鐘，做樣之前應(yīng)對(duì)比色皿成套性進(jìn)行校正，減 小測(cè)量誤差。2）波長(zhǎng)選擇置于所要分析物相對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)值，3）打開(kāi)比色皿蓋進(jìn)行調(diào)零調(diào)整面板0旋鈕進(jìn)行零點(diǎn)調(diào)整。4）將空白放入比色皿盒后蓋上比色皿蓋，調(diào)整100旋鈕進(jìn)行100%調(diào)整。5）然后逐一拉出樣品進(jìn)行比色分析。四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告與內(nèi)容（略）五、注意事項(xiàng)（一）使用刻度吸量管的注意事項(xiàng)：1）選擇適當(dāng)規(guī)格的吸量管：吸量管的最大容積應(yīng)等于或略大于所需

8、容積（ ml數(shù)）。2）仔細(xì)看清吸量管的刻度情況：刻度是否包括吸量管尖端的液體？讀數(shù)方向是從上而下，還是從下而上？3）拿吸量管時(shí)，刻度一定要面向自己，以便讀數(shù)。4）吸取試劑時(shí)應(yīng)注意三點(diǎn)：一是先吹去吸量管內(nèi)可能存在的殘留液體，二是將吸量管插入試劑液面深部（以免吸液過(guò)程中因液面降低而吸入空氣產(chǎn)生氣泡或管內(nèi)試劑進(jìn)入洗耳 球），三是使用洗耳球（不可直接用口吸）。5）按吸量管上口時(shí)應(yīng)該用食指，不能用拇指。6）吸取粘滯性大的液體（如血液、血漿、血清等）時(shí)，除選用合適的吸管（奧氏管）外, 應(yīng)注意拭凈管尖附著的液體，盡量減慢放液速度（用食指壓力控制），待液體流盡后吹出管尖 殘留的最后一滴液體。使用的吸量管應(yīng)干凈

9、、干燥無(wú)水。如急用而又有水時(shí)，可用少量欲取試劑沖洗3次，以免試劑被稀釋。（二）溶液混勻注意事項(xiàng)：1）防止盛器內(nèi)的液體濺出或被污染。2）嚴(yán)禁用手指堵塞管口或瓶口震蕩混勻。六、思考題1、吸取某標(biāo)準(zhǔn)液 0.75ml,應(yīng)選用 ml的吸管移取。2、去油污能力最強(qiáng)的洗液是 。3、配制 0.4M NaOH 溶液 1000ml,需 NaOH 克。4、配制 0.5M HCL 400ml ,需 1M HCL 溶液 毫升。實(shí)驗(yàn)二尿蛋白定性實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)接觸尿蛋白定性實(shí)驗(yàn)， 初步學(xué)會(huì)判斷和了解腎臟功能是否出現(xiàn)問(wèn)題及問(wèn)題的嚴(yán)重性二、實(shí)驗(yàn)原理在含有蛋白質(zhì)的尿液中另磺柳酸時(shí)，可產(chǎn)生白色沉淀。是磺柳酸的酸離子可與蛋白質(zhì)

10、堿性基團(tuán)結(jié)合，生成不溶性蛋白鹽深沉。三、實(shí)驗(yàn)用品與試劑配制尿杯、試管、滴管、20%t柳酸溶液四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及步驟1、采集尿液標(biāo)本：用尿杯采集自己的尿液標(biāo)本備用。2、取試管一支，加入清晰的尿液24滴，然后加入20%t柳酸溶液2滴，輕輕搖勻，一分鐘后觀察結(jié)果。3、結(jié)果記錄和判斷：尿蛋白定性實(shí)驗(yàn)是尿常規(guī)檢查中必做的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，是診斷腎臟疾病和病變的重要常規(guī)指標(biāo)之一。尿蛋白定性試驗(yàn)常通過(guò)半定量方式或加號(hào)方式檢測(cè)尿液中排出的蛋白質(zhì)的多少，用于判斷和了解腎臟功能是否出現(xiàn)問(wèn)題及問(wèn)題的嚴(yán)重性，其結(jié)果可用陰性一、微量土、1-4個(gè)加號(hào)+，+，+，+，表示，也可用數(shù)值表示，加號(hào) 越多或數(shù)值越高則尿蛋白越多。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

