食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書

1、食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)何志平 等編農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院20012.10實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及電泳檢測一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)掌握堿裂解法提取細(xì)菌質(zhì)粒DNA。二 實(shí)驗(yàn)原理 1. 細(xì)菌中有兩種DNA，即染色體DNA和質(zhì)粒DNA。 2. 質(zhì)粒DNA的提取方法有三種：堿裂解法，煮沸法，去污劑（如Triton和SDS）裂解法。3. 堿裂解法比較劇烈，可破壞堿基配對，使宿主細(xì)胞DNA變性，共價閉合環(huán)狀DNA由 于空間纏繞，兩條鏈不會徹底分開。當(dāng)外界條件到達(dá)復(fù)性條件時，質(zhì)粒DNA的雙鏈又迅速恢復(fù)原狀，而較大的線性染色體DNA難以復(fù)性。三 實(shí)驗(yàn)材料：轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌(含有質(zhì)粒的大腸桿菌)四、實(shí)驗(yàn)用具和藥品1.

2、 實(shí)驗(yàn)用具:搖床，離心機(jī)，移液器及槍頭，玻璃試管（15mL）及塞子，離心管（1.5mL）2. 實(shí)驗(yàn)試劑：1 溶液I 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl（pH8.0） 10 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）2 溶液II 0.4mol/L NaOH，2%SDS，用前等體積混合3 溶液III 5 mol/L 乙酸鉀 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml4 TE 緩沖液 10 mmol/L Tris·HCl（pH8.0） 1 mmol/L EDTA（pH8.0）5 70%乙醇（放-20冰箱中，

3、用后即放回）6 RNA酶 將RNA酶溶于10 mmol/L Tris·HCl（pH7.5）、15 mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的濃度，于100加熱15min，緩慢冷卻至室溫，保存于-20。 7 加樣緩沖液（6X）：40%蔗糖、0.25%溴酚蘭電泳緩沖液：0.045mol/L Tris-硼酸   0.001mol/L EDTA （0.5X TBE buffer）貯存液：5X：54g Tris堿    27.5g硼酸    20ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）五 實(shí)驗(yàn)步驟（一）細(xì)菌繁殖挑取白色的單菌落

4、若干，轉(zhuǎn)移到3mL液體LB培養(yǎng)基(附加100mg/ml Amp ),37過夜振蕩（200r/min）培養(yǎng)。（二）菌體收集將過夜培養(yǎng)的菌體轉(zhuǎn)入1.5mL離心管，離心30sec 5000r/min；棄上清提取質(zhì)粒（三）質(zhì)粒提取方法一：堿裂解法提取質(zhì)粒DNA1.將上述沉淀重懸于250L冰預(yù)冷的溶液中，劇烈震蕩；2加入250L溶液，蓋緊管口，快速顛倒離心管510次；3加入350L冰預(yù)冷的溶液，蓋緊管口，溫和地顛倒離心管510次；9000r/min離心5min上清轉(zhuǎn)移到另一新1.5mL離心管中；4加等體積氯仿，振蕩混合，靜置， 9000r/min離心5min，上清轉(zhuǎn)移到另一新1.5mL離心管中；5加入1

5、/10體積3mol/L的醋酸鈉和2倍體積的乙醇，充分混勻，靜置5min；9000r/min離心5min；6棄上清，用70ethanol洗滌；7加30LTE溶解，-20 保存。方法二：試劑盒提取方法1.離心收集的菌體中加入含RNAase的溶液250L，重懸菌體；2. 加溶液250L，輕輕顛倒離心管10次，靜止（1-2分鐘），至溶液澄清；3. 加入350L冰預(yù)冷的溶液，快速顛,20-30次；4. 12000r/min離心10min；5. 將上清轉(zhuǎn)移到DNA結(jié)合離心管中，12000r/min離心1min；6. 加入去蛋白試劑500L，12000r/min離心1min；7. 加洗滌液750L，1200

