細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告染色體的觀察山東大學(xué)匯總

1、一、實(shí)驗(yàn)名稱小鼠染色體標(biāo)本的制備、觀察二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、熟悉動(dòng)物生殖細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程及各個(gè)時(shí)期特點(diǎn)。2、掌握小鼠睪丸減數(shù)分裂標(biāo)本的制作方法。3、學(xué)習(xí)染色體的染色和觀察過(guò)程。三、實(shí)驗(yàn)原理1、染色體 染色體是細(xì)胞內(nèi)具有遺傳性質(zhì)的遺傳物質(zhì)深度壓縮形成的聚合體，易被堿性染料染成深色，所以叫染色體（染色質(zhì)）。染色體的分析往往是選擇細(xì)胞處于活躍增殖狀態(tài)，或者經(jīng)過(guò)各種處理后細(xì)胞進(jìn)入分裂的動(dòng)物組織。2、細(xì)胞分裂及其觀察 細(xì)胞的有絲分裂可以大體分為五個(gè)階段：前期、前中期、中期、后期、末期，每一個(gè)時(shí)期都有它特定的形態(tài)和行為特征。 分裂前期：染色體凝集，間期細(xì)長(zhǎng)、彌散分布的線性染色質(zhì)，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步螺旋化、折疊和包裝等過(guò)

2、程，逐漸變短變粗，形成光鏡下可辨的早期染色體結(jié)構(gòu)。隨著染色質(zhì)的凝集，核仁縮小消失。分裂極確立: 復(fù)制了的中心體分離，向兩極移動(dòng)。紡錘體裝配：從中心體形成星體微管和極微管。 前中期：核膜崩解；紡錘體完成裝配，前期星體的形成和向兩極的運(yùn)動(dòng)標(biāo)志著紡錘體組裝的開始。隨著核膜的解體，由紡錘體兩極發(fā)出的一些星體微管可進(jìn)入“核”內(nèi)，通過(guò)其正極端捕獲染色體，形成動(dòng)粒微管。至此，紡錘體基本完成組裝；染色體整列，在動(dòng)粒微管的作用下，染色體列隊(duì)到赤道板。 中期：染色體排列在赤道板上，也是該實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)觀察時(shí)期。 后期：姐妹染色單體分離并向細(xì)胞兩極移動(dòng)。后期A，動(dòng)粒微管變短，牽動(dòng)染色體向兩極運(yùn)動(dòng)；后期B，極微管長(zhǎng)度增加

3、，兩極之間的距離逐漸拉長(zhǎng)。 末期：兩子細(xì)胞核形成，染色體去濃縮，核膜重建，核仁重現(xiàn)。 在正常動(dòng)物體內(nèi)，骨髓和睪丸是處于不斷分裂的組織。給動(dòng)物注射一定劑量的秋水仙素即可使許多處于分裂的細(xì)胞停滯于中期，然后采用常規(guī)空氣干燥法制備染色體，即可得到大量可分析的染色體標(biāo)本。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，可在取材前經(jīng)腹腔注射有絲分裂抑制劑，一般常用秋水仙素，這此方法對(duì)于動(dòng)物的核型分析是非常有用的。本方法簡(jiǎn)便、可靠，不需要經(jīng)體外培養(yǎng)和無(wú)菌操作，易于推廣。因此睪丸和骨髓細(xì)胞是用于動(dòng)物細(xì)胞遺傳學(xué)研究很好的材料。3、睪丸睪丸是雄性生殖細(xì)胞發(fā)育和成熟的部位，是產(chǎn)生精子的器官。睪丸內(nèi)的曲細(xì)精管從外到內(nèi)一次分布有精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞

4、、次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞以及形態(tài)漸變中的精子。取睪丸將曲細(xì)精管內(nèi)的細(xì)胞沖出后固定，然后制片染色，可以觀察到動(dòng)物生殖細(xì)胞減數(shù)分裂染色體的不同時(shí)相。如果提前給動(dòng)物腹腔注射秋水仙素溶液，可以抑制生殖細(xì)胞的正常分裂，增加中期分裂相細(xì)胞的數(shù)目，此方法可用來(lái)進(jìn)行減數(shù)分裂過(guò)程中染色體的計(jì)數(shù)與觀察。睪丸染色體標(biāo)本的制備，可用來(lái)檢測(cè)雄性個(gè)體生殖細(xì)胞是否受到周圍環(huán)境污染或是否發(fā)生病變，是小型動(dòng)物生殖學(xué)常規(guī)實(shí)驗(yàn)。4、倒置染色法在玻璃板上用廢舊玻璃板作支架，使得標(biāo)本載玻片的正面朝下放置到支架上，在玻璃板和標(biāo)本載玻片之間滴加Giemsa染液，這樣，一可以節(jié)省染料，二可以防止染料快速揮發(fā)，三可以防止染色顆粒沉淀影響觀察。