11、與內(nèi)容此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果為六、注意事項(xiàng)收集中段尿七、思考題試討論尿蛋白定性實(shí)驗(yàn)臨床意義實(shí)驗(yàn)三蛋白質(zhì)的性質(zhì)實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)會(huì)驗(yàn)證蛋白質(zhì)呈色反應(yīng)、沉淀反應(yīng)及等電點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)操作。二、實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)分子中的氨基酸是以肽鍵連接的，因此蛋白質(zhì)具有縮二月尿反應(yīng)。 由于蛋白質(zhì)分子中含有自由氨基，可與苛三酮試劑作用生成紫藍(lán)色化合物，稱(chēng)苛三酮反應(yīng)。以上呈色反應(yīng)可用于檢驗(yàn)蛋白質(zhì)。在蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽時(shí)，蛋白質(zhì)即沉淀，這種過(guò)程稱(chēng)為鹽析。鹽析包括：（1）大量電解質(zhì)破壞蛋白質(zhì)的水化層而出現(xiàn)沉淀；（2）電解質(zhì)中和了蛋白質(zhì)分子的電荷而沉淀。中性鹽能否沉淀各種蛋白質(zhì)決定于中性鹽的濃度、蛋白質(zhì)的種類(lèi)、溶液的pH、以及蛋白質(zhì)膠體顆粒

12、的大小。 顆粒大的比顆粒小的容易析出，如球蛋白多在半飽和（NH4） 2SO溶液中析出，而清蛋白則常在飽和 （NH4）2SO溶液中析出。極性較大的有機(jī)溶劑， 對(duì)水的親和力較大，可破壞蛋白質(zhì)的水化層使其沉淀；當(dāng)溶液的pH值大于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，可與重金屬離子結(jié)合成蛋白鹽沉淀；在溶 液的pH值小于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，可與酸根離子結(jié)合成蛋白鹽沉淀。蛋白質(zhì)解離成兩性離子時(shí)，溶液的pH值稱(chēng)該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。酪蛋白溶液在等電點(diǎn)時(shí)很不穩(wěn)定，可以發(fā)生沉淀。所以，可以根據(jù)相對(duì)濁度來(lái)測(cè)定酪蛋白的等電點(diǎn)的近似值。三、實(shí)驗(yàn)用品與試劑配制1、蒸儲(chǔ)水 2、10%雞蛋白溶液（v / v ） 3

13、、0.2 麻三酮乙醇液 4、固體（NH4）2SQ5、0.5%W0修液 6 、0.5%硫酸鋅溶液7 、10%三氯乙酸溶液 8、0.01 mol/L醋酸9、0.1 mol/L 醋酸 10、1.0mol/L 醋酸11、飽和（NH4）2SO溶液：稱(chēng)取377 g硫酸錢(qián)溶于 20c 500ml的蒸儲(chǔ)水中。硫酸鏤在20 C 水中的溶解度為754g/L水。配制時(shí)需稱(chēng)取稍過(guò)量的硫酸錢(qián)使溶液中有少量固體存在，同時(shí) 可加熱助溶。12、0.5%酪蛋白醋酸鈉溶液：稱(chēng)取純酪蛋白0.25g ,置于50ml容量瓶?jī)?nèi)，準(zhǔn)確地加蒸儲(chǔ)水20 ml及1mol/L NaOH 5ml ,搖勻，使酪蛋白溶解，然后準(zhǔn)確地加1mol/L醋酸液

14、5ml,最后用蒸儲(chǔ)水稀釋至刻度。13、滴管、試管和試管架、記號(hào)筆。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及步驟（一）苛三酮反應(yīng)取小試管1支，加10 %雞蛋白溶液4滴，蒸儲(chǔ)水10滴和0.2 %苛三酮乙醇液6滴， 混勻，在沸水浴中加熱 510分鐘，待冷卻后觀察溶液的顏色變化。（二）沉淀反應(yīng)1 .鹽析：取10%|蛋白溶液4ml于小試管中，再加入4ml飽和（NT） 2SO溶液，混勻， 靜置20分鐘后，則球蛋白全部析出。離心（2000轉(zhuǎn)/分鐘）5分鐘，取上清液1ml加固體（NH4） 2SQ 約0.5g使之飽和，邊加邊振搖至溶液出現(xiàn)渾濁，再向渾濁液（應(yīng)不含硫酸俊結(jié)晶顆粒）加 1.52.0ml蒸儲(chǔ)水，觀察結(jié)果。2 .重金屬鹽沉淀蛋白