6、0r/min離心1min；8. 加洗滌液700L，12000r/min離心1min；9. DNA結(jié)合柱12000r/min離心2min，去除殘余的洗滌液；10 DNA結(jié)合柱放入另一個新的1.5mL離心管中，室溫1-2min，加入洗脫緩沖液50-100L；11 12000r/min離心1min；（四）檢測提取DNA質(zhì)量的電泳檢測。l 取2ul質(zhì)粒DNA+2ul加樣緩沖液+6ul ddH2O；l 配制1%的瓊脂糖凝膠l 電泳30min，EB染色，拍照。注意事項(xiàng)：氯仿對眼睛、皮膚、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌劑并可損傷肝臟和腎臟，操作時需戴手套、口罩。六 實(shí)驗(yàn)作業(yè)1. 思考本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟是什

7、么？2. 瓊脂糖電泳鑒定質(zhì)粒DNA時，能看到幾條帶，快慢順序是什么？3. 附上電泳圖片。實(shí)驗(yàn)二、固定化-淀粉酶及活性測定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮驮砟康模簩W(xué)會包埋法制備固定化酶的操作技術(shù)內(nèi)容：制備固定化酶的方法很多，利用雙功能試劑或多功能試劑在酶分子間，酶分子與惰性蛋白間，或酶分子與載體間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，以共價鍵制備固定化酶的方法稱為交聯(lián)法，本實(shí)驗(yàn)即采用包埋法。二、實(shí)驗(yàn)器材1 恒溫水浴鍋2 恒溫振搖儀三、實(shí)驗(yàn)試劑1. 海藻酸鈉2. CaCl23. 碘原液：稱取碘1.1g。碘化鉀2.2g，置于小燒杯中，加10ml蒸餾水使之溶解，然后轉(zhuǎn)入容量瓶中。再加少量的蒸餾水洗滌燒杯數(shù)次，洗滌液均轉(zhuǎn)入容量瓶中，最后定容至

8、50ml。搖均后放于棕色試管中備用。4. 比色稀碘液：取碘原液2ml，加碘化鉀20g，再用蒸餾水定容至5000ml。5. 2%淀粉溶液：稱取2g可溶淀粉，放入小燒杯中，加少量蒸餾水做成懸浮液。然后在攪拌下注入沸騰的蒸餾水中，繼續(xù)煮沸一分鐘，冷卻后加蒸餾水定容至100ml。6. pH6磷酸氫二鈉檸檬酸緩沖液：稱取磷酸二氫鈉（Na2HPO4.12H2O）45.23g,檸檬酸（C6H8O7.H2O）8.07g,先在燒杯中使之溶解，然后轉(zhuǎn)入容量瓶中定容至1000ml。四、實(shí)驗(yàn)操作（1）酶液的制備精確稱取-淀粉酶2g，先用少量40pH6的磷酸二氫鈉檸檬酸緩沖液溶解，溶解過程中輕輕用玻璃棒搗研。將上層液小

9、心傾入100ml容量瓶，沉渣部分再加入少量上述緩沖液，如此反復(fù)搗研34次。最后，將溶液與殘?jiān)恳迫肴萘科恐?，用緩沖液先定容搖勻后，通過四層紗布過濾，溶液供測定使用。（2）配制CaCl2溶液：0.83gCaCl2150mL蒸餾水200mL燒杯溶解備用。（3）配制海藻酸鈉溶液：0.7g海藻酸10mL水50mL燒杯酒精燈微火（或間斷）加熱，并不斷攪拌，使之溶化蒸餾水定容到10mL。（4）海藻酸鈉溶液與酶液的混合：將溶化的海藻酸鈉溶液冷卻至室溫，加入酶液，攪拌后吸入到注射器中。（5）固定化酶制備：以恒定速度緩慢地將注射器中的溶液滴加到CaCl2溶液中，形成凝膠珠狀顆粒。（6）固定化-淀粉酶活力測定及

