生物技術(shù)大實驗實驗指導(dǎo)書

1、生物技術(shù)教學(xué)部常平安舒坤賢謝永芳編重慶郵電學(xué)院生物信息學(xué)院2005年3月1日前言生物技術(shù)大實驗是為生物技術(shù)專業(yè)本科高年級學(xué)生開設(shè)的綜合實驗課程，是在普通生物學(xué)實驗、生物化學(xué)實驗、微生物實驗、細(xì)胞生物學(xué)和遺傳學(xué)實驗的基礎(chǔ)上的綜合實驗課程。該實驗課程偏重于分子生物學(xué)實驗教學(xué)，通過此實驗課程，學(xué)生不僅學(xué)習(xí)到最基本的分子生物學(xué)技術(shù)，而且學(xué)習(xí)到前沿的生物技術(shù)。分子生物學(xué)實驗技術(shù)突飛猛進，日新月異。分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，在20世紀(jì)下半葉對生命科學(xué)的進步產(chǎn)生了舉世公認(rèn)的巨大推動作用，而且對人們的生活和整個社會的發(fā)展亦產(chǎn)生了巨大的沖擊和影響。分子生物學(xué)技術(shù)已廣泛滲透和應(yīng)用到生物學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)、微生物學(xué)

2、、進化學(xué)、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)、發(fā)育學(xué)、病毒學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、生藥學(xué)、法醫(yī)學(xué)等與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)有關(guān)的研究領(lǐng)域。21世紀(jì)將更是分子生物學(xué)技術(shù)快速發(fā)展的時期，由此引起的生物技術(shù)革命并將更加深刻地影響社會的發(fā)展。學(xué)生基本技能和動手能力的培養(yǎng)都離不開實驗室，離不開實驗課上的訓(xùn)練，很多理論上的原理都需要到實驗課上去驗證，很多理論上的知識都需要到實驗課上去實踐。而實驗課教材或?qū)嶒炛笇?dǎo)書是開好實驗課的基本條件之一。雖然目前的分子生物學(xué)實驗教材版本眾多，但針對本科生的生物技術(shù)大實驗教材尚無出版。為了加強本學(xué)科的教材建設(shè)，促進本學(xué)科實驗課的開設(shè)，我們參考了國內(nèi)外最新的有關(guān)分子生物學(xué)實驗技術(shù)的專著，根據(jù)我校學(xué)

3、生的特點及我們自己現(xiàn)有的基礎(chǔ)和條件，特選擇了部分實驗內(nèi)容，并結(jié)合我們的經(jīng)驗與體會，匯編成了生物技術(shù)大實驗實驗指導(dǎo)書，以供參考。在使用過程中，可根據(jù)不同的層次適當(dāng)增減。同時，對于新近產(chǎn)生和應(yīng)用前景廣闊的生物芯片技術(shù)、RNAi技術(shù)和蛋白質(zhì)組研究等，限于我們目前的條件，只能作些演示或作為動態(tài)給以介紹，條件一經(jīng)成熟，即行開設(shè)。由于分子生物學(xué)技術(shù)和生物技術(shù)的快速發(fā)展，加之我們是第一次這樣系統(tǒng)地給學(xué)生開設(shè)生物技術(shù)大試驗課程，許多工作還處于不斷探索的過程中，難免有不妥和疏漏之處，懇切期望讀者提出寶貴意見，以利不斷修正完善。編者2005年3月目錄實驗一質(zhì)粒的提取和純化. 3實驗二質(zhì)粒DNA的電泳和純度檢測.6

4、實驗三PCR產(chǎn)物的TA克隆.9實驗四感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備.12實驗五重組DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌.12實驗六PCR擴增基因特異片段.15實驗七 DNA片段的回收及純化.19實驗八PCR法快速鑒定重組載體.22實驗九限制性內(nèi)切酶酶切法鑒定重組質(zhì)粒.24實驗十外源基因在大腸桿菌中的表達及其檢測.28實驗十一 RNA的提取及其純度檢測32實驗十二逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）擴增基因特異片段.35實驗十三 DNA探針制備.38實驗十四 Southern印跡雜交41實驗十五 Northern印跡雜交44實驗十六熒光原位雜交（FISH）技術(shù)47實驗十七外源基因在哺乳細(xì)胞中的表達及其檢測.50實驗十八生物芯片

5、技術(shù).53實驗十九RNAi技術(shù)56實驗二十蛋白質(zhì)組技術(shù).58附錄基因工程基本技術(shù)路線.60實驗一質(zhì)粒的提取和純化實驗?zāi)康模毫私鈮A裂解法制備質(zhì)粒的原理，掌握質(zhì)粒的小量制備方法。實驗原理：質(zhì)粒DNA的抽提是基因工程操作中最常用與最基本的技術(shù)，現(xiàn)已有多種成熟的方案可供選擇。最常用的有利用堿性條件下質(zhì)粒DNA與染色體DNA變復(fù)性的不同進行分離的堿法；利用酸性、低離子強度時超螺旋在水相中，開環(huán)、線型分子在酚相中進行分離的酸酚法；利用羥基磷灰石在特定的條件下(8molL尿素，0.24molL磷酸緩沖液pH6.8)只吸附雙鏈DNA的羥基磷灰石法(在上述條件下染色體DNA均成單鏈，質(zhì)粒DNA保持雙鏈)等。本實

6、驗選做的是堿法。1. 裂解細(xì)胞裂解細(xì)胞是指通過溶菌酶、去污劑等試劑破裂細(xì)胞壁與膜的過程。對于不同的菌要選用不同的方法，通常有煮沸法、非離子型去污劑法、堿性SDS法(簡稱堿法)等。三種方法比較而言，非離子型去污劑法較溫和，適用于抽提10kb左右的質(zhì)粒；而煮沸法與堿性SDS法相對較劇烈，只能抽提小于10kb的質(zhì)粒。常用的離子型去污劑是SDS、非離子型去污劑有TritonX-100等。2分離即將質(zhì)粒DNA和染色體DNA分離。堿法的分離原理如下：大腸桿菌的染色體約有4700kb長，在處理細(xì)胞過程中都斷裂成不同長度的雙鏈DNA片段。當(dāng)溶液的pH調(diào)到大于12時雙鏈DNA中的氫鍵被破壞，于是染色體DNA的雙