5、在操作時(shí)應(yīng)注意，多個(gè)樣品同時(shí)染色應(yīng)擺放緊密，不要有間隙。滴染液時(shí)應(yīng)盡量慢，不要有氣泡，以免部分染色體不著色，影響觀察。三、實(shí)驗(yàn)材料1、材料 68周齡，2030g的雄性小鼠2、試劑（1）0.85%氯化鈉溶液（2）0.02%秋水仙素溶液，4保存（3）0.4%KCl溶液（4）卡諾氏固定液 無(wú)水乙醇：無(wú)水乙酸=3:1（5）1/15 mol/L的磷酸緩沖液（pH=6.8）（6）Giemsa 染液3、器材離心機(jī)、鑷子、解剖盤、載玻片、玻璃板、小燒杯、普通光學(xué)顯微鏡、解剖剪、銅網(wǎng)、滴管、離心管等。四、實(shí)驗(yàn)步驟染色體標(biāo)本的制備：1、取雄性小鼠以每克體重4注射秋水仙素，經(jīng)1416小時(shí)后，斷頭法殺死小鼠，取出睪丸

6、用生理鹽水（0.9%的NaCl）洗去血污。2、放入裝有1ml 0.3%KCl液的小燒杯中剪碎，至溶液呈乳白色，使細(xì)胞分散。用銅網(wǎng)過(guò)濾到刻度離心管中，再加0.3%KCl液至4ml。3、37靜置30分鐘，進(jìn)行低滲處理。（整個(gè)過(guò)程控制在50分鐘內(nèi)）1000 r/min 離心8分鐘。棄上清液，加入2ml甲醇冰醋酸固定液（3：1），并用吸管至管底吹氣，輕輕打散細(xì)胞，固定8分鐘。4、再以8001000 r/min離心8分鐘。棄上清液，加1ml固定液，再制成細(xì)胞懸液，固定5分鐘。5、取潔凈的低溫預(yù)冷載玻片，距載片1015cm高度滴下23滴細(xì)胞懸液（使細(xì)胞分散），從載玻片一邊向另一邊輕輕吹氣，并同時(shí)輕輕敲打載

7、片，以使細(xì)胞均勻分布和促使染色體展開。6、將玻片放置在標(biāo)本盒中空氣干燥。染色體標(biāo)本的觀察：1、染色：倒置染色法用 Giemsa液染色20 30分鐘，細(xì)水沖洗玻片背面，擦去多余染液，干燥。2、鏡檢：低倍鏡下尋找分散良好、染色適中的位于分裂中期的分裂相，高倍鏡下觀察染色體形態(tài)并計(jì)數(shù)。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果31個(gè)38個(gè)40個(gè) 40個(gè)六、結(jié)果分析本次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果極為模糊，較為失敗。1、在自己制片中，沒(méi)有明顯的呈現(xiàn)出“V”或“U”形的染色體集合，有的是藍(lán)色背景上模糊的染色體棒狀，大多數(shù)細(xì)胞已經(jīng)成為碎片。分析原因可能有：（1）離心過(guò)程中，離心速度過(guò)快，導(dǎo)致細(xì)胞緊密的黏在一起，很難吹散。（2）在吹散細(xì)胞的過(guò)程中，力度太

8、大，導(dǎo)致細(xì)胞破裂，染色體流出。（3）在摔碎細(xì)胞時(shí)，滴加高度太小，細(xì)胞沒(méi)有摔碎。（4）在桌面上敲打細(xì)胞時(shí)，力度太小，仍有細(xì)胞沒(méi)有破裂。2、在觀察師兄師姐的裝片時(shí)，發(fā)現(xiàn)有的染色體數(shù)目多于40條，有的少于40條，分析其原因可能是： （1）染色體數(shù)目多于40 不同的細(xì)胞具體太近，染色體混合，導(dǎo)致數(shù)目過(guò)多； 細(xì)胞分布太密集，導(dǎo)致染色體與其他細(xì)胞的染色體上下重合，在顯微鏡下無(wú)法分辨清晰；（2）染色體數(shù)目少于40 吹打過(guò)程中，細(xì)胞輕微破裂，部分染色體流失； 摔打過(guò)程中，細(xì)胞也有可能發(fā)生部分染色體被摔離的現(xiàn)象； 在倒置染色、清洗染液的過(guò)程中，部分染色體被洗掉； 染色過(guò)程中，有的染色體沒(méi)有著色，無(wú)法觀察到。七、