10、活力回收率的計算a. 首先用吸管取1ml的標(biāo)準(zhǔn)終點(diǎn)色溶液，加至白瓷板的空穴內(nèi)，作為終點(diǎn)參照的標(biāo)準(zhǔn)。b. 固定前總酶活力測定：取20ml 2%的可溶淀粉液與5mLpH6的磷酸氫二鈉檸檬酸緩沖液，加入一支大試管中。將試管置于60水浴5分鐘。然后加入前面制備的酶液0.5ml。搖勻后，立即用秒表記錄時間。此后，每經(jīng)一段時間，用吸管吸出0.2ml反應(yīng)液，加入預(yù)先盛入稀碘液的白瓷板中。當(dāng)穴內(nèi)顏色反應(yīng)由紫色逐漸變?yōu)榧t棕色并與標(biāo)準(zhǔn)色相同時，即為反應(yīng)終點(diǎn)，記錄反應(yīng)到達(dá)終點(diǎn)時的時間。c. 固定化酶活力測定：取20ml 2%的可溶淀粉液與5mLpH6的磷酸氫二鈉檸檬酸緩沖液，加入一支大試管中。將試管置于60水浴5分

11、鐘。然后加入前面制備的固定化酶。搖勻后，立即用秒表記錄時間。此后，不斷振搖，每經(jīng)一段時間，用吸管吸出0.2ml反應(yīng)液，加入預(yù)先盛入稀碘液的白瓷板中。當(dāng)穴內(nèi)顏色反應(yīng)由紫色逐漸變?yōu)榧t棕色并與標(biāo)準(zhǔn)色相同時，即為反應(yīng)終點(diǎn)，記錄反應(yīng)到達(dá)終點(diǎn)時的時間。d. 酶活力計算：以60、pH6的條件下，每小時水解1g淀粉的酶量為一個活力單位。 固定前原酶活力單位 = 60/T×20×2%×n/0.5固定后的酶活力單位 = 60/T×20×2%×n/10T：反應(yīng)到終點(diǎn)時的時間（分）n：酶粉稀釋的倍數(shù)5. 固定化后酶活力回收率計算：酶活力回收率=（固定后的酶活

12、力單位/固定前原酶活力單位） × 100%五、思考題1、固定化酶有哪些優(yōu)點(diǎn)？實(shí)驗(yàn)三、固定化酵母細(xì)胞發(fā)酵一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮驮砟康模簩W(xué)會包埋法制備固定化酵母的操作技術(shù)內(nèi)容：采用包埋法制備固定化酵母，應(yīng)用固定化酵母進(jìn)行發(fā)酵。二、實(shí)驗(yàn)器材1、恒溫水浴鍋2、恒溫振搖儀三、實(shí)驗(yàn)試劑1. 海藻酸鈉2. CaCl23. 葡萄糖四、實(shí)驗(yàn)操作1制備固定化酵母細(xì)胞（1）酵母細(xì)胞的活化：1g干酵母10mL蒸餾水50mL燒杯攪拌均勻放置1h，使之活化。（2）配制CaCl2溶液：0.83gCaCl2150mL蒸餾水200mL燒杯溶解備用。（3）配制海藻酸鈉溶液：0.7g海藻酸10mL水50mL燒杯酒精燈微火（或間

13、斷）加熱，并不斷攪拌，使之溶化蒸餾水定容到10mL。（4）海藻酸鈉溶液與酵母細(xì)胞的混合：將溶化的海藻酸鈉溶液冷卻至室溫，加入活化酵母細(xì)胞液，攪拌后吸入到注射器中。防止高溫殺死酵母細(xì)胞。（5）固定化酵母細(xì)胞：以恒定速度緩慢地將注射器中的溶液滴加到CaCl2溶液中，形成凝膠珠狀顆粒。2固定化酵母細(xì)胞的發(fā)酵（6）沖洗：將固定的酵母細(xì)胞凝膠珠用蒸餾水沖洗23次。（7）發(fā)酵：150mL10葡萄糖固定化酵母細(xì)胞200mL錘形瓶密封25發(fā)酵24h。五、思考題1、微火加熱并不斷攪拌的目的是什么？2、為什么要海藻酸鈉溶液冷卻后才能加入酵母細(xì)胞？3、發(fā)酵過程中錐形瓶為什么要密封？實(shí)驗(yàn)四 溶菌酶的制備一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c