7、鏈分離成單鏈；而超螺旋狀態(tài)的質(zhì)粒DNA僅僅是氫鍵被破壞，并只發(fā)生部分雙鏈解離成單鏈的變化。再當(dāng)pH調(diào)回中性時單鏈DNA互相纏繞且與蛋白質(zhì)結(jié)合生成網(wǎng)絡(luò)狀大分子，而超螺旋的質(zhì)粒發(fā)生復(fù)性反應(yīng)后仍是小分子，通過離心的方法很容易將二者分開，達到分離的目的。3純化細(xì)胞裂解液中的雜質(zhì)除了染色體DNA外還有各種細(xì)胞壁、膜碎片、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)類物質(zhì)及RNA。純化的步驟就是有針對性地將它們?nèi)コNA可用牛胰Rnase A分解除去。蛋白質(zhì)可通過酚、酚氯仿、氯仿異戊醇，使蛋白質(zhì)變性劑而除去，同時，氯仿有強烈的溶脂傾向，對于在除去蛋白質(zhì)的同時去除脂質(zhì)類雜質(zhì)很有好處。氯仿還能將微量的、溶于DNA水溶液的酚抽提掉，而微量的

8、酚對于以后的酶切、轉(zhuǎn)化等過程都會產(chǎn)生不利影響。氯仿異戊醇的蛋白質(zhì)變性能力較弱，主要用于含酚試劑處理后的抽提。正確的去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)的過程應(yīng)該是酚一酚+氯仿（(1:1)）一氯仿（或氯仿異戊醇24:1)，處理，根據(jù)實驗情況也可考慮省略第一或第二步，但切記不可將氯仿（氯仿異戊醇）的處理步驟省略掉。抽提過程完成后的水溶液中仍有痕量的酚、氯仿等，可用乙醇沉淀的方法將它們除去。用無水乙醇沉淀的特點是能將DNA進行濃縮，且同時也更換了整個緩沖系統(tǒng)，但DNA也有一定的損失。實驗內(nèi)容：試劑1.LB培養(yǎng)液(1L)細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨 10g細(xì)菌培養(yǎng)用酵母粉 5gNaCl 10g用10molLNaOH調(diào)至pH7.0，高壓

9、蒸氣滅菌, 4貯存.2溶液，可成批配置，滅菌后4貯存。葡萄糖50mmolLTris-C1(pH8.0)25mmolLEDTA10mmolL3溶液(新鮮配制)NaOH0.2molL SDS14溶液5molL KAc60ml冰醋酸11.5ml水28.5ml配制好的溶液含3molL鉀鹽，5molL 醋酸(pH4.8)卡那霉素(Kana): 50mg/ml, 過濾除菌.5重蒸酚市售苯酚蒸餾純化(收集179181之間的酚)后，用TE飽和，使水相的pH在7.5以上，4保存。6氯仿異戊醇(24:1)7無水乙醇8RNaseA(10mgml)93molL NaAc(pH5.2)10TE 10mmolL Tris

10、-C1(pH8.0) 1mmoIL EDTA材料含有質(zhì)粒(pNTE-EGFP, pEGFPN3)的大腸桿菌DH5a.操作步驟 1挑取瓊脂培養(yǎng)板上的含有pNTE-EGFP, pEGFPN3質(zhì)粒的單菌落，接種至5ml LB培養(yǎng)液(含Kana 50gm1)，37振蕩培養(yǎng)過夜。 2取出l培養(yǎng)液至1.5ml離心管中，12 000rmin離心2min，棄上清。 3將細(xì)菌沉淀重懸于100l預(yù)冷的溶液工中，強烈振蕩混勻。 4加入200l溶液，蓋嚴(yán)管蓋，輕輕顛倒混勻5次，冰浴5min。 5加入150l預(yù)冷的溶液，溫和振蕩10s，冰浴5min。 612 000rmin 室溫離心5min，取上清至一個新的無菌的1.

11、5m1Eppendorf管中。 7加入等體積酚氯仿(1:1)，振蕩混勻，12 000rmin離心2min，上清轉(zhuǎn)移至另一個Eppendorf管中。【注意】酚具有腐蝕性，操作時小心。 8加人等體積氯仿，振蕩混勻，12 000rmin離心2min，上清轉(zhuǎn)移至另一個Eppendorf管中。 10加入2倍體積預(yù)冷無水乙醇-20沉淀10min。 1112 000rmin離心10min，去上清，沉淀用70乙醇洗滌一次，空氣中晾干。 12加入20l TE溶解質(zhì)粒DNA，加入RNaseA，終濃度20gm1 37水浴0.5h。13 經(jīng)0.7瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后觀察抽提結(jié)果?！咀⒁狻縀B為致癌物，操作時一定

12、要戴乳膠或一次性手套。 14將該管質(zhì)粒保存于-20備用。注意事項1該實驗成功的標(biāo)志是把染色體DNA、蛋白質(zhì)與RNA去除干凈，獲得一定得率的質(zhì)粒DNA。去掉染色體DNA最為重要，也較困難，因為在全部提取過程中，只有一次機會去除染色體DNA，其關(guān)鍵步驟是加入溶液與溶液時，控制變性與復(fù)性操作時機，既要使試劑與染色體DNA充分作用使之變性，又要使染色體DNA不斷裂解成小片段，從而能與質(zhì)粒DNA相分離。這就要求試劑與溶菌液充分搖勻，搖動時用力適當(dāng)，一般來說當(dāng)溶液加入時可用力振蕩幾次，因為此時細(xì)菌還沒有與堿和SDS作用，染色體DNA尚未釋放，不必?fù)?dān)心其分子斷裂，加入SDS后，則要注意不能過分用力振蕩，溫和

13、混勻,但又必須讓它反應(yīng)充分。加入溶液II混勻之后,一定在冰上放置,不要搖動,對于溶液溶液III,同樣處理! 2. 加入溶液I之前,注意將離心管倒扣過來,將培養(yǎng)基完全流出. 2加乙醇沉淀DNA時，要把離心管加蓋倒翻搖動45次，注意觀察水相與乙醇之間沒有分層現(xiàn)象之后，才可以放在冰箱中去沉淀DNA,以獲得更多的DNA。 3乙醇沉淀DNA離心后，要把離心管四周的上清液抽干或自然揮發(fā)(可將離心管倒置于濾紙上以盡量讓管內(nèi)液體流出)。否則，用TE緩沖液溶解DNA時，既困難又不完全。 4為了得到純凈的DNA樣品和清晰的電泳條帶，加入1l RNA酶，將管置50水浴箱內(nèi)30min，消化RNA。 6抽提產(chǎn)物經(jīng)電泳分