9、注意事項(xiàng)1、自加入0.3%KCl始，至離心，整個(gè)過(guò)程應(yīng)注意控制時(shí)間，盡量保持在45-50min之內(nèi)。低滲處理是為了使細(xì)胞變大易于觀察，但低滲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使細(xì)胞破裂。2、破碎睪丸時(shí)，可先加入少量KCl，方便剪碎。破碎差不多后再加入剩下的KCl，先加入的KCL量一定要少，否則不易剪碎。3、操作過(guò)程中應(yīng)注意動(dòng)作不可過(guò)大，因?yàn)榈蜐B處理的細(xì)胞體積變大，更易破碎。4、滴片前應(yīng)盡量輕輕混勻懸液，使細(xì)胞分開。5、滴片時(shí)，應(yīng)保證玻片在低溫狀態(tài)下。6、采用倒置染色法，可以防止染液蒸發(fā)，同時(shí)使染色更加均勻。八、討論1、固定的目的是什么？（1）迅速防止細(xì)胞死亡后的變化，如自溶、腐敗等，盡量保持生長(zhǎng)狀態(tài)結(jié)構(gòu)。（2）使細(xì)胞

10、中的蛋白質(zhì)、脂肪等成分轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，以保持生前的形態(tài)； （3）使組織內(nèi)各種物質(zhì)成分產(chǎn)生不同的折光率，便于觀察和鑒定；（4）使不同組織成分對(duì)燃料有不同的親和力。便于染色；（5）防止細(xì)胞過(guò)度收縮或膨脹，失去原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)。2、秋水仙素抑制細(xì)胞分裂的原理是什么？紡錘絲的作用是將分裂的染色體拉向細(xì)胞兩極，然后細(xì)胞中間自動(dòng)形成細(xì)胞板，最后變成兩個(gè)細(xì)胞。使用秋水仙素后，紡錘絲的合成被抑制，尤其是動(dòng)粒微管被破壞。在后期染色單體分裂后，沒(méi)有紡錘絲，不能被拉向細(xì)胞兩極，細(xì)胞就不分裂，停留在分裂中期階段。 九、拓展1、染色體相關(guān)疾病 （1）21三體綜合征（又稱先天愚型或唐氏綜合征）患者核型多數(shù)為47。主要臨床

11、特征是智力低下，發(fā)育遲緩，寬眼距，外眥上斜，內(nèi)眥贅皮，上腭弓高聳，常張口弄舌，掌紋呈通貫手和軸三叉夾角大于65，拇趾球區(qū)脛側(cè)弓狀紋，某些患者伴有先天性心臟病。（2）特納氏綜合癥（Turner）常見(jiàn)的女性性染色體異常疾病。常見(jiàn)的核型是45+X，少數(shù)是嵌合體，出生率1/25001/5000。身材矮小，原發(fā)性閉經(jīng)，性幼稚，蹼頸，后發(fā)際低，寬乳距，肘外翻是本病的主要臨床特征。（3）克氏綜合征（Klinefelter Syndrome）常見(jiàn)的男性性染色體異常疾病，典型的核型為47+XXY。表型特征有睪丸發(fā)育不全。身材修長(zhǎng)，乃足跟至趾骨間的距離增長(zhǎng)所致。男子乳腺發(fā)育、陰毛呈女性型分布，陰莖及睪丸均小。嚴(yán)重

