第2章---蛋白質的構件--氨基酸演示教學

1、第2章-蛋白質的構件-氨基酸一、蛋白質的化學組成和分類一、蛋白質的化學組成和分類1.1.元素組成元素組成 蛋白質是一類含氮有機化合物，除含有碳、蛋白質是一類含氮有機化合物，除含有碳、氫、氧外，還有氮和少量的硫。某些蛋白質還含有其他氫、氧外，還有氮和少量的硫。某些蛋白質還含有其他一些元素，主要是磷、鐵、碘、鋅和銅等。一些元素，主要是磷、鐵、碘、鋅和銅等。碳和氮碳和氮元素元素在蛋白質中的組成百分比約為：在蛋白質中的組成百分比約為：碳：碳：50%; 氮：氮：16%。2.蛋白質的估算蛋白質的估算 平均含氮量約為平均含氮量約為16%，所以，可以根據(jù)，所以，可以根據(jù)樣品中的含氮量來計算蛋白質的大概含量：樣

2、品中的含氮量來計算蛋白質的大概含量： 蛋白質含量蛋白質含量=蛋白氮蛋白氮6.253.3.氨基酸組成氨基酸組成 蛋白質是由蛋白質是由2020種種L-L-型型氨基酸氨基酸 組成的長鏈分子組成的長鏈分子4.蛋白質的分類蛋白質的分類 1） 按組成：按組成： 簡單蛋白質（表簡單蛋白質（表21）：）： 綴合蛋白質（表綴合蛋白質（表21） ：（注意輔基的組成）：（注意輔基的組成）2）按生物學功能分）按生物學功能分 ： 酶、運輸?shù)鞍?、營養(yǎng)和貯存蛋白、激素、受體蛋白、運動蛋白、結酶、運輸?shù)鞍住I養(yǎng)和貯存蛋白、激素、受體蛋白、運動蛋白、結構蛋白、防御蛋白等。構蛋白、防御蛋白等。3）按形狀和溶解度：）按形狀和溶解度

3、： 纖維狀蛋白質：不溶于水纖維狀蛋白質：不溶于水, 結構作用。如膠原蛋白，角蛋白等。結構作用。如膠原蛋白，角蛋白等。 球狀蛋白質球狀蛋白質 ：易溶于水，細胞中大多屬可溶性蛋白。如酶、轉運：易溶于水，細胞中大多屬可溶性蛋白。如酶、轉運蛋白、抗體等。蛋白、抗體等。 酸水解酸水解：H2SO4或或HCI能使蛋白質完全水解；不引起消旋作用，能使蛋白質完全水解；不引起消旋作用，但色氨酸完全被破壞，天冬酰胺、谷胺酰胺脫酰胺基；但色氨酸完全被破壞，天冬酰胺、谷胺酰胺脫酰胺基；堿水解堿水解：NaOH能使蛋白質完全水解；色氨酸穩(wěn)定，但大多數(shù)氨能使蛋白質完全水解；色氨酸穩(wěn)定，但大多數(shù)氨基酸遭破壞并引起消旋現(xiàn)象；基酸

4、遭破壞并引起消旋現(xiàn)象；酶水解酶水解：部分水解；不產(chǎn)生消旋，不破壞氨基酸；主要用于蛋白部分水解；不產(chǎn)生消旋，不破壞氨基酸；主要用于蛋白質一級結構分析，如：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等。質一級結構分析，如：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等。二、蛋白質的水解二、蛋白質的水解三、氨基酸的一般結構三、氨基酸的一般結構結構通式結構通式：與羧基相連的：與羧基相連的C上都有一個氨基，上都有一個氨基，氫原子和可變的氫原子和可變的R基。如圖基。如圖aa結構通式：結構通式：除除Gly外外 , C是不對稱是不對稱C ： 1.具有兩種立體異構體具有兩種立體異構體 D-型和型和L-型型 2.具有旋光性具有旋光性

5、左旋（左旋（-）或右旋（）或右旋（+）四、氨基酸的分類（一）基本氨基酸：組成蛋白質的常見氨基酸（有（一）基本氨基酸：組成蛋白質的常見氨基酸（有20種）。種）。（二）不常見的蛋白質氨基酸：不常見但在某些蛋白質中（二）不常見的蛋白質氨基酸：不常見但在某些蛋白質中存在。是多肽合成后由基本存在。是多肽合成后由基本aa經(jīng)酶促修飾而來經(jīng)酶促修飾而來(約約10種種)。（三）非蛋白質氨基酸：存在于生物體內(nèi)但不參與蛋白質（三）非蛋白質氨基酸：存在于生物體內(nèi)但不參與蛋白質組成的氨基酸組成的氨基酸(約約200多種多種)。按按R基的化學結構：基的化學結構： 中性脂肪族氨基酸中性脂肪族氨基酸 1.脂肪族氨基酸脂肪族氨基