14、離、EB染色后，在紫外線燈下可觀察到三個條帶，自前往后分別為：超螺旋、線性及開環(huán)質(zhì)粒DNA?！舅伎碱}】堿法提取質(zhì)粒的原理是什么？【課外閱讀】高純度質(zhì)粒DNA的提取,參閱Qiagen公司說明書,網(wǎng)站實驗二質(zhì)粒DNA的電泳和純度檢測實驗?zāi)康模赫莆誅NA瓊脂糖電泳技術(shù)，了解紫外分光光度法測定DNA濃度和純度的原理。實驗原理：帶電荷的物質(zhì)在電場中的趨向運動稱為電泳。其中，凝膠電泳由于其操作簡單、快速、靈敏等優(yōu)點，使它成為分離、鑒定和提純核酸的首選標(biāo)準(zhǔn)方法。與蛋白質(zhì)分子類似，核酸分子也是兩性解離分子。在時，堿基上的氨基基團解離，而三個磷酸基團中只有第一個磷酸解離，整個分子帶正電荷，在電場中向負(fù)極泳動；在

15、pH值為時，堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負(fù)電荷，向正極移動。不同大小和構(gòu)象的核酸分子的電荷密度大致相同，在自由泳動時，各核酸分子的遷移率區(qū)別很小，難以分開。所以采用適應(yīng)濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持物，發(fā)揮分子篩的功能，使得分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子泳動率出現(xiàn)較大差異，達到分離的目的。值得注意的是，等長度的單鏈DNA和雙鏈DNA在中性或堿性凝膠中的遷移率大致相等。 1影響泳動的四大因素 (1)影響泳動的首要因素是電泳樣品的物理性質(zhì)：包括電荷多少、分子大小、顆粒形狀和空間結(jié)構(gòu)。一般來說顆粒帶電荷的密度愈大，泳動速率愈快；顆粒物理形狀愈大，與支持物介質(zhì)摩擦力越大，泳動速度越小。即泳動率與

16、顆粒的分子大小，介質(zhì)粘度成反比；與顆粒所帶電荷成正比。在檢測未知DNA分子量時，DNA分子的空間構(gòu)型不同，即使相同的分子量其遷移率也不同。如質(zhì)粒DNA存在閉環(huán)(型，CC)，單鏈開環(huán)(型，OC)和線性(型，L)。三者之間的遷移速率，一般為型>型>型，但是有時也會出現(xiàn)相反的情況，因為與瓊脂糖濃度、電流強度、離子強度及溴乙錠染料含量有關(guān)。當(dāng)膠濃度較高或電場強度較大時，型DNA與型DNA互換位置，而型DNA總是遷移最慢。 (2)支持物介質(zhì)：DNA的凝膠電泳常使用兩種支持材料：瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠。通過這兩種介質(zhì)的濃度變化調(diào)整所形成凝膠的分子篩網(wǎng)孔大小，分離不同分子量的核酸片段。瓊脂糖凝膠

17、的孔徑大，可以分離長度為100bp至近60kb的DNA分子；聚丙烯酰胺凝膠的孔徑小，可分離小片段(5500bp)DNA，效果最好。因此，選用不同的凝膠種類和濃度可以分辨大小不同的DNA片段。(3)電場強度：電泳場兩極間單位支持物長度的電壓降即為電場強度或電壓梯度。電場強度愈大，帶電顆粒的泳動速率愈快，但凝膠的有效分離范圍隨電壓的增大而減小。在低電壓時，線性DNA分子的泳動率與電壓成正比。一般凝膠電泳的電場強度不超過5Vcm；對于大分子量真核基因組DNA片段的電泳常采用cm電泳過夜，以取得較好的分辨率和整齊的帶型。電壓10002000V，電場強度20600Vcm的電泳為高壓電泳，必須用聚丙烯酰胺

18、做介質(zhì)。(4)緩沖液離子強度：緩沖液是電泳場中的導(dǎo)體，它的種類、pH值、離子濃度直接影響電泳的效率。緩沖體系中，由于Cl的泳動速度比樣品分子快得多，易引起帶型不均一現(xiàn)象，所以常利用TAE、TBE和TPE三種緩沖體系。緩沖液的pH值直接影響DNA解離程度和電荷密度，緩沖液pH值與DNA樣品的等電點相距越遠，樣品所攜帶電荷量越多，泳動速度越快。DNA電泳緩沖液，常采用偏堿性或中性條件，使核酸分子帶負(fù)電荷，向正極泳動。緩沖液的離子強度與樣品泳動速度成反比，電泳的最適離子強度一般在之間。2指示劑電泳過程中，常使用一種有顏色的標(biāo)記物以指示樣品的遷移過程。核酸電泳常用的指示劑有是溴酚藍，溴酚藍呈藍紫色，分

19、子量為670Da，在不同濃度凝膠中，遷移速度基本相同，它的分子篩效應(yīng)小，近似于自由電泳，故被普遍用作指示劑。在，1，2的瓊脂糖凝膠中，溴酚藍的遷移率分別與1kb，和的雙鏈線性DNA片段大致相同。指示劑一般加在電泳上樣緩沖液中，為了使樣品能沉人膠孔，還要加入適量的蔗糖、聚蔗糖400或甘油以增加比重。3染色劑核酸需經(jīng)過染色才能顯示出帶型，最常用的是溴乙錠染色法。溴乙錠(ethidium bromide，EB)是一種熒光染料，這種扁平分子可以嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。EB-DNA復(fù)合物中的EB發(fā)出的熒光，比游離的凝膠中的EB本身發(fā)出的熒光強大10倍，因此不需要洗凈背景

20、就能清楚地觀察到核酸的電泳帶型。通常，可以在凝膠中加入終濃度為gm1的EB，這樣在電泳過程中可以隨時觀察核酸的遷移情況，這種方法適用于一般性的核酸監(jiān)測。也可以在電泳結(jié)束后用gm1的EB溶液染色10-15min后進行紫外觀察，由于EB在可見光下易分解，故應(yīng)存棕色瓶中于4條件下保存。注意：EB有潛在的致癌危險，操作時必須戴乳膠手套或一次性手套。實驗內(nèi)容：試劑(1)質(zhì)粒pNTE-EGFP。(2)瓊脂糖。(3)10mgml溴乙錠溶液。(4)DNA分子量參照物（marker）。(5)50×TAE電泳緩沖液。(6)10×溴酚藍上樣緩沖液。2器材(1)恒溫水浴(2)電泳槽(3)電泳儀(4