15、質(zhì)： 取試管1支，加入10%4蛋白溶液1ml,及0.5%NaOH1滴混勻，再加入 0.5%硫酸鋅溶液6滴，觀察結(jié)果。3 .三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)：取試管 1支，加入10%雞蛋白溶液1ml,然后再加入10%三氯乙酸溶液35滴，觀察沉淀的生成。（三）蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定：試管號(hào)試劑（ml）1234蒸儲(chǔ)水8.4.78.08.28.40.01mol/L 醋酸0.6一一0.1mol/L 醋酸一.30.011.0mol/L 醋酸一一一.80.60.5%酪蛋白醋酸鈉溶液（加入方法見(jiàn)后）1.0.01.01.01.0溶液pH值5.9.35.74.04.51.取5個(gè)大試管，編號(hào)，按下表準(zhǔn)確加入試劑，混勻。57113濁度

16、比較4 .各試管加入酪蛋白醋酸鈉溶液時(shí)，應(yīng)隨加隨搖（切勿在各管加完后才搖），觀察各管濁度。靜置1030分鐘后，比較各管濁度，用（+ ）多少表示其渾濁程度。沉淀最多而上清液最透明的試管的 pH值，即為酪蛋白的等電點(diǎn)。為什么？五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告與內(nèi)容（一）苛三酮反應(yīng)結(jié)果（二）沉淀反應(yīng)結(jié)果（三）蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定沉淀最多而上清液最透明的試管的pH值=,即為酪蛋白的等電點(diǎn)。為什么？六、注意事項(xiàng)緩沖?的pH值必須準(zhǔn)確。七、思考題1、根據(jù)實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果，指出 PH值為 是酪蛋白的等電點(diǎn)。2、酪蛋白在 時(shí)，溶解度 ,容易沉淀。3、各試管中酪蛋白帶什么電荷：1234 5 。4、蛋白質(zhì)變性的機(jī)理是什么？哪些因素引起蛋白

17、質(zhì)的變性？5、根據(jù)你這次的實(shí)驗(yàn)觀察討論變性與沉淀的關(guān)系。6、什么是蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)？7、在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)溶液為什么容易發(fā)生沉淀？實(shí)驗(yàn)四 溫度、pH、激動(dòng)劑和抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)會(huì)溫度、pH、激動(dòng)劑和抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)影響的實(shí)驗(yàn)操作。二、實(shí)驗(yàn)原理溫度與酶促反應(yīng)速度關(guān)系密切。溫度降低酶促反應(yīng)速度降低以至完全停止；隨著溫度升高，反應(yīng)速度逐漸加快。在某一溫度時(shí)反應(yīng)速度達(dá)到最大值，此溫度稱(chēng)酶作用的最適溫度。溫度再升高，反應(yīng)速度反而下降。人體內(nèi)大多數(shù)酶的最適溫度在37c左右。PH值影響酶促反應(yīng)速度，是由于酶本身是蛋白質(zhì)。PH不僅影響酶蛋白分子某些基團(tuán)的解離，也影響底物的解離程度，從而影響

18、酶與底物的結(jié)合。當(dāng)酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大值時(shí)的溶液pH值，稱(chēng)為該酶的最適 pHH不同的酶最適pH值不盡相同，人體多數(shù)酶的最適pH值在7.0左右。例如唾液淀粉酶的最適pH值為6.8。凡是能夠提高酶活性，加快酶促反應(yīng)速度的物質(zhì)都稱(chēng)為酶的激動(dòng)劑。例如Cl-是唾液淀粉酶的激動(dòng)劑。凡是能夠降低酶的活性，使酶促反應(yīng)速度減慢，又不使酶變性的物質(zhì)稱(chēng)為酶的抑制劑。例如CU2+是唾液淀粉酶的抑制劑。三、實(shí)驗(yàn)用品與試劑的配制1、滴管、試管和試管架、恒溫水箱、記號(hào)筆。2、0.1 %淀粉液3、0.3 % NaCl 溶液4、0.5 %QSO溶液5、蒸儲(chǔ)水6、不同pH值緩沖溶?的配制：1/15mol/L KH 2PO液：稱(chēng)取

19、純 KHPO 9.078g加蒸儲(chǔ)水溶解并稀釋成 1000ml。1/15mol/L Na 2HPO 液：稱(chēng)取 Na2HPO - 2H2。11.815g ,加蒸儲(chǔ)水溶解并稀釋成 1000ml。上述兩液下列比例混合均勻，即可得到不同pH值的緩沖溶液。PH4.926.818.671/15mol/L KH 2PO9.95.00.11/15mol/LNa 2HPO0.15.00.9四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟制備稀唾液：用清水漱口，含蒸儲(chǔ)水少許，咀嚼刺激唾液分泌。 取唾液2ml加蒸儲(chǔ)水18ml 混勻備用。（一） 溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響1 .取試管3支，編號(hào)，按下表依次加入各種試劑。式 IT#試齊J （ml）、12

