常規(guī)真核表達(dá)與鑒定ppt課件

1、1常規(guī)真核表達(dá)與鑒定常規(guī)真核表達(dá)與鑒定 劉宗梁 2019-10-192一、真核表達(dá)概述；二、常用真核表達(dá)系統(tǒng)；三、細(xì)胞與載體的選擇；四、哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染；五、Western-blot法對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果的檢測(cè)； 六、間接免疫熒光法IFA對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果的檢測(cè)；七、Cell-ELISA法對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果的檢測(cè)；主要內(nèi)容：3一、真核表達(dá)概述1、真核表達(dá)：經(jīng)過將外源基因克隆到真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染到適宜的真核細(xì)胞中，最終獲得外源目的基因高效表達(dá)產(chǎn)物的過程。2、真核表達(dá)相對(duì)原核表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)：在真核表達(dá)的過程中，可以經(jīng)過真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄及修飾系統(tǒng)如甲基化修飾、糖基化修飾、乙?；揎椀全@得具有一定構(gòu)象和生物活性的蛋白質(zhì)；表達(dá)目的蛋

2、白更的構(gòu)造及生物學(xué)功能如免疫原性等更接近于該蛋白的天然形狀，且表達(dá)的蛋白不存在原核表達(dá)中“包涵體這一景象。3、真核表達(dá)缺陷：表達(dá)量低，普通難以耐久表達(dá)。4二、常用真核表達(dá)系統(tǒng)1、畢赤酵母表達(dá)體系：酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)蛋白表達(dá)程度高，消費(fèi)本錢低，但純化難度大。2、慢病毒表達(dá)系統(tǒng)：商品化的慢病毒表達(dá)系統(tǒng)如Lenti-X在病毒包裝時(shí)獲得VSV-G泛嗜性重組慢病毒，經(jīng)過膜質(zhì)偶聯(lián)和膜質(zhì)交融的方式感染靶細(xì)胞，可感染幾乎一切類型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。3、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系：對(duì)蛋白的加工與修飾與酵母及昆蟲表達(dá)系統(tǒng)完全不同，可經(jīng)過脂質(zhì)體等直接將外源表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，進(jìn)展表達(dá)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)更接近于天然

3、蛋白，但其表達(dá)量低。54、桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系：蛋白表達(dá)程度高，可長(zhǎng)晶體，多用于蛋白結(jié)果與功能的研討，但重組質(zhì)粒構(gòu)建及交融非常復(fù)雜。6三、細(xì)胞與載體的選擇1、常用于表達(dá)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞：COS-7、BHK、293T、Sf-9、Sf-21等，詳細(xì)選擇可根據(jù)實(shí)踐需求或者表達(dá)載體所含的表達(dá)原件等進(jìn)展選擇。2、表達(dá)質(zhì)粒的選擇：常用的真核表達(dá)質(zhì)粒有pCAGGS、pCDNA 3.1、 pEGFP等均為SV40 origin。3、某些特殊的表達(dá)載體：如反向遺傳表達(dá)載體，昆蟲表達(dá)系統(tǒng)載體等。7四、哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染1、引物設(shè)計(jì)：構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒，普通在引物設(shè)計(jì)時(shí)首先會(huì)在引物中引物一些可以促進(jìn)蛋白表達(dá)如Ko

4、zak序列或者便于后期檢測(cè)的序列或標(biāo)簽如flag、HA、His等，留意這些序列在引物中的位置。2、實(shí)驗(yàn)資料：真核表達(dá)細(xì)胞系、DMEM、FBS、OPTI-MEM、PBS、trypsin、攜帶有外源基因的重組質(zhì)粒去細(xì)胞內(nèi)毒素法抽提、轉(zhuǎn)染試劑或儀器、細(xì)胞計(jì)數(shù)器、蓋玻片、六孔板等。3、轉(zhuǎn)染細(xì)胞密度約25106/mL,普通在細(xì)胞鋪板后1218h內(nèi)進(jìn)展轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒要測(cè)定濃度，按2ug/孔進(jìn)展。8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟 以DFV-E基因轉(zhuǎn)染cos-7細(xì)胞為例1、cos-7細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，鋪六孔板，培育1224h，察看細(xì)胞生長(zhǎng)情況，至適宜密度 (鋪板后的細(xì)胞盡能夠在24h內(nèi)進(jìn)展轉(zhuǎn)染，普通選擇過夜)即可進(jìn)展轉(zhuǎn)染。2

5、、質(zhì)粒及脂質(zhì)體處置1及脂質(zhì)體 ：脂質(zhì)體為4、6、8uL/孔脂質(zhì)體+OPTI-MEM，250ul/1.5 tube，孵育5min2質(zhì)粒：質(zhì)粒終濃度分別為2、3、4ug/孔質(zhì)粒+OPTI-MEM，250ul/1.5 tube，不需孵育，在脂質(zhì)體孵育5min中的過程中，把質(zhì)粒配好93、將第二步中2參與1中，混勻，不要猛烈吹打，孵育20min在兩者作用的20min時(shí)間內(nèi)，洗滌細(xì)胞4、細(xì)胞的洗滌：先棄掉原培育液，以維持液DMEM未加血清洗滌兩遍1mL/孔；再用OPTI-MEM洗滌一遍，約1mL/孔。細(xì)胞洗滌也可用預(yù)熱的PBS或者Hanks液洗滌，最后一遍洗滌最好運(yùn)用維持液。5、將六孔板中的以上液體棄掉，