21、)微波爐(5)紫外線檢測儀(6)移液器；100-1000l， 10-100l操作步驟電泳(1) 稱取1.0 g瓊脂糖，加入100ml1×TAE電泳緩沖液中。(2) 加熱或沸水浴后使瓊脂糖溶解。(3) 凝膠冷至60左右，加入溴乙錠至終濃度為gm1。(4) 將瓊脂糖溶液倒人模具，凝膠厚度一般為，檢查有無氣泡。室溫下1530min后，瓊脂糖溶液完全凝固。(5) 連接電泳槽與電泳儀之間的電源線，正極為紅色，負(fù)極為黑色。(6) 取掉模具兩端的膠布，放入電泳槽，加樣孔在負(fù)極端。(7) 加入1×TAE電泳緩沖液至電泳槽中，液面高于膠面1mm，小心取出梳子。(8) 取5l實驗一制備的質(zhì)粒D

22、NA，在DNA樣品中加入110的上樣緩沖液并混勻。(9) 用移液器將DNA樣品加入梳孔中。(10)接通電源，DNA樣品往正極移動。電壓選擇為35Vcm。注意：長度以兩個電極之間的距離計算。(11)根據(jù)指示劑遷移的位置，判斷是否終止電泳；切斷電源后，含EB的凝膠可以直接于紫外線燈下觀察結(jié)果或拍照記錄。濃度和純度分析：1 取10l DNA 用TE緩沖液稀釋至1ml，混勻。以無DNA的TE為空白，測定樣品在260nm和280nm波長下的光密度吸收值，每個樣品重復(fù)3次，取3次結(jié)果的平均值作為最終結(jié)果。2 換算出OD260/OD280的比值，較純的DNA，該值在之間。3 根據(jù)雙鏈DNA 1 OD260n

23、m=50mg，計算出樣品DNA的濃度，計算公式為所測的OD260nm×50/10（mg/ml）附錄一、核酸換算數(shù)據(jù)dsDNA´106 Dalton1 OD260nm=50mgssDNA´106 Dalton1 OD260nm=40mgRNA´106 Dalton1 OD260nm=40mg附錄二、瓊脂糖凝膠濃度與線性DNA的最適分辨范圍瓊脂糖凝膠濃度線性DNA的最適分辨范圍（bp）0.5%0.7%1.0%1.2%1.5%2.0%1，000-30,000800-12,000500-1,000400-7,000200-3,00050-2,000實驗三PCR產(chǎn)

24、物的TA克隆實驗?zāi)康模赫莆胀ㄟ^TA連接克隆PCR產(chǎn)物的原理和方法。實驗原理：通過PCR的方法擴增目的基因片斷的過程中，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，獲得的目的片斷通常需要通過TA克隆的方法，重組到T-載體中，通過序列測定清楚DNA序列。由于在PCR過程中，使用的DNA聚合酶不同，往往分為2種情況：（1）使用不同的Taq酶，在PCR擴增循環(huán)結(jié)束后，加上72 10分鐘一個過程，Taq酶可以在擴增產(chǎn)物的3末端加上A，因此PCR產(chǎn)物回收純化后可以和T載體直接連接。（2）使用高保真的DNA聚合酶，如pfu酶，由于其不能在擴增產(chǎn)物的3末端加上A，得到的DNA序列為鈍端，因此，需要在回收純化后進行加A

25、的過程，通常是以PCR回收產(chǎn)物為模板，加上一定量的普通Taq酶和反應(yīng)液，加入dATP（或dNTP）， 72 10分鐘，然后將加A產(chǎn)物直接用于TA連接。下圖是大連寶生物公司的T載體及其說明書。pMD 18-T Vector是一種高效克隆PCR產(chǎn)物 (TA Cloning) 的專用載體。它是TaKaRa獨自研究開發(fā)，由pUC18載體改建而成的。在pUC18載體的多克隆位點處的XbaI和SalI識別位點之間插入了EcoR V識別位點，用EcoR V進行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)的3'端添加“T”而成。因大部分耐熱性DNA聚合酶反應(yīng)時都有在PCR產(chǎn)物的3'末端添加一個“A”的特性,所以使用本

26、制品可大大提高PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率。本制品是以最為常用的pUC18載體為基礎(chǔ)研制而成，所以它具有同pUC18載體完全相同的功能。此外，本制品中的高效連接液Ligation Solution I可以在極短的時間內(nèi) (30分鐘-1小時) 完成連接反應(yīng)，大大地方便了實驗操作。另外，本制品中還含有Control Insert (500 bp)，可用于Control反應(yīng)。用途：克隆PCR產(chǎn)物。對克隆后的PCR產(chǎn)物用M13 Primers進行DNA測序。互補和藍白篩選的原理：許多載體（包括pMD18-T）都具有一段大腸桿菌半乳糖苷酶的啟動子和編碼其N端氨基酸（肽鏈）的片斷基因。宿主具有編碼半乳糖苷酶

27、的C端基因。當(dāng)二者產(chǎn)物組合在一起，就具有活性酶的產(chǎn)生，此現(xiàn)象稱為互補。由互補形成的具有功能活性的半乳糖苷酶,可以用X-gal顯色測定出來，它能將無色的化合物Xgal切割成半乳糖和藍色底物。當(dāng)外源DNA片斷插入到多克隆位點后，就會破壞肽鏈的閱讀框，從而不能合成與受體菌內(nèi)的半乳糖苷酶相互補的活性肽鏈，而導(dǎo)致不能形成功能活性的半乳糖苷酶，因此含有重組質(zhì)粒載體的克隆往往是白色的，而沒有插入外源片斷的則是藍色的。實驗內(nèi)容：試劑pMD 18-T Vector試劑盒，或自己PCR擴增回收純化的片段，T4DNA鏈接酶。IPTG，X-gal，LB培養(yǎng)基等。 200mg/ml的IPTG 過濾除菌 20mg/ml的

28、Xgal 溶于二甲基甲酰胺，避光保存。操作步驟1. 在微型離心管中制備下述連接反應(yīng)液，全量為10 ml。*取0.5 ml進行實驗也可得到滿意的結(jié)果。實際操作時，可按實驗需要使用適量的T載體。2. 16反應(yīng)30分鐘 (過夜反應(yīng)也不影響連接效率)。3. 全量 (10ml) 轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞 (100 ml)中。4. 在含有40ml 20mg/ml的X-Gal、4ml 200mg/ml的IPTG、50-100mg/ml Amp的L-瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落。計數(shù)白色、藍色菌落。5. 挑選白色菌落，使用PCR法確認(rèn)T載體中插入片段的長度大小。注意事項：1. Ligation Solu