12、者伴有智力遲鈍、隱睪及尿道下裂等。本病發(fā)生率較高，在新生活嬰中的發(fā)生率是1.42.9%，是男性不育癥中常見(jiàn)的一種。（4）愛(ài)德華綜合征Edwards染色體異常為18三體。表型特征有智力低下、小頭、前額窄、枕部突、小頜且張口范圍小，腭弓高窄、低位耳、腎畸形、肌張力增高及手緊握等。（5）帕陶綜合征染色體異常為13三體。表型特征中有中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育缺陷，呈前腦無(wú)裂畸形。前額小呈斜坡樣，頭皮后頂部常有缺損。視網(wǎng)膜發(fā)育不良，切片鏡下觀察可見(jiàn)菊形團(tuán)形成。嚴(yán)重智力低下，唇裂及腭裂、多指等。中性粒細(xì)胞核上有過(guò)多的突起。（6）貓叫綜合征（5P-綜合征）染色體異常為5號(hào)染色體短臂部分或全部缺失。表型特征有：嬰兒時(shí)期

13、哭聲似貓叫，因而得名，可有喉器小和會(huì)厭小等喉部發(fā)育異常。嚴(yán)重智力低下，小頭、圓形臉、眼距寬、眼裂下斜、耳位低、內(nèi)眥贅皮，貫手等多種畸形，約一半患者有先天性心臟病，智力低下，生活能力差，常早亡。4P-綜合征類似5P-綜合征，但常常更為加重，還可呈尿道下裂，腭裂、嚴(yán)重的精神以及運(yùn)動(dòng)障礙，癲癇發(fā)作等，屬少見(jiàn)病例。（7）費(fèi)城染色體（Ph''）因首見(jiàn)于美國(guó)費(fèi)城（Philadelphia）而命名。系其22號(hào)染色體部分長(zhǎng)臂接到9號(hào)染色體長(zhǎng)臂的一種易位。為慢性粒細(xì)胞白血病可見(jiàn)到的特殊的染色體異常，但在其他少數(shù)急性白血病中偶可見(jiàn)到。這也是惡性細(xì)胞染色體變異中唯一已被公認(rèn)確實(shí)具有恒定變化的染色體變

14、異。目前，針對(duì)多種染色體疾病的醫(yī)療手段還不完善，但是染色體疾病作為一種明顯的遺傳性疾病，可以通過(guò)優(yōu)生手段進(jìn)行預(yù)防。比如：對(duì)娩出過(guò)染色體病患兒的經(jīng)產(chǎn)婦及反復(fù)發(fā)生自然流產(chǎn)和死產(chǎn)的孕婦施行宮內(nèi)診斷；注意環(huán)境保護(hù)，加強(qiáng)職業(yè)性防護(hù)監(jiān)測(cè)；開展遺傳咨詢、積極推行優(yōu)生法，做好婚姻和生育的醫(yī)藥遺傳指導(dǎo)，避免，提倡適齡生育和計(jì)劃生育等。2、植物細(xì)胞染色體觀察方法 （1）實(shí)驗(yàn)植物和試劑 大蒜根尖、 0.02%秋水仙素；改良苯酚品紅染液；卡諾氏固定液，1N鹽酸；70%酒精；95乙醇；85乙醇；蒸餾水 （2）實(shí)驗(yàn)方法和步驟 取材 先將大蒜浸泡若干小時(shí)，然后轉(zhuǎn)入一個(gè)墊有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，置25恒溫培養(yǎng)箱中萌發(fā)，待幼根長(zhǎng)

15、至12cm時(shí)，于上午911時(shí)剪下根尖。 預(yù)處理 將剪下的根尖放進(jìn)裝有0.02%秋水仙素溶液的燒杯中，浸泡處理34小時(shí)。固定 將經(jīng)過(guò)預(yù)處理或沒(méi)有預(yù)處理的材料，放到卡諾氏固定液中固定 （固定液的量約為材料的10倍，要求一個(gè)容器中所裝的材料不能太多，溫度不能太高）。固定224h后分別在95 和85乙醇中各30min ，再轉(zhuǎn)入70%酒精中，于4冰箱內(nèi)保存，保存時(shí)間最好不超過(guò)二個(gè)月。 去壁解離 取固定好的各種植物根尖，倒去固定液，用蒸餾水漂洗23次，放入1N HCl溶液中60水解812min，再用蒸餾水洗凈。適度的水解分離使材料呈白色微透明，狀似豆腐，以解剖針能輕輕壓碎為好。 后低滲 用吸管小心吸去解離液，用蒸餾水慢慢沖洗35次，最后停留在蒸餾水中浸泡2030min左右。 染色 將根尖放在載玻片中央，用刀片將根冠和伸長(zhǎng)區(qū)切除，只留乳白色的分生區(qū)，用鑷子或解剖針將材料輕輕搗碎。滴上一滴改良苯