瓊脂糖(Agarose)凝膠電泳檢測核酸實驗-明德生物

1、MINDEL 明德生物銷售熱線：瓊脂糖（Agarose ）凝膠電泳檢測核酸實驗一、實驗目的瓊脂糖（Agarose ）凝膠電泳是常用的檢測核酸的方法，學習DNA 瓊脂糖凝膠電泳的使用技術，掌握有關的技術和識讀電泳圖譜的方法。 二、實驗原理瓊脂糖（Agarose ）凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA 、RNA 分子混合物的方法，這種電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA 分子在泳動時的電荷效應和分子篩效應，達到分離混合物的目的。DNA 分子在高于其等電點的溶液中帶負電，在電場中向陽極移動。在一定的電場強度下，DNA 分子的遷移速度取決于分子篩效應，即分子本身的大小

2、和構(gòu)型是主要的影響因素。DNA 分子的遷移速度與其相對分子量成反比。不同構(gòu)型的DNA 分子的遷移速度不同。如環(huán)形DNA 分子樣品，其中有三種構(gòu)型的分子：共價閉合環(huán)狀的超螺旋分子（cccDNA ）、開環(huán)分子(ocDNA、和線形DNA 分子(IDNA。這三種不同構(gòu)型分子進行電泳時的遷移速度大小順序為:cccDNAIDNA ocDNA核酸分子是兩性解離分子，pH3.5是堿基上的氨基解離，而三個磷酸基團中只有一個磷酸解離，所以分子帶正電，在電場中向負極泳動；而pH8.0-8.3時，堿基幾乎不解離，而磷酸基團解離，所以核酸分子帶負電，在電場中向正極泳動。不同的核酸分子的電荷密度大致相同，因此對泳動速度影

3、響不大。在中性或堿性時，單鏈DNA 與等長的雙鏈DNA 的泳動率大致相同。影響核酸分子泳動率的因素主要是：1、樣品的物理性狀即分子的大小、電荷數(shù)、顆粒形狀和空間構(gòu)型。一般而言，電荷密度愈大，泳動率越大。但是不同核酸分子的電荷密度大致相同，所以對泳動率的影響不明顯。MINDEL 明德生物銷售熱線：對線形分子來說，分子量的常用對數(shù)與泳動率成反比，用此標準樣品電泳并測定其泳動率，然后進行DNA 分子長度（bp ）的負對數(shù)泳動距離作標準曲線圖，可以用于測定未知分子的長度大小。DNA 分子的空間構(gòu)型對泳動率的影響很大，比如質(zhì)粒分子，泳動率的大小順序為：cDNA IDNA o

4、cDNA 但是由于瓊脂糖濃度、電場強度、離子強度和溴化乙錠等的影響，會出現(xiàn)相反的情況。2、支持物介質(zhì)核酸電泳通常使用瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠兩種介質(zhì)，瓊脂糖是一種聚合鏈線性分子。含有不同濃度的瓊脂糖的凝膠構(gòu)成的分子篩的網(wǎng)孔大小不同，是于分離不同濃度范圍的核酸分子。聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺（Acr ）在N,N,N-四甲基乙四胺（TEMED ）和過硫酸銨（AP ）的催化下聚合形成長鏈，并通過交聯(lián)劑N,N-亞甲雙丙烯酰胺（Bis ）交叉連接而成，其網(wǎng)孔的大小由Acr 與Bis 的相對比例決定。瓊脂糖凝膠適合分離長度100至60的分子，而聚丙烯酰胺凝膠對于小片段（5bp-500bp ）的分離效果最好

5、。選擇不同濃度的凝膠，可以分離不同大小范圍的DNA 分子。3、電場強度電場強度愈大，帶點顆粒的泳動越快。但凝膠的有效分離范圍隨著電壓增大而減小，所以電泳時一般采用低電壓，不超過4V/cm。而對于大片段電泳，甚至用0.5-1.0V/cm電泳過夜。進行高壓電泳時，只能使用聚丙烯酰胺凝膠。4、緩沖液離子強度核酸電泳常采用TAE 、TBE 、TPE 三種緩沖系統(tǒng)，但它們各有利弊。TAE 價格低廉，但緩沖能力低，必須進行兩極緩沖液的循環(huán)。TPE 在進行DNA 回收時，會使DNA 污染磷酸鹽，影響后續(xù)反應。所以多采用TBE 緩沖液。在緩沖液中加入EDTA ，可以鰲合二價離子，抑制DNase ，保護DNA

6、。緩沖液pH 常偏堿性或中性，此時核酸分子帶負電，向正極移動。MINDEL 明德生物銷售熱線：核酸電泳中常用的染色劑是溴化乙錠（ethidium bromide GELRED）。溴化乙錠是一種扁平分子，可以嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間。在紫外線照射BE-DNA 復合物時，出現(xiàn)不同的效應。254nm 的紫外線照射時，靈敏度最高，但對DNA 損傷嚴重；360nm 紫外線照射時，雖然靈敏度較低，但對DNA 損傷小，所以適合對DNA 樣品的觀察和回收等操作。300nm 紫外線照射的靈敏度較高，且對DNA 損傷不是很大，所以也比較適用。使用溴化乙錠對DNA 樣品進行染色，可以