29、tion I請于冰中融解。2. 在進行克隆時，Vector DNA和Insert DNA的摩爾比一般為：1: 2 10。在本制品中，pMD18-T Vector 1 ml (50 ng) 的摩爾數(shù)約為0.03 pmol，Control Insert DNA 1ml (50 ng) 的摩爾數(shù)約為0.15 pmol。3. 克隆時使用的Insert DNA片段 (PCR 產(chǎn)物) 盡量進行切膠回收純化，PCR產(chǎn)物中的短片段DNA(甚至是電泳也無法確認(rèn)的非特異性小片段)、殘存引物等雜質(zhì)都會影響TA克隆的效率。4. 按照本實驗操作進行連接后，直接進行轉(zhuǎn)化時的連接液不要超過20 ml。當(dāng)進行轉(zhuǎn)化的DNA用量

30、較大或準(zhǔn)備進行電轉(zhuǎn)化時，需對連接液進行乙醇沉淀，純化DNA后再進行轉(zhuǎn)化。5. 連接反應(yīng)請在16下進行，溫度升高 (>26) 較難形成環(huán)狀DNA。6. 連接效率偏低時，可適當(dāng)延長連接時間至數(shù)小時。7. 感受態(tài)細(xì)胞可使用適合于pUC系列載體的感受態(tài)細(xì)胞，如：JM109，DH5a等。相關(guān)問題怎樣提高pMD18-T Vector的克隆效率?1. 純化PCR產(chǎn)物。切膠回收的PCR片段最好2. 除去殘存的引物等雜質(zhì)。3. DNA片段的立體結(jié)構(gòu)、DNA片段的長短都會影響克隆效率。一般情況下，大片段DNA的克隆效率（連接效率與轉(zhuǎn)化效率）小于短片段DNA，在使用大片段DNA的連接液進行轉(zhuǎn)化時，建議采用電轉(zhuǎn)

31、化方法。PCR產(chǎn)物難以插入載體，為什么?1. 確認(rèn)PCR反應(yīng)使用的DNA聚合酶在PCR產(chǎn)物的3'端是否附加了"A"。有些DNA聚合酶擴增的PCR產(chǎn)物是平端, 如使用本公司的Pyrobest DNA聚合酶 (TaKaRa Code: DR005) 等擴增得到的PCR產(chǎn)物不能直接用于TA克??；PCR產(chǎn)物保存時間不要過長, 長時間保存的PCR產(chǎn)物會脫去末端的"A"堿基。2. PCR產(chǎn)物中短片段雜質(zhì)DNA太多，這時應(yīng)切膠回收純化DNA片段，回收時PCR產(chǎn)物不要在紫外線下暴露時間過長。3. 確認(rèn)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率，使用的感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率最好大于108

32、cfu/mg pUC118 DNA。4. 確認(rèn)Ligation Solution I的連接效率是否降低，多次反復(fù)凍融會降低的Ligation Solution I連接效率。5. 確認(rèn)抗生素的濃度是否過大。6. 最好使用新配制的平板培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)化后的菌落全為藍色 (或淡藍色)，為什么?插入的PCR片段較短（小于500 bp)，且插入片段沒有影響lacZ基因的讀框時，平板培養(yǎng)基上出現(xiàn)的菌落有可能呈現(xiàn)藍色。插入的PCR產(chǎn)物進行測序時，可使用何種引物?本制品的載體來源于pUC18載體。因此，用于pUC18載體測序的引物都可以使用。實驗四感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備實驗五重組DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌實驗?zāi)康恼莆誄a

33、Cl2制備感受態(tài)大腸桿菌的方法和化學(xué)轉(zhuǎn)化法。實驗原理通過冰冷的CaCl2溶液處理大腸桿菌，細(xì)菌處于0、CaCl2低滲液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，使之處于短暫的“感受態(tài)”，在這期間，細(xì)菌能夠攝取各種不同的外源DNA片段或基因，使受體細(xì)胞獲得供體基因的某些性狀，質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化是重組DNA技術(shù)中重要的一環(huán)。常用的轉(zhuǎn)化方法1化學(xué)法轉(zhuǎn)化包括了CaCl2、氯化鈣氯化銣、MgCl2等方法，所有化學(xué)法轉(zhuǎn)化均需制備感受態(tài)細(xì)胞。通過化學(xué)方法，可人工誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞進入感受態(tài)，最經(jīng)典的是CaCl2法（1972年），其原理是細(xì)菌處于0、CaCl2低滲液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA與鈣離子結(jié)合形成抗DNase的

34、羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42短時間熱沖擊處理，促進細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物；通過在豐富培養(yǎng)基中恢復(fù)1h左右，球狀細(xì)胞復(fù)原，轉(zhuǎn)化子中的抗性基因得以表達；隨后將菌液涂布于含抗生素的選擇性培養(yǎng)基平板上，轉(zhuǎn)化子可分裂、增殖，形成菌落。轉(zhuǎn)化效率是衡量菌體處于感受態(tài)的細(xì)胞多少的指標(biāo)，一般定義為1g環(huán)狀質(zhì)粒DNA在感受態(tài)細(xì)胞過量的情況下產(chǎn)生轉(zhuǎn)化子的個數(shù)。Ca2+處理的感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化效率可達105106個轉(zhuǎn)化子g環(huán)化DNA。影響轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵因素：生長時期：實驗發(fā)現(xiàn)在對數(shù)中期的大腸桿菌易生成感受態(tài)。轉(zhuǎn)化時菌濃度應(yīng)控制在不超過107ml。CaCl2法0放置時間的影響：細(xì)菌經(jīng)0CaCl2處理后轉(zhuǎn)化率隨時間

35、的推移而增加，24h達到最高，之后轉(zhuǎn)化率逐漸下降?；衔锛盁o機離子的影響：在Ca2+的基礎(chǔ)上，聯(lián)合其他二價金屬離子(如Mn2+，CO2+)、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，可使轉(zhuǎn)化率提高1001000倍。質(zhì)粒大小、構(gòu)型的影響：通過構(gòu)建相同復(fù)制起點的不同大小質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)化時發(fā)現(xiàn)，從2kb到32kb的轉(zhuǎn)化效率上升，此后到66kb轉(zhuǎn)化效率線性下降。同時，開環(huán)狀質(zhì)粒只有超螺旋質(zhì)粒轉(zhuǎn)化率的75，線型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率更要低1001000倍，線型轉(zhuǎn)化率低是因菌體中核酸外切酶將進入的線型DNA降解的原因。菌株基因型recA+與recA的影響：recA基因是rec系列中最主要的基因，編碼同源重組蛋白。考慮到質(zhì)粒DNA