20、30.2 %淀粉溶液555PH 6.8緩沖液1110.3 % NaCl 溶液1112 .混勻后，將1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)試管分別置于沸水浴、溫水浴（3740C）和冰水浴中5分鐘，此間振蕩之，使溫度達(dá)到平衡。然后向各試管中加入稀唾液1ml混勻，15分鐘后取出，并向各試管加碘液1滴，觀察顏色變化并予以分析。（二）pH對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響1. 取試管4支，編號(hào)，按下表依次加入各種試劑。式 ir# 試齊J ( mT,、,12340.2 %淀粉液5555PH 4.92緩沖液2PH 6.81緩沖液22PH 8.67緩沖液20.3 % NaCl 溶液11112.混勻后，將各管置于溫水?。?740C）中保溫5分鐘，

21、此間振蕩之，使溫度達(dá)到平衡。然后向1、2、3號(hào)試管中加入稀唾液 1ml, 4號(hào)試管中加入蒸儲(chǔ)水 1ml （作為對(duì)照），混勻，立即放回溫水浴，繼續(xù)保溫 15分鐘后取出，并向各試管加碘液1滴，觀察顏色并解釋結(jié)果。（三）激動(dòng)劑和抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響1. 取試管3支，編號(hào)，按下表依次加入各種試劑。試管號(hào)試齊J （ ml）、1230.2 %淀粉液333PH 6.81緩沖液111蒸儲(chǔ)水10.3 % NaCl 溶液10.5 % CUSO 溶液1稀唾液1112. 混勻后，將各管置于溫水浴（3740 C）中保溫15分鐘后，取出。冷卻后分別加碘液1滴，觀察顏色變化并解釋結(jié)果。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告與內(nèi)容（一）溫度對(duì)酶

22、促反應(yīng)速度的影響觀察顏色變化并予以分析。（二）pH對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響觀察顏色并解釋結(jié)果。（三）激動(dòng)劑和抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響觀察顏色變化并解釋結(jié)果。六、注意事項(xiàng)1 .唾液淀粉酶活性存在個(gè)體差異，同時(shí)受稀釋倍數(shù)影響，收集時(shí)應(yīng)事先確定稀釋倍數(shù),或收集2-3人的濁合唾液。2 .根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件通過(guò)預(yù)測(cè)，確定最佳保溫時(shí)間。七、思考題說(shuō)明PH溫度、激活劑、抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響。實(shí)驗(yàn)五 血清總蛋白、清蛋白及A/ G比值測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? .學(xué)會(huì)血清總蛋白（雙縮月尿比色法）、血清清蛋白（BCG法）測(cè)定的原理、試劑配制及 結(jié)果計(jì)算2 .熟練進(jìn)行實(shí)驗(yàn)基本操作并能遵照注意事項(xiàng)操作3 .正確使用生化實(shí)驗(yàn)室

23、常規(guī)儀器二、實(shí)驗(yàn)原理2+ 、蛋白質(zhì)分子中的肽鍵在堿性條件下， 與Cu廣生紫紅色絡(luò)合反應(yīng)，與縮二月尿在堿性溶液 中與Cu2+的反應(yīng)相似，故稱(chēng)為雙縮月尿反應(yīng)。 產(chǎn)生的顏色強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)的含量成 正比，與同樣處理的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液比較，經(jīng)計(jì)算或查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出血清總蛋白質(zhì)含量。3 .實(shí)驗(yàn)用品與試劑配制1、6mol/L氫氧化鈉溶液稱(chēng)取氫氧化鈉（NaOH優(yōu)級(jí)純）240g ,用新鮮蒸儲(chǔ)水配制成1L,置室溫貯存在密封的聚乙烯瓶里。2、雙縮月尿試劑 稱(chēng)取未失結(jié)晶水的硫酸銅（CuSQ- 5H20）3. 0g,溶于500m1新鮮蒸 儲(chǔ)水中，加酒石酸鉀鈉（NaKGHQ。4陛0）9. 0g,碘化鉀（KI）5 .