6、再參與1.5mL的OPTI-DMEM； 將孵育的脂質(zhì)體及質(zhì)粒500uL/孔均勻 滴入其中，輕搖六孔板使之混合均勻。106、將六孔板放入培育箱，普通56小時(shí)后換液，詳細(xì)能否要換液根據(jù)細(xì)胞詳細(xì)生長(zhǎng)形狀進(jìn)展調(diào)整。7、棄去原培育液，補(bǔ)加2mL/孔的OPTI-MEM，或者參與2mL/孔的含10%血清的DMEM培育基，繼續(xù)培育至3648h。8、培育至48h后收細(xì)胞即可停頓培育，然后進(jìn)展表達(dá)蛋白的鑒定。假設(shè)用IFA法檢測(cè)，那么在此處即可進(jìn)展細(xì)胞固定；假設(shè)進(jìn)展Western bolt法檢測(cè)，那么此處需求將細(xì)胞消化下來，裂解，然后進(jìn)展SDS-PAGE，最終經(jīng)過WB檢測(cè)。9、轉(zhuǎn)染時(shí)留意做空白細(xì)胞對(duì)照和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)

7、照。11五、Western-blot法對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果的檢測(cè)1、培育至48h后收細(xì)胞(視細(xì)胞形狀決議何時(shí)搜集細(xì)胞)，棄去六孔板中的培育液，然后以胰酶消化500uL/孔、作用1min。2、以預(yù)冷的PBS反復(fù)吹打洗脫細(xì)胞，PBS 1mL/每孔(最好再用PBS 500uL反復(fù)洗細(xì)胞孔一次，徹底搜集一切的細(xì)胞)，為了提高細(xì)胞量，可做兩轉(zhuǎn)染孔合一管。3、汲取消化下來的細(xì)胞于1.5mL tube中，4、12000r/m、2min；棄上清。 124、再以1mL PBS洗滌離心細(xì)胞沉淀，在管口沿壁參與，吹起沉淀；離心：4、12000r/m、2min；棄上清。5、每個(gè)離心管參與100uL細(xì)胞裂解液(RIPA)，吹打混

8、勻，冰上作用30min裂解細(xì)胞。6、離心4 12000r/m、5min；汲取上清約30uL；煮樣，加上樣loading buffer，蛋白電泳。7、轉(zhuǎn)膜、封鎖，進(jìn)展western blotting鑒別。8、留意：由于真核表達(dá)的蛋白量較低，因此在做WB檢測(cè)時(shí)，最好采用ECL發(fā)光，然后經(jīng)過X膠片曝光或者運(yùn)用低溫冷凍CCD儀器進(jìn)展曝光，而不采用化學(xué)發(fā)光試劑DAB進(jìn)展顯色，由于檢測(cè)的靈敏度差別較大。13細(xì)胞裂解液RIPA配方 強(qiáng)裂解液50mL 弱裂解液50mL Tris-HCL(pH=7.4) Tris-HCL(pH=7.4) NaCL 0.44g NaCL 0.44gTriton-X 100/NP4

9、0 500uL Triton-X 100/NP40 500uL 脫氧膽酸鈉 0.5g 脫氧膽酸鈉 0.125g SDS 0.05g SDS 0.05g 1mM EDTA 0.0186g 1mM EDTA 0.0186g 14六、間接免疫熒光法IFA對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果的檢測(cè)1、轉(zhuǎn)染細(xì)胞培育至48h后，棄掉六孔板中培育基，用PBS洗滌細(xì)胞35次，每次1mL/孔，參與PBS后將培育板放在程度搖床中輕搖1min。留意：千萬(wàn)不能用冷的PBS，否那么細(xì)胞會(huì)從培育板中大片零落。2、細(xì)胞固定：以4%多聚甲醛將細(xì)胞固定在六孔板中，防止零落；1mL/孔，室溫固定2030min。3、洗滌細(xì)胞板：PBS或PBST洗滌35次，

10、每次1mL/孔，1min/次。154、透膜：對(duì)于胞內(nèi)表達(dá)的分泌蛋白需求進(jìn)展透膜，而在膜外表表達(dá)的可以不透膜。此時(shí)以冷的Triton-X 100，1mL/孔，室溫孵育1520min進(jìn)展透膜。5、洗板：同上。6、封鎖：以1% BSAPBST溶解封鎖六孔板，1mL/孔，室溫孵育3060min。7、洗板：同上。168、孵育一抗：一抗可選擇制備的多抗或針對(duì)特定標(biāo)簽的單抗，以1% BSA稀釋抗體。500uL1mL/孔，37，孵育1h。9、洗板：同上。10、孵育熒光二抗：二抗為FITC熒光標(biāo)志抗體，孵育時(shí)需求用錫箔紙將六孔板完全包裹住，37，避光孵育1h。11、洗滌：此處洗滌同上，但仍需求避光。12、置于熒光顯微鏡同一設(shè)置參數(shù)下，分別進(jìn)展對(duì)照孔及轉(zhuǎn)染孔的拍照。1718七、Cell-ELISA法對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果的檢測(cè)1、該方法用于在96孔板進(jìn)展的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染至48h后，前期操作同IFA，只是在