36、在recA+菌中存在與細(xì)菌染色體DNA整合的可能，因而，通常在轉(zhuǎn)化實驗中都選用recA菌株作為宿主菌。實驗內(nèi)容試劑與材料 1菌株 DH5a等。 2重組質(zhì)粒 pNTE-GFP。 3100mmolL CaCl2，用純水配制。 4氨芐青霉素(100mgm1)，用無菌水配制并過濾m)除菌，濾液于-20冰箱中保存。 5LB平板 LB培養(yǎng)液中加入瓊脂粉，高壓消毒(15磅20min)，稍冷卻后鋪平板。 6含抗生素LB平板配方同上，高壓消毒后，冷卻至65左右，加入氨芐青霉素，終濃度為50100gm1培養(yǎng)液，加入抗生素后立即倒平板。 7培養(yǎng)皿及15ml離心管等。操作步驟1. 將DH5a細(xì)菌接種在LB平板上，37

37、培養(yǎng)過夜。2從LB平板上挑取DH5a單個菌落接種在5ml LB培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過夜。 3次日取上述菌液，接種于50 ml新鮮LB培養(yǎng)液中，37振蕩培養(yǎng)；410min,然后4 4000rmin離心8min，棄去上清液。 4. 沉淀的菌體懸浮于L冷CaCl2內(nèi)，冰浴中放置30min，44000rmin離心8 min。 5沉淀的菌體再懸浮于L冷CaCl2溶液，并置于冰浴中。（感受態(tài)細(xì)菌可以在12.5%的無菌甘油-70保存）6取3支15ml離心管，按下表加試劑和操作：試劑管1管2管3連接產(chǎn)物10l質(zhì)粒(100ng1)1lH2O9l10l感受態(tài)細(xì)胞200l200l200l 7冰浴中放置30min。

38、 842熱沖擊90s后，立即放入冰浴,放置25分鐘。 9每管加入新鮮LB培養(yǎng)液。 1037劇烈振搖培養(yǎng)60min。（轉(zhuǎn)速不低于225RPM） 115000rmin離心1min, 棄去上清液保留培養(yǎng)基100200l，充分懸浮細(xì)菌，分別涂布于含氨芐青霉素的LB平板，加入的菌液用玻棒均勻推開。以上操作均需在無菌條件下進行。平板在37溫箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。次日觀察各平板上菌落生長情況，并算出轉(zhuǎn)化率即每微克DNA能轉(zhuǎn)化多少個細(xì)菌。注意事項 1致敏緩沖液中試劑的純度與濃度對轉(zhuǎn)化率影響很大，試劑必須為分析純，同時，致敏緩沖液最好避光貯存于40C。 2制備感受態(tài)細(xì)胞的全部操作均須于冰浴低溫操作，同時注意無菌操作，防

39、止感受態(tài)細(xì)胞受雜菌污染。342熱處理時間很關(guān)鍵，轉(zhuǎn)移速度要快，且溫度要準(zhǔn)確，同時注意熱處理過程中離心管不要搖動。4菌液涂皿操作時，應(yīng)避免反復(fù)來回涂布，因為感受態(tài)細(xì)菌的細(xì)胞壁有了變化，過多的機械擠壓涂布會使細(xì)胞破裂，影響轉(zhuǎn)化率。5實驗用的玻璃器皿、微量吸管及Eppendorf管等，應(yīng)徹底洗凈并進行高壓消毒，表面去污劑及其他化學(xué)試劑的污染往往大幅度地降低轉(zhuǎn)化率?！舅伎碱}】1.影響CaCl2法轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵因素有哪些？如何提高轉(zhuǎn)化率？2.涂布菌液時應(yīng)注意什么？實驗六PCR擴增基因特異片段實驗?zāi)康模簩W(xué)習(xí)PCR體外擴增的原理及其引物設(shè)計原則；了解擴增過程中各因素對擴增結(jié)果的影響；掌握PCR的基本操作。實驗

40、原理 PCR(polymerase chain reaction)是在體外進行的由引物介導(dǎo)的酶促DNA擴增反應(yīng)。在分子生物學(xué)研究中，廣泛地應(yīng)用于研究基因突變，獲取加上酶切位點的目的基因和DNA序列測定等方面，是分子生物學(xué)中一項極為常用的技術(shù)。 PCR的原理是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸(dNTP)存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的體外酶促合成反應(yīng)。兩個引物分別位于靶序列的兩端，同兩條模板的3端互補，由此限定擴增片段。PCR反應(yīng)由一系列的變性退火延伸反復(fù)循環(huán)構(gòu)成，即在高溫下模板雙鏈DNA變性解鏈，然后在較低的溫度下同過量的引物退火，再在適中的溫度下由DNA聚合酶催化進行延伸。由于每一循

41、環(huán)的產(chǎn)物都可作為下一循環(huán)反應(yīng)的模板，因此擴增產(chǎn)物的量以指數(shù)級方式增加。理論上，經(jīng)過n次循環(huán)可使特定片段擴增到2n-1，考慮到擴增效率不可能達到100，實際上要少些，通常經(jīng)2530次循環(huán)可擴增106倍，這個量足夠分子生物學(xué)研究的一般要求。 (一)PCR引物設(shè)計1Tm值 Tm值是PCR引物設(shè)計中的一個重要參數(shù)，是指引物與模板之間精確互補并且在模板過量的情況下有50的引物與模板配對，而另外50的引物處于解離狀態(tài)時的溫度，Tm值一般高于55。合適的引物選擇應(yīng)需考慮到以下因素，如Taq酶的最適溫度(TE)和Tm值等。最常用的Taq酶的最適溫度(TE)范圍為7074，根據(jù)TE可以先確定一個合適的退火溫度范

42、圍(Ta)。這個溫度范圍應(yīng)不高于酶的最適反應(yīng)溫度，也不能比TE25更低。這是因為如果退火溫度低于酶的最適反應(yīng)溫度時，酶的合成反應(yīng)會非常緩慢，但片面考慮提高溫度又會造成引物脫落而不能進行PCR擴增。所以Ta的選擇應(yīng)滿足TE-25<Ta<TE。 2引物的長度引物長度一般在1530個核苷酸之間比較合適。引物過短時造成Tm值過低，不能與模板很好地配對或是配對專一性很低。引物過長時又會造成Tm值過高，超過酶的最適反應(yīng)溫度，還使合成引物的費用大大增加。當(dāng)然若要在引物的5末端加上特定的酶切位點等堿基則可稍長。 3引物的GC含量引物的GC比最好設(shè)計在4060的范圍內(nèi)。GC比過高與過低都會直接造成T