14、內(nèi)容目的：1. 掌握等電點(diǎn)沉淀法進(jìn)行初級分離的操作方法和注意事項(xiàng)；2. 掌握測定蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法；3. 能針對不同的目標(biāo)產(chǎn)物選擇恰當(dāng)?shù)某跫壏蛛x方法，鍛煉應(yīng)用生物分離技術(shù)知識分析、解決實(shí)際問題的能力。內(nèi)容：1. 從雞蛋清中粗提取出溶菌酶；2. 制作測定蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 二、溶菌酶的粗提?。ㄒ唬?shí)驗(yàn)儀器和試劑1. 實(shí)驗(yàn)儀器721型分光光度計、搖床、高速離心機(jī)2. 實(shí)驗(yàn)材料和試劑：200mL燒杯、玻璃棒、漏斗、定性快速濾紙、200mL量筒、50mL離心管雞蛋1只、0.02 mol/L PBS( pH8.0),  （二）實(shí)驗(yàn)步驟1. 取雞蛋一個，破殼去蛋清置于250ML

15、燒杯中，并記錄器體積；2. 加入1.5倍體積的pH7.0的PBS緩沖液，攪拌均勻，取0.5 ML蛋清至1.5 ML離心管中備用（樣品1）；3. 用醋酸將蛋清也的pH調(diào)至4.7，充分?jǐn)嚢瑁?. 3500rpm/min,離心20min,去上清;5. 取0.5 ML蛋清至1.5 ML離心管中備用(樣品2)二、SDS-PAGE蛋白電泳（一） 原理: 聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺 (簡稱Acr) 和交聯(lián)劑N,N亞甲基雙丙烯酰胺(簡稱Bis)在催化劑作用下,聚合交聯(lián)而成的具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的凝膠,并以此為支持物進(jìn)行電泳.聚丙烯酰胺凝膠電泳可根據(jù)不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷的差異及分子大小的不同所產(chǎn)生的不同

16、遷移率將蛋白質(zhì)分離成若干條區(qū)帶,如果分離純化的樣品中只含有同一種蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)樣品電泳后,就應(yīng)只分離出一條區(qū)帶.    SDS是一種陰離子表面活性劑能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵,并按一定的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物,使蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其本身原有的電荷,掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異.因此,各種蛋白質(zhì)-SDS 復(fù)合物在電泳時的遷移率,不再受原有電荷和分子形狀的影響,而只是棒長的函數(shù).這種電泳方法稱為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡稱SDSPAGE).由于SDS-PAGE 可設(shè)法將電泳時蛋白質(zhì)電荷差異這一因素除去或減小到可以略而不計的程度,因此常用來鑒定蛋

17、白質(zhì)分離樣品的純化程度,如果被鑒定的蛋白質(zhì)樣品很純,只含有一種具三級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或含有相同分子量亞基的具四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì),那么SDSPAGE 后,就只出現(xiàn)一條蛋白質(zhì)區(qū)帶.    SDSPAGE 可分為圓盤狀和垂直板狀、連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng).本實(shí)驗(yàn)采用垂直板狀不連續(xù)系統(tǒng).所謂“不連續(xù)”是指電泳體系由兩種或兩種以上的緩沖液、pH 和凝膠孔徑等所組成.1. 蛋白樣品濃縮效應(yīng)    在不連續(xù)電泳系統(tǒng)中,含有上、下槽緩沖液(TrisGly,pH8.3)、濃縮膠緩沖液(TrisHCl,pH6.8)、分離膠緩沖液(TrisHCl,pH8.8),兩種

18、凝膠的濃度(即孔徑)也不相同.在這種條件下,緩沖系統(tǒng)中的HCl 幾乎全部解離成Cl,兩槽中的Gly (pI6.0,pK a=9.7)只有很少部分解離成Gly 的負(fù)離子,而酸性蛋白質(zhì)也可解離出負(fù)離子.這些離子在電泳時都向正極移動.C1速度最快(先導(dǎo)離子),其次為蛋白質(zhì),Gly 負(fù)離子最慢(尾隨離子).由于C1很快超過蛋白離子,因此在其后面形成一個電導(dǎo)較低、電位梯度較陡的區(qū)域,該區(qū)電位梯度最高,這是在電泳過程中形成的電位梯度的不連續(xù)性,導(dǎo)致蛋白質(zhì)和Gly 離子加快移動,結(jié)果使蛋白質(zhì)在進(jìn)入分離膠之前,快、慢離子之間濃縮成一薄層,有利于提高電泳的分辨率.2. 分子篩效應(yīng)  