6、酸 含羥基或硫的氨基酸含羥基或硫的氨基酸 酸性氨基酸及其酰氨酸性氨基酸及其酰氨 堿性氨基酸堿性氨基酸 2.芳香族氨基酸芳香族氨基酸 3.雜環(huán)族氨基酸雜環(huán)族氨基酸（一）（一）常見的蛋白質氨基酸（常見的蛋白質氨基酸（2020種）種）（1）中性脂肪族氨基酸（）中性脂肪族氨基酸（5種，種，甘丙纈亮異甘丙纈亮異）R基均為中性烷基，基均為中性烷基，R基對分子酸堿性影響很小?；鶎Ψ肿铀釅A性影響很小。Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性 。1. 脂肪族氨基酸脂肪族氨基酸（2） R中含有羥基和硫的氨基酸（共中含有羥基和硫的氨基酸（共4種，種，絲蘇半甲硫絲

7、蘇半甲硫） Cys的的R中含中含巰基（巰基（-SH），具有重要性質：具有重要性質：兩個兩個Cys的巰基氧化生成二硫鍵，生成胱氨酸。的巰基氧化生成二硫鍵，生成胱氨酸。 Met在生物合成中是一種重要的甲基供體在生物合成中是一種重要的甲基供體。（3）酸性氨基酸及其酰胺基團（各）酸性氨基酸及其酰胺基團（各2種，種，天谷酸酰胺天谷酸酰胺） Asp和和Glu是唯一在生理條件下帶有負電荷的的兩個氨基酸；是唯一在生理條件下帶有負電荷的的兩個氨基酸；（4 ）堿性氨基酸（）堿性氨基酸（3種，種，賴精組賴精組） Arg是堿性最強的氨基酸，是動物體內(nèi)尿素形成的中間物。是堿性最強的氨基酸，是動物體內(nèi)尿素形成的中間物。2

8、.芳香族氨基酸（芳香族氨基酸（3種，種，苯丙色酪香苯丙色酪香） 苯丙氨酸苯丙氨酸 酪氨酸酪氨酸 色氨酸色氨酸3.雜環(huán)氨基酸（雜環(huán)氨基酸（2種，種，雜環(huán)帶組脯）Pro的的-亞氨基是環(huán)的一部分，因此具有特殊的剛性結構，一般出亞氨基是環(huán)的一部分，因此具有特殊的剛性結構，一般出現(xiàn)在兩段現(xiàn)在兩段-螺旋之間的轉角處，螺旋之間的轉角處，Pro殘基所在的位置必然發(fā)生骨架殘基所在的位置必然發(fā)生骨架方向的變化；方向的變化；His帶有咪唑基，是在生理帶有咪唑基，是在生理pH條件下唯一具有緩沖能力的氨基酸。條件下唯一具有緩沖能力的氨基酸。His在酶的酸堿催化機制中起重要作用。在酶的酸堿催化機制中起重要作用。l按按R基

9、的極性性質：基的極性性質： 1.非極性非極性R基氨基酸基氨基酸8（丙、纈、亮、異亮、（丙、纈、亮、異亮、脯、苯丙、色、甲硫）脯、苯丙、色、甲硫） 2.不帶電荷的極性不帶電荷的極性R基氨基酸基氨基酸7（甘、絲、蘇、（甘、絲、蘇、半胱、酪、谷氨酰胺、天冬酰胺）半胱、酪、谷氨酰胺、天冬酰胺） 3.帶正電荷的帶正電荷的R基氨基酸基氨基酸3（賴、精、組）（賴、精、組） 4.帶負電荷的帶負電荷的R基氨基酸基氨基酸2（谷、天冬）（谷、天冬）極極性性1.非極性非極性R基氨基酸（基氨基酸（8種）種）在水中的溶解度小，且在維持蛋白質的三維結構（蛋白質的疏水核在水中的溶解度小，且在維持蛋白質的三維結構（蛋白質的疏水

10、核心）中起著重要作用。心）中起著重要作用。2.不帶電荷的極性不帶電荷的極性R基氨基酸（基氨基酸（7種）種）這類氨基酸的側鏈都能與水形成氫這類氨基酸的側鏈都能與水形成氫鍵，因此很容易溶于水。鍵，因此很容易溶于水。羥基羥基巰基巰基酰胺基酰胺基3.帶負電荷的帶負電荷的R基氨基酸（酸性氨基酸，基氨基酸（酸性氨基酸，2種）種）這兩種氨基酸都含有兩個羧這兩種氨基酸都含有兩個羧基，并且第二個羧基在基，并且第二個羧基在pH7左右也完全解離，因此分子左右也完全解離，因此分子帶負電荷。帶負電荷。4.帶正電荷的帶正電荷的R基氨基酸（堿性氨基酸，基氨基酸（堿性氨基酸，3種）種）膠原蛋白中的膠原蛋白中的Lys側鏈氧化時