7、在凝膠中加入終濃度為0.5g/ml的GELRED 。GELRED 摻入DNA 分子中，可以在電泳過程中隨時觀察核酸的遷移情況，但是如果要測定核酸分子大小時，不宜使用以上方法，而是應該在電泳結(jié)束后，把凝膠浸泡在含0.5g/mlGELRED 的溶液中1030min 進行染色。BE 見光分解，應在避光條件下4保存。三、材料、試劑及器具1、材料DNA/Hind Marker （分子量標準）；質(zhì)粒提取物；酶切產(chǎn)物；連接產(chǎn)物。2、試劑加樣緩沖液（6x ）：0.25% 溴酚蘭，40%蔗糖；瓊脂糖（Agarose ）； GelRed 熒光核酸凝膠染色試劑；酶液（10mg/ml）。3、器具（1）電泳系統(tǒng)：電泳儀

8、、水平電泳槽、制膠板等。（2）紫外透射儀。四、操作步驟1、按所分離的DNA 分子的大小范圍，稱取適量的瓊脂糖粉末，放到一錐形瓶中，加入適量的0.5TBE 電泳緩沖液。然后置微波爐加熱至完全溶化，溶液透明。稍搖勻，得膠液。冷卻至60左右，在膠液內(nèi)加入適量的GelRed 至濃度為0.5g/ml。2、取有機玻璃制膠板槽，有透明膠帶沿膠槽四周封嚴，并滴加少量的膠液封好膠帶與膠槽之間的縫隙。MINDEL 明德生物銷售熱線：3、水平放置膠槽，在一端插好梳子，在槽內(nèi)緩慢倒入已冷至60左右的膠液，使之形成均勻水平的膠面。4、. 待膠凝固后，小心拔起梳子，撕下透明膠帶，使加樣孔端置

9、陰極段放進電泳槽內(nèi)。5、在槽內(nèi)加入0.5TBE 電泳緩沖液，至液面覆蓋過膠面6、把待檢測的樣品，按以下量在潔凈載玻片上小心混勻，用移液槍加至凝膠的加樣孔中。 1l加樣緩沖液（6）+5l待測DNA 樣品+0.5l GelRed 液（0.5mg/ml）（注：若膠內(nèi)未加GelRed ，可選用此法）。7、接通電泳儀和電泳槽，并接通電源，調(diào)節(jié)穩(wěn)壓輸出，電壓最高不超過5V/cm，開始電泳。點樣端放陰極端。根據(jù)經(jīng)驗調(diào)節(jié)電壓使分帶清晰。8、觀察溴酚蘭的帶（藍色）的移動。當其移動至距膠板前沿約1cm 處，可停止電泳。9、染色：把膠槽取出，小心滑出膠塊，水平放置于一張保鮮膜或其他支持物上，放進GelRed 溶液中

10、進行染色，完全浸泡約30min 。10、在紫外透視儀的樣品臺上重新鋪上一張保鮮膜，趕去氣泡平鋪，然后把已染色的凝膠放在上面。關上樣品室外門，打開紫外燈（360nm 或254nm ），通過觀察孔進行觀察。五、注意事項1、電泳中使用的化學試劑，務必小心，勿沾染于衣物、皮膚、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在專門的電泳區(qū)域操作，戴一次性手套，并及時更換。2、預先加入GelRed 時可能使 DNA 的泳動速度下降15%左右，而且對不同構(gòu)型的DNA 的影響程度不同。所以為取得較真實的電泳結(jié)果可以在電泳結(jié)束后再用0.5g/ml的GelRed 溶液浸泡染色。若膠內(nèi)或樣品內(nèi)已加GelRed ，染色步驟可省略；若凝

11、膠放置一段時間后才觀察，即使原來膠內(nèi)或樣品已加GelRed ，也建議增加此步。3、加樣進膠時不要形成氣泡，需在凝膠液未凝固之前及時清除，否則，需重新制膠。MINDEL 明德生物銷售熱線：4、以0.5TBE 作為電泳緩沖液時，溴酚蘭在0.5%1.4%的瓊脂糖凝膠中的泳動速度大約相當于300bp 的線性DNA 的泳動速度，而二甲苯青FF 的泳動速度相當于4Kb 的雙鏈線形DNA 的泳動速度。蘇州明德生物科技有限公司是一家創(chuàng)辦于2012年的創(chuàng)新型高科技企業(yè)，自公司成立以來一直以“客戶第一”為公司核心價值觀，專注于為生命科學和生物技術領域的客戶提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和技術服務。主要經(jīng)營生物試劑、實驗室耗材、儀器設備本公司代理、經(jīng)銷試劑品牌Acros 、Merck 、Sigma 、TCI 、Amresco 等，生物試劑品牌invitrogen ，Abcam 、 ABGENE 、ABI 、ABR 、BD pharmingen 、CST 、ELISA 試劑