24、 0g,待安全溶解后，加入6mol /L氫氧化鈉溶液100ml,最后加蒸儲(chǔ)水至1L。室溫貯存在密閉的聚乙烯瓶里，約穩(wěn)定 6個(gè) 月。3、蛋白標(biāo)準(zhǔn)液可用商品血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或定值質(zhì)控血清為標(biāo)準(zhǔn)。亦可收集混合新鮮血清，用凱氏定氮法標(biāo)定后，加疊氮鈉防腐（疊氮鈉的終濃度0. 51 . 0g/L）,冰凍保存。4、恒溫水浴箱、分光光度計(jì)、吸管、試管。4 .實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作步驟配制20g/L蛋白標(biāo)準(zhǔn)液如蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度為 70g/L,則取此液2m1,加入新鮮蒸儲(chǔ)水5ml,混勻即成。加入物（ml）空白管1234520g/L蛋白標(biāo)準(zhǔn)液0.10.20.30.40.5蒸儲(chǔ)水0.50.40.30.20.1

25、雙縮月尿試劑3.03.03.03.03.03.0相當(dāng)血液蛋白質(zhì)（g/L）20406080100混勻，置37c水浴10min（或25c30min）,用540nm波長(zhǎng)比色，以空白管調(diào)零，讀取各管吸光度。（二）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制（三）樣品測(cè)定操作加入物（ml）測(cè)定管標(biāo)準(zhǔn)管空白管血清0.1蛋白標(biāo)準(zhǔn)液0.1蒸儲(chǔ)水0.40.40.5雙縮月尿試劑3.03.03.0五、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制實(shí)驗(yàn)結(jié)果：人測(cè)=根據(jù)測(cè)定管吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查找相對(duì)應(yīng)的總蛋白濃度。C測(cè)=六、注意事項(xiàng)1 .血清標(biāo)本以新鮮為宜， 但在冰箱保存而不混濁的標(biāo)本也可應(yīng)用，含脂類(lèi)極多的血清加入試劑后仍渾濁不清，可用乙醛抽提后在比色。2 .雙縮月尿

26、試劑要密閉貯存，防止吸收空氣中的二氧化碳。3 .試管、吸管應(yīng)清潔，否則會(huì)有混濁現(xiàn)象出現(xiàn)。4 .明顯溶血標(biāo)本可干擾雙縮月尿反應(yīng)，故不宜使用。5 .黃疸血清可使結(jié)果偏高，最好做相應(yīng)的血清空白，以保證結(jié)果準(zhǔn)確。6 .各種血清蛋白與雙縮月尿試劑的顯色基本相同，但其他類(lèi)蛋白質(zhì)的顯色強(qiáng)度與血清強(qiáng)度與血清蛋白有很大差別，故不可隨意選用未知性能的蛋白質(zhì)作為血清蛋白測(cè)定的標(biāo) 準(zhǔn)。七、思考題測(cè)定血清總蛋白及白、球比值有什么臨床意義？實(shí)驗(yàn)六轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋緦?shí)驗(yàn)要證實(shí)肝臟中 GPT(ALT)活力較高。二、實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)以動(dòng)物肝組織、肌肉組織為標(biāo)本，觀察這些組織中轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的活性大小。GPT的底物：丙

27、酮酸與 a-酮戊二酸在pH 7.4時(shí)，經(jīng)組織勻漿中 GPT催化進(jìn)行轉(zhuǎn)氨基作用， 生成丙酮酸和谷氨酸。丙酮酸與2, 4-二硝基苯腫作用，生成丙酮酸 -2, 4-二硝基苯月宗，后者在堿性溶液中顯棕紅色。棕紅色深淺與酶活力大小成正比，用顏色深淺來(lái)比較肝臟和肌肉中GPT活力。反應(yīng)式如下：XLT.丙氨微+CX胴氏二酸丙酮酸+谷氤酸QH-丙酮酸十2n 4-二石醒基臍丙酮酸 2, 4-二硝基笨朦 棕紅色三、實(shí)驗(yàn)用品1 .勻漿器(或組織搗碎機(jī)或研缽)、滴管、試管和試管架、恒溫水箱、記號(hào)筆。2 . 0.1mol/L pH7.4 磷酸鹽緩沖液。精確量取 0.1mol/L Na2HPO80.8 毫升，0.1mol