11、側鏈氧化時能形成很強的分子間能形成很強的分子間(或分子或分子內(nèi)內(nèi))交聯(lián)。交聯(lián)。Arg堿性很強，與堿性很強，與NaOH相當。相當。His是天然的緩沖劑，它往往是天然的緩沖劑，它往往存在于許多酶的活性中心。存在于許多酶的活性中心。（二）不常見的蛋白質氨基酸（二）不常見的蛋白質氨基酸也稱修飾氨基酸，是在蛋白質合成后，由基本氨也稱修飾氨基酸，是在蛋白質合成后，由基本氨基酸修飾而來?；嵝揎椂鴣怼?4-羥脯氨酸和羥脯氨酸和5-羥賴氨酸，這兩種氨基酸主要存羥賴氨酸，這兩種氨基酸主要存在于結締組織的纖維狀蛋白中。在于結締組織的纖維狀蛋白中。（三）非蛋白質氨基酸（三）非蛋白質氨基酸不組成蛋白質，但有生理功能。

12、不組成蛋白質，但有生理功能。（2）D-型氨基酸型氨基酸 D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、肽聚糖中）、D-Phe（短桿菌肽短桿菌肽S）（3）-、-、-氨基酸氨基酸 -Ala（泛素的前體）、泛素的前體）、-氨基丁酸（神經(jīng)遞質）。氨基丁酸（神經(jīng)遞質）。（一）氨基酸的解離（一）氨基酸的解離氨基酸在晶體和水溶液中主要以兩性離子形式存在，極少數(shù)為中性氨基酸在晶體和水溶液中主要以兩性離子形式存在，極少數(shù)為中性分子。分子。氨基酸在兩性離子時，氨基是以質子化氨基酸在兩性離子時，氨基是以質子化(NH3+)形式存在，羧基是形式存在，羧基是以離解狀態(tài)以離解狀態(tài)(COO-)存在。兩性離子既有酸的作用，又有堿的作用。

13、存在。兩性離子既有酸的作用，又有堿的作用。五、氨基酸的酸堿性質五、氨基酸的酸堿性質（二）氨基酸的等電點（二）氨基酸的等電點氨基酸分子的整體與溶液的氨基酸分子的整體與溶液的pHpH有關，改變?nèi)芤河嘘P，改變?nèi)芤簆HpH可以使氨基酸帶上正電荷，可以使氨基酸帶上正電荷，負電荷或者正好處于凈電荷為零的兼性離子狀態(tài)。負電荷或者正好處于凈電荷為零的兼性離子狀態(tài)。 等電點：等電點：當溶液濃度為某一當溶液濃度為某一pHpH值時，氨基酸分子中所含的值時，氨基酸分子中所含的- -NHNH3 3+ +和和- -COOCOO- -數(shù)目數(shù)目正好相等，凈電荷為正好相等，凈電荷為0 0。這一。這一pHpH值即為氨基酸的等電點

14、，簡稱值即為氨基酸的等電點，簡稱p pI I。在等電點時，氨基酸既不向正極也不向負極移動，即氨基酸處于兩性離子狀在等電點時，氨基酸既不向正極也不向負極移動，即氨基酸處于兩性離子狀態(tài)，少數(shù)離解成數(shù)目相等的陰、陽離子。態(tài)，少數(shù)離解成數(shù)目相等的陰、陽離子。 pH = pI時，氨基酸凈電荷為零；時，氨基酸凈電荷為零； pH pI時，兩性離子釋放質子時，兩性離子釋放質子，氨基酸帶負電荷，在電場中向正極移動；氨基酸帶負電荷，在電場中向正極移動； pH PIPHPI等電點（等電點（PI)正電荷正電荷負電荷負電荷氨基酸的等電點可依其分子中氨基、羧基和氨基酸的等電點可依其分子中氨基、羧基和R基的解離常數(shù)（基的解

15、離常數(shù)（pKa）值求出。）值求出。氨基酸等電點的計算公式可分為下列情況：氨基酸等電點的計算公式可分為下列情況： 1. 非極性非極性R基氨基酸和不帶電荷的極性基氨基酸和不帶電荷的極性R基氨基酸（半胱基氨基酸（半胱氨酸除外）：氨酸除外）：pI = (pKa1 + pKa2 )/2 2.帶負電荷的極性帶負電荷的極性R基的氨基酸（酸性氨基酸）：基的氨基酸（酸性氨基酸）：pI = (pKa1 + pKR-COO- )/2 半胱氨酸（半胱氨酸（Cys)不屬酸性氨基酸，但其不屬酸性氨基酸，但其SH具有弱具有弱酸性，在酸性，在PH7.0時，時， Cys的的SH部分解離，故其部分解離，故其PI按酸按酸性氨基酸計