19、0; 蛋白質(zhì)離子進(jìn)入分離膠后,條件有很大變化.由于其pH 升高(電泳進(jìn)行時常超過9.0),使Gly 解離成負(fù)離子的效應(yīng)增加;同時因凝膠的濃度升高,蛋白質(zhì)的泳動受到影響,遷移率急劇下降.此兩項(xiàng)變化,使Gly 的移動超過蛋白質(zhì),上述的高電壓梯度不復(fù)存在,蛋白質(zhì)便在一個較均一的pH 和電壓梯度環(huán)境中,按其分子的大小移動.分離膠的孔徑有一定的大小,對不同相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)來說,通過時受到的阻滯程度不同,即使凈電荷相等的顆粒,也會由于這種分子篩的效應(yīng),把不同大小的蛋白質(zhì)相互分開.（二）實(shí)驗(yàn)儀器和試劑1. 電泳儀，水平搖床2. 試劑: 丙烯酰胺，雙丙烯酰胺，Tris-base，TEMED，SDS，過硫酸

20、銨，甘油，溴酚蘭，甘氨酸，DTT，考馬斯亮藍(lán)R-250，甲醇，冰醋酸，蛋白Marker（50ul裝），溶菌酶10mg。3. 緩沖液(1) 2M Tris-HCL (pH8.8)100ml：24.2g Tris-base，50ml蒸餾水，加入濃鹽酸調(diào)pH8.8，最后定容至100ml。(2) 1M Tris-HCL (pH6.8)100ml：12.1g Tris-base，50ml蒸餾水，加入濃鹽酸調(diào)pH6.8，最后定容至100ml。(3) 10%SDS 100ml：10gSDS，加入70ml蒸餾水在60攪拌溶解，待泡沫消失后，定容至100ml。(4) 50%（w/v）甘油  100ml

21、：50ml甘油，50ml蒸餾水，混勻即可。(1) 1%（w/v）溴酚蘭10ml：100mg溴酚蘭，蒸餾水定容至10ml。0.139g乙酸鈉溶于100ml蒸餾水中，調(diào)pH至5.2。4. 工作液：(1)30%聚丙酰胺母液（A液）實(shí)際需要250ml100ml：                   丙烯酰胺29g，雙丙烯酰胺1g，去離子水在37溶解，定容到100ml。0.45m濾器過濾除菌，棕色瓶保存。pH7.0。

22、(2) 4×分離膠緩沖液（B液）100ml：                  75ml 2M Tris-HCL (pH8.8)                       

23、60;  4ml 10%SDS                          21ml蒸餾水                  

24、0;       4存放。(3) 4×濃縮膠緩沖液（C液）100ml：                   50ml 1M Tris-HCL (pH6.8)              

25、60;           4ml 10%SDS                          46ml蒸餾水         

26、0;                4存放。(4) 10%過硫酸銨（D液）5ml：                 0.5g過硫酸銨，5ml蒸餾水，0.1ml分裝。(5) TEMED （E液）(6) 1×Tris-甘氨酸緩沖液1L：Tris-base 3g&#

27、160;     甘氨酸 14.4gSDS 1g蒸餾水定容到1L，pH8.3左右。(7) 5×上樣緩沖液 10ml：                 0.5ml 1M Tris-HCL（pH6.8）             

28、60;         1ml 1M DTT                       2ml 10% SDS              

29、         1ml 1%溴酚蘭                       5ml 50%甘油               

30、        0.5ml 蒸餾水(8) 考馬斯亮藍(lán)染色液 1L：                   考馬斯亮藍(lán)R-250 1.0g               

31、60;       甲醇450ml                       冰醋酸 100ml                 

32、;      蒸餾水450ml(9) 考馬斯亮藍(lán)脫色液 1L：     甲醇100ml                       冰醋酸 100ml