43、m值的過高與過低。如上所述，Tm值的估計可簡單地根據(jù)經(jīng)驗式Tm4×GC+2×AT+3.3獲得。4引物3端起始堿基 Taq酶在3末端錯配時延伸效率是不一樣的，延伸效率為T>GC>A。即當(dāng)引物3末端為A時，即使有錯配堿基也最不易延伸，所以引物設(shè)計時可將3末端設(shè)計為A，以提高復(fù)制精確性。另一種理論是3末端應(yīng)設(shè)計為G或C，因為G和C的氫鍵多于A與T，能更好地與模板結(jié)合開始DNA合成，當(dāng)然對錯配延伸效率方面就不能苛求了?？偠灾锏?末端不要考慮使用T。 5引物無發(fā)卡結(jié)構(gòu)引物自身應(yīng)無發(fā)卡結(jié)構(gòu)。 6二引物自身之間不能配對二引物自身不能配對是指同一對引物之間不能有配對的多

44、個堿基，特別是在引物的3末端。二引物間不能配對的道理與二引物本身不能配對相同，若發(fā)生這種情況會形成引物二聚體，造成擴增失敗。一般引物自身配對形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖的堿基對數(shù)不大于3，兩條引物間配對堿基數(shù)小于5個。7二引物的Tm值引物設(shè)計時應(yīng)注意使二引物的Tm值相近，否則二個引物必然不能同時達到最佳退火溫度，將會影響PCR擴增效果。能同時達到最佳退火溫度，將會影響PCR擴增效果。由于影響引物設(shè)計的因素比較多，所以常利用計算機來輔助設(shè)計，通常可用軟件或其它PCR引物設(shè)計程序來幫助設(shè)計。 (二)PCR反應(yīng)條件1PCR緩沖液常用的1×PCR緩沖液為10mmolL Tris-HCl pH8.3(常溫

45、)，50mmolL KCl，1.5mmolL MgCl2。由試劑公司與Taq酶一起提供。(1)Mg2+離子濃度：Mg2+離子濃度對PCR反應(yīng)影響很大，因為Mg2+與引物-模板及產(chǎn)物的解鏈溫度、產(chǎn)物的特異性、引物二聚體的生成、產(chǎn)物的忠實性、酶活力、產(chǎn)物的產(chǎn)量等諸多因素有關(guān)。Mg2+一般使用濃度為L，必要時可以L梯度間隔做Mg2+最適濃度試驗。(2)dNTP：常用dNTP濃度為20molL(可用范圍為20200molL)。dNTP的用量與PCR產(chǎn)量及產(chǎn)物忠實性有關(guān)，dNTP量過少時合成的產(chǎn)物減少?？梢员籘aq酶接受的經(jīng)過修飾的dNTP有以下幾類：dig-11dUTP、5bromo-dUTP、bio

46、tin-11dUTP、biotin-16dUTP、7deaza-dGTP和次黃嘌呤。但不是所有的聚合酶都能接受經(jīng)過修飾的dNTP。(3)K+離子濃度：PCR反應(yīng)中K+離子的作用是促進Taq酶活力與促進引物退火，一般使用濃度是50mmolL，但當(dāng)K+離子濃度高于50mmolL時會抑制Taq酶活力。(4)pH值：PCR反應(yīng)中用的是Tris-HCL緩沖系統(tǒng)。Tris-HCL緩沖系統(tǒng)的特點是具有很高的溫度系數(shù))，20時pH為的緩沖液在72延伸反應(yīng)時，實際pH值降低至72。而Tricine的溫度系數(shù)較高，在擴增長片段時用Tricine系統(tǒng)。(5)保護劑：由于PCR反應(yīng)體系中蛋白的含量極低，所以加人的酶非

47、常容易變性，通常需加入一定量的保護劑。如5mmolL的二硫蘇糖醇(DTT)，100gml的小牛血清白蛋白(BSA)或的明膠。加入保護劑對PCR循環(huán)數(shù)較多的擴增反應(yīng)效果尤其明顯。2模板 PCR模板可以是DNA或RNA，RNA需反轉(zhuǎn)錄后再擴增。模板可以是基因組DNA或純化的質(zhì)粒DNA，當(dāng)然兩者的DNA量在PCR起始模板中相差很大。每個PCR反應(yīng)中加入的模板數(shù)量可在102105分子之間，必要時可低至50個分子，模板的量少時應(yīng)酌情增加循環(huán)次數(shù)。小于100ng的哺乳動物細(xì)胞基因組DNA(相當(dāng)于約104個細(xì)胞)，經(jīng)30個循環(huán)，10的反應(yīng)物應(yīng)能夠在溴化乙錠染色的凝膠上看到一條主要產(chǎn)物帶。使用較大量的模板時，

48、循環(huán)數(shù)可減少；如果模板量很少，可能需要增加至45個循環(huán)反應(yīng)。3引物濃度常用引物濃度為molL。隨著引物濃度的降低，PCR反應(yīng)的特異性提高但產(chǎn)物得率降低；隨著引物濃度的升高，情況正好相反。 4PCR反應(yīng)中的酶 Taq酶最早是從水生嗜熱菌(thermus aquaticus)中分離得到的，該酶的最適溫度是72，在94時相當(dāng)穩(wěn)定，半衰期長達38min。由于這種酶使用最早最廣泛，文獻中所列各項最適反應(yīng)條件都是針對此酶優(yōu)化的，使用其它的聚合酶時按試劑盒使用說明書操作。實驗內(nèi)容儀器和試劑1儀器 PCR儀，微型水平電泳槽，電泳儀等。2試劑（1）50×TAE電泳緩沖液（2）10×PCR緩沖

49、液：（3）4種dNTP混和液10mmol/L（4）Pfu DNA聚合酶（5U/l）（5）引物（20M）（6）10×溴酚藍上樣緩沖液方法和步驟1. 在PCR儀上設(shè)置好程序。2. 在兩個滅菌的離心管中，按下列順序加樣，建立20l反應(yīng)體系。ddH2015l10×PCR Buffer2ldNTP(10mM each)lPrimerl(20M)lPrimer2(20M)l模板DNA (50ng)D16Pfu DNA聚合酶（）1ll總體積20l對照水（空白對照） 3混勻，短暫離心4放在PCR儀上進行PCR反應(yīng)。94變性3min，9445秒，64 1分鐘，723分鐘，20個循環(huán)。（用舊式