28、/ L KH2P0419.2毫升，混勻即成。3 . GPT底物液。稱(chēng)取 DL-丙氨酸1.73克，a-酮戊二酸29.2毫克。將兩種物質(zhì)先溶于 10毫升lmol/L NaOH中，待溶解后，以 1mol/L HCI校正到Ph7.4 ,再加pH7.4磷酸鹽緩 沖液至100毫升，加氯仿數(shù)滴防腐，置冰箱備用。4 .2, 4-二硝基苯腫溶液。稱(chēng)取 2, 4-二硝基苯腫20毫克溶于100毫升1mol/L HCl中(可略加溫助溶)。10005 . 0.4mol/L NaOH取16克NaO哈于500毫升蒸儲(chǔ)水中，再加蒸儲(chǔ)水稀釋至毫升。四.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟1 .將家兔處死后，立即取出肝和肌肉，分別以冰生理鹽水洗去血液

29、，取 10克新鮮肝和 10克肌肉組織，分另剪碎，各加 pH7.4磷酸鹽緩沖液10毫升，用勻漿器或研缽等制成肝勻漿和肌肉勻漿，再加 pH7.4磷酸鹽緩沖液20毫升混勻，制成酶浸出液。2 .取試管三支，編號(hào) 1、2、3,按表操作.試劑（滴）1管2號(hào)3GPT底物液101010肝勻漿3肌勻漿3Ph7.4緩沖液337 C,水浴20分鐘2, 4-二硝基苯隊(duì)55537 C,水浴30分鐘0.4mol/L NaOH5ml5ml5ml5至10分鐘后，觀察結(jié)果。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告與內(nèi)容觀察各管顏色深淺結(jié)果，并加以說(shuō)明。六、注意事項(xiàng)1、酶的活力測(cè)定與溫度、時(shí)間影響很大，因此反應(yīng)嚴(yán)重控制溫度和注意掌握時(shí)間。2、光密度與丙酮酸

30、的標(biāo)準(zhǔn)線成拋物線，是因?yàn)槌崤c2.4二硝基苯腫在堿性溶液中能成腺外，“酮戊二酸亦能與2.4二硝基苯腫產(chǎn)生苯腺。這是本實(shí)驗(yàn)方法的缺點(diǎn)。七、思考題轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定臨床意義。實(shí)驗(yàn)七血清蛋白 醋酸纖維薄膜電泳 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康臄⑹鲭娪痉ǚ蛛x蛋白質(zhì)的原理、及臨床意義，熟練掌握操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)大都在pH7以下，將血清置于 pH8.6的緩沖液中，蛋白質(zhì)均帶負(fù)電，在電場(chǎng)中都向陽(yáng)極移動(dòng)。因血清各種蛋白質(zhì)在同一pH環(huán)境中所帶負(fù)電荷多少及分子大小不同，所以在電場(chǎng)中向陽(yáng)極泳動(dòng)速度不同。蛋白質(zhì)分子小而帶電荷多者，泳動(dòng)速度快；反之則慢。因此可將血清蛋白質(zhì)依次分為清蛋白、ai-球蛋白、a2-球蛋

31、白、b-球蛋白和g球蛋白五條區(qū)帶，經(jīng)染色可計(jì)算出各血清蛋白質(zhì)含量的百分?jǐn)?shù)。三.實(shí)驗(yàn)用品1 .儀器：電泳儀、電泳槽、分光光度計(jì)。2 .材料：醋酸纖維薄膜、培養(yǎng)皿、濾紙、鐐子、加樣器、直尺、鉛筆、剪刀等。3 .巴比妥巴比妥鈉緩沖液 (pH8.6 , m=0.06)。稱(chēng)取巴比妥 2.22克和巴比妥鈉12.36 克，溶于500毫升蒸儲(chǔ)水中，加熱溶解。待冷至室溫后，再加蒸儲(chǔ)水稀釋至1000毫升。4 .染色液。稱(chēng)取麗春紅 S0.4克及三氯醋酸6克；用蒸儲(chǔ)水溶解，并稀釋至100毫升。5 .漂洗液。3%(V/V)醋酸溶液。6 .透明液。取無(wú)水乙醇 75毫升和冰醋酸25毫升混勻備用。7 . 0.4mol /L氫氧化鈉溶液。8 . 40%(V7 V)醋酸溶液。四.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟1 .薄膜的準(zhǔn)備：取醋纖薄膜（2厘米*8厘米）在毛面的一端約1.5厘米處，用鉛筆輕劃一 直線，表露點(diǎn)樣位置并編號(hào)。將此薄膜置于巴比妥緩沖液中浸泡，待充分浸透（即膜條無(wú)白斑時(shí)）后取出，用潔凈濾紙輕輕吸去表面的多余緩沖液。2 .點(diǎn)樣：取少量血清置