解剖小白鼠實(shí)驗(yàn)

1、細(xì)胞原代培養(yǎng)(Cell primary culture)(Cell primary culture)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?了解細(xì)胞體外培養(yǎng)的原理、基本方了解細(xì)胞體外培養(yǎng)的原理、基本方 法，了解無菌操作方法及注意事項(xiàng)。法，了解無菌操作方法及注意事項(xiàng)。 學(xué)習(xí)觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)學(xué)習(xí)觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng) 狀況。狀況。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 用直接從機(jī)體獲得的細(xì)胞進(jìn)行的培養(yǎng)稱為用直接從機(jī)體獲得的細(xì)胞進(jìn)行的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)。這種培養(yǎng)過程主。這種培養(yǎng)過程主要是采用無菌操作的方法，把組織（或器官）從動(dòng)物體內(nèi)取出，經(jīng)酶消化要是采用無菌操作的方法，把組織（或器官）從動(dòng)物體內(nèi)取出，經(jīng)酶消化處理，處理

2、，使分散成單個(gè)細(xì)胞，使分散成單個(gè)細(xì)胞，然后在人工條件下培養(yǎng)，使其不斷地生長(zhǎng)和繁然后在人工條件下培養(yǎng)，使其不斷地生長(zhǎng)和繁殖。原代培養(yǎng)是建立各種細(xì)胞系的第一步。殖。原代培養(yǎng)是建立各種細(xì)胞系的第一步。消化培養(yǎng)法消化培養(yǎng)法 又稱為組織消化分散法組織消化分散法：將妨礙細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞間質(zhì)去除，使細(xì)胞分散，將妨礙細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞間質(zhì)去除，使細(xì)胞分散，形成懸液，按不同濃度接種培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。形成懸液，按不同濃度接種培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。 實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)儀器 超凈工作臺(tái)超凈工作臺(tái)，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸 CO2CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱 倒置顯微鏡倒置顯微鏡 自動(dòng)雙重純水蒸餾器，純

3、水儀自動(dòng)雙重純水蒸餾器，純水儀 耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動(dòng)吸引器耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動(dòng)吸引器 超凈臺(tái) 超凈工作臺(tái)的工超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過高效濾驅(qū)動(dòng)空氣遁過高效濾器，除去空氣中的塵器，除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺(tái)面，使工通過工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。 濾 器濾器工作原理 CO2CO2培養(yǎng)箱nCO2CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 37 ，5 5CO2 CO2 。n使用使用CO2CO2培養(yǎng)箱應(yīng)注意的問題：培養(yǎng)箱應(yīng)注意的問題：用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需

4、將瓶蓋微松，用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。以保證通氣。保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90 90 ，14 h)14 h)。箱內(nèi)無菌蒸餾水箱內(nèi)無菌蒸餾水30003000毫升蒸餾水槽中以毫升蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。倒置顯微鏡自動(dòng)雙重純水蒸餾器 純水儀培 養(yǎng) 板 培養(yǎng)瓶實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料2 2月月齡的齡的小小鼠鼠實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)試劑 （1 1） 1640-RPMI1640-RPMI培養(yǎng)液培養(yǎng)液（2 2） 小牛血清小牛血清（3 3） 青、鏈霉素青、鏈霉素（4 4） PBSPBS液液（5 5） 5 5NaHCO3N

5、aHCO3（6 6） 7575酒精酒精實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 一、培養(yǎng)前的準(zhǔn)備工作一、培養(yǎng)前的準(zhǔn)備工作 （1 1） 清洗與消毒清洗與消毒（2 2） 配制溶液配制溶液（3 3） 紫外線消毒紫外線消毒（4 4） 洗手和著裝洗手和著裝（5 5） 進(jìn)入無菌室進(jìn)入無菌室 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 動(dòng)動(dòng)物物細(xì)細(xì)胞胞原原代代培培養(yǎng)養(yǎng)過過程程圖圖方法與步驟方法與步驟（1 1）動(dòng)物）動(dòng)物拉椎處死處死（2 2）取肝及剪碎：）取肝及剪碎：剖開腹部，將，將肝肝臟取出，臟取出，放入小培養(yǎng)皿中，用放入小培養(yǎng)皿中，用PBSPBS液洗滌液洗滌1 1次；將次；將肝肝剪成剪成1mm1mm大小的塊，再用大小的塊，再用PBSPBS液洗滌液洗滌2

6、2次，直次，直到液體澄清。到液體澄清。（3 3）消化及分散組織塊：）消化及分散組織塊：將上述清洗過的組織放入將上述清洗過的組織放入試管內(nèi)，加入的管內(nèi)，加入的0.250.25胰蛋胰蛋白酶液，白酶液，完全沒過組織完全沒過組織，置，置3737水浴中消化水浴中消化20 20 30min30min，每隔，每隔10min10min搖動(dòng)一搖動(dòng)一次，直到組織塊變得疏松，粘稠，且顏色略變?yōu)榘咨珵橹?。取出次，直到組織塊變得疏松，粘稠，且顏色略變?yōu)榘咨珵橹?。取出試管，吸去管，吸去胰蛋白酶液，加入胰蛋白酶液，加?ml5ml培養(yǎng)液，用吸管反復(fù)吹打組織塊，使其分散成細(xì)胞懸液，培養(yǎng)液，用吸管反復(fù)吹打組織塊，使其分散成細(xì)胞

7、懸液，取上清液至另一取上清液至另一試管中。管中。（4 4）觀察與計(jì)數(shù)：）觀察與計(jì)數(shù)：從細(xì)胞懸液中取出從細(xì)胞懸液中取出1 1滴滴于載玻片上，顯微鏡下觀察細(xì)滴滴于載玻片上，顯微鏡下觀察細(xì)胞的數(shù)目?？吹角蛐偷募?xì)胞，證明消化下來細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)成功。胞的數(shù)目?？吹角蛐偷募?xì)胞，證明消化下來細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)成功。作業(yè): 1.在細(xì)胞培養(yǎng)過程中如何防止污染?無菌操作的幾個(gè)注意事項(xiàng) 1、操作前要洗手，進(jìn)入超凈臺(tái)后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。 2、點(diǎn)燃酒精燈，操作在火焰附近進(jìn)行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時(shí)間不能太長(zhǎng)，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，

8、以免燒焦形成碳膜。 3、操作動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。 4、不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺(tái)面上用品要布局合理。 5、瓶子開口后要盡量保持45斜位。 6、吸溶液的吸管等不能混用。 7、自取材開始，保持所有組織細(xì)胞處于無菌條件。細(xì)胞計(jì)數(shù)可在有菌環(huán)境中進(jìn)行。 8、在超凈臺(tái)中，組織細(xì)胞、培養(yǎng)液等不能暴露過久，以免溶液蒸發(fā)。 9、凡在超凈臺(tái)外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以防止細(xì)菌落入。 超凈臺(tái) 超凈工作臺(tái)的工超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過高效濾驅(qū)動(dòng)空氣遁過高效濾器，除去空氣中的塵器，除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺(tái)面，使工通過工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。 倒置顯微鏡自動(dòng)雙重純水蒸餾器 純水儀 培養(yǎng)瓶方法與步驟方法與步驟（1 1）動(dòng)物）動(dòng)物拉椎處死處死（2 2）取肝及剪碎：）取肝及剪碎：剖開腹部