50、的PCR儀進行基因擴增時還要求覆蓋約50l (一滴)液體石蠟油，改進后的PCR儀已經(jīng)不用液體石蠟油覆蓋。）5 . 取5l PCR反應(yīng)液及1l上樣緩沖液混合，進行瓊脂糖電泳(5Vcm)，選擇適當(dāng)大小的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000），檢查擴增產(chǎn)物。紫外觀察，必要時拍照。注意事項1.PCR是建立在一定量的模板和與之專一性互補配對的一對引物之上的，因此，在進行PCR前，模板的純化和引物設(shè)計尤為重要。2.Mg2+對Taq DNA聚合酶的活性影響很大，有時按照試劑商提供的說明擴增不出目的基因時，不妨適當(dāng)增加Mg2+的濃?！舅伎碱}】1. PCR的原理是什么？2. PCR中引物和TaqDNA聚合酶各有什么作

51、用？3. PCR中怎樣預(yù)防出現(xiàn)假陽性結(jié)果？ 4. 什么是Tm值？有何用途？如何計算？ 5. 引物設(shè)計應(yīng)遵循什么原則？ 6. 你會使用哪種引物設(shè)計軟件？實驗七 DNA片段的回收及純化實驗?zāi)康牧私猸傊悄z電泳中回收DNA片段的常用方法，掌握根據(jù)實際情況選用方法的原則，并用試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收PCR產(chǎn)物DNA片段。實驗原理DNA片段的分離與回收是基因工程操作中一項重要的技術(shù)，例如可收集特定酶切片段用于克隆或是制備探針，回收PCR產(chǎn)物用于再次鑒定等?；厥諏嶒炛袃蓚€最重要的技術(shù)指標(biāo)是產(chǎn)物的純度與回收率：純度未達標(biāo)時會嚴(yán)重影響以后的酶切、連接、標(biāo)記等酶參與的反應(yīng)；回收率不理想時往往會大大增加前期工作

52、量。 1低熔點膠法低熔點膠是向普通瓊脂糖的多糖鏈上引入羥乙基形成的，這一變化會使凝膠的熔化點與凝固點均降低。低熔點膠在30時凝結(jié)、65時熔化，這一溫度尚不足以使DNA分子變性。操作時可先灌一塊普通的膠，然后用低熔點膠取代其中的回收部分。割下的膠加入TE后于65保溫促使凝膠熔化，再加入等體積的酚抽提去除凝膠。低熔點膠的另一個特點是電泳回收后可以立即進行酶切連接、標(biāo)記等酶反應(yīng)，因為這類膠中不含有普通瓊脂糖中抑制酶活性的硫酸鹽等雜質(zhì)，并且收集的膠條能在酶反應(yīng)的合適溫度(37)始終保持液體狀態(tài)。 2玻璃粉(乳)法將膠條割下加入NaI溶液浸泡，劇烈振蕩數(shù)分鐘促使溶膠。向膠液中加入經(jīng)酸凈化處理的極細(xì)玻璃粉

53、(乳)，室溫反復(fù)倒轉(zhuǎn)離心管使DNA吸附于其上。離心收集玻璃粉后加入TE并于37保溫，洗脫吸附于玻璃粉上DNA，再次離心收集含DNA的上清液即可。玻璃粉法適用于回收0.41kb的小分子片段，均有80的回收率。 3QIAgen膠回收試劑盒由于凝膠溶于含NaI的溶膠液，DNA能專一地與離心柱中纖維素結(jié)合。結(jié)合后的DNA經(jīng)洗滌除去雜質(zhì)，最后在低鹽緩沖液中經(jīng)離心從纖維素上洗脫下來。 4 其他試劑盒，本實驗采用的是北京塞百盛生物技術(shù)公司的PCR產(chǎn)物回收試劑盒?；驹硎?，在高鹽狀態(tài)下，純化樹脂專一性地吸附DNA；而在低鹽或水溶液狀態(tài)下，DNA被洗脫下來。此法簡便快捷，可在幾分鐘內(nèi)從PCR反應(yīng)液，或十幾分鐘

54、內(nèi)從普通瓊脂糖凝膠中回收高純度的PCR產(chǎn)物，用于DNA測序及其它酶促反應(yīng)。其回收率分別為85%和70%左右。該系統(tǒng)不僅用于純化PCR產(chǎn)物，還可以從反應(yīng)液或普通瓊脂糖凝膠中回收各種類型的DNA片段，適用范圍從150bp到十幾kb。實驗內(nèi)容試劑與器材試劑 (1)瓊脂糖 (2)TAE電泳緩沖液 (3)10×DNA電泳樣品緩沖液 (4)無菌水 (5)PCR產(chǎn)物(6)溴化乙錠（EB）（7）試劑盒包裝及組成1、純化樹脂（于GS結(jié)合液中）20ml2、離心純化柱（空柱子）50套（8）80%異丙醇或80%乙醇（9）超純水或TE緩沖液儀器(1)臺式高速離心機(2)水浴鍋13(3)電泳器材實驗步驟1. 將

55、無石蠟油的PCR反應(yīng)液或酶切反應(yīng)液（50l100µl反應(yīng)體系）在1%的普通瓊脂糖凝膠上電泳，切下所需的DNA條帶裝入2ml離心管中。          盡量切掉不含DNA的瓊脂糖凝膠，這樣可簡化操作、提高回收量及DNA片段的質(zhì)量。      2. 200mg400mg瓊脂糖凝膠中加入純化樹脂（使用前充分混勻），70保溫510分鐘，每兩分鐘顛倒混勻1次，使瓊脂糖凝膠完全融化。     對于

56、高濃度的瓊脂糖凝膠（>2%），每200mg的瓊脂糖凝膠中加入純化樹脂，加熱融膠的時間延長到15分鐘。      3. 將混和液轉(zhuǎn)移入離心純化柱，13,000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。      4. 加入500µl80%異丙醇（或乙醇），13,000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。          重復(fù)第4步一次，此步驟13,000rpm離心2分鐘，務(wù)必將異丙醇（或乙醇）除盡。如果離心純化柱上還殘留有異丙醇（或乙醇），13,000rpm再離心1分鐘。      5. 將離心純化