16、算。性氨基酸計算。 3.帶正電荷的極性帶正電荷的極性R基的氨基酸（堿性氨基酸）：基的氨基酸（堿性氨基酸）：pI = (pKa2 + pKR-NH2 )/2 例如：例如：Glu的的pKa12.19， pKa2 9.67 ， pKR 4.25 ，計算其等電點，計算其等電點? 解：根據(jù)等電點的定義，近似求出解：根據(jù)等電點的定義，近似求出 pI=（pKa1+pKR)/2=(2.19+4.25)/2=3.22（一）（一）-羧基參加的反應羧基參加的反應 1. 成酯反應成酯反應 羧基被醇酯化后，形成相應的酯。羧基被醇酯化后，形成相應的酯。 2. 成酰氯反應成酰氯反應 羧基可與五氯化磷或二氯亞砜反應，羧基可與

17、五氯化磷或二氯亞砜反應，生成酰氯，在多肽的人工合成中常用。生成酰氯，在多肽的人工合成中常用。 3. 成酰胺反應成酰胺反應六、氨基酸的化學反應六、氨基酸的化學反應1. ?；磻；磻?丹磺酰氯丹磺酰氯（5二甲基氨基萘二甲基氨基萘-1-磺酰氯磺酰氯， DNS-Cl ）：）： 常用于多肽鏈常用于多肽鏈NH2末端氨基酸的標記和微量氨基酸的定量測定。末端氨基酸的標記和微量氨基酸的定量測定。（二）-NH2參加的反應 N GlyAlaSerLeuPhe C DNSGlyAlaSerLeuPhe C 水解產(chǎn)物：水解產(chǎn)物： DNSGly、 Ala、 Ser、 Leu、 Phe DNS-AA在紫外光激發(fā)后發(fā)黃色

18、熒光。在紫外光激發(fā)后發(fā)黃色熒光。DNS 2. 烴基化反應烴基化反應 -氨基中的氮是一個親核中心，能與烴基（包氨基中的氮是一個親核中心，能與烴基（包括環(huán)烴及其衍生物）發(fā)生親核取代反應，如括環(huán)烴及其衍生物）發(fā)生親核取代反應，如Edman反應（可鑒定多肽的反應（可鑒定多肽的NH2 2末端氨基酸末端氨基酸 ）。）。EdmanEdman反應反應( (苯異硫氰酸酯，苯異硫氰酸酯，PITC )PITC ) 產(chǎn) 物 ： 苯 乙 內(nèi) 酰 硫 脲 衍 生 物產(chǎn) 物 ： 苯 乙 內(nèi) 酰 硫 脲 衍 生 物（PTH-PTH-氨基酸），無色，可以用氨基酸），無色，可以用層析法分離鑒定。層析法分離鑒定。 被被EdmanE

19、dman用來鑒定多肽的用來鑒定多肽的NHNH2 2末端末端氨基酸氨基酸 。（三）茚三酮反應（三）茚三酮反應 與茚三酮反應（與茚三酮反應（） 茚三酮在弱酸中與茚三酮在弱酸中與-氨基酸共熱，引起氨基酸的氧化脫氨、脫羧反應，氨基酸共熱，引起氨基酸的氧化脫氨、脫羧反應，最后，茚三酮與反應產(chǎn)物最后，茚三酮與反應產(chǎn)物氨和還原茚三酮反應，生成紫色物質氨和還原茚三酮反應，生成紫色物質。氨氨基基酸酸與與茚茚三三酮酮的的反反應應過過程程 此反應十分靈敏，根據(jù)反應所生成此反應十分靈敏，根據(jù)反應所生成的紫色的深淺，在的紫色的深淺，在570nm波長下進行比波長下進行比色就可測定樣品中氨基酸的含量，也可色就可測定樣品中氨

20、基酸的含量，也可以在分離氨基酸時作為顯色劑對氨基酸以在分離氨基酸時作為顯色劑對氨基酸進行定量分析。進行定量分析。 Pro、Hy-Pro與茚三酮直接形成黃與茚三酮直接形成黃色化合物。色化合物。（四）（四） 側鏈官能團的特異反應側鏈官能團的特異反應用于蛋白質的化學修飾用于蛋白質的化學修飾 氨基酸側鏈含有羥基、酚基、巰基、吲哚基、咪唑基、胍基、甲硫基等。氨基酸側鏈含有羥基、酚基、巰基、吲哚基、咪唑基、胍基、甲硫基等。蛋白質的化學修飾：蛋白質的化學修飾：在溫和條件下，以可控制的方式使蛋白質與某種試在溫和條件下，以可控制的方式使蛋白質與某種試劑發(fā)生特異反應，引起蛋白質中個別氨基酸側鏈或功能團發(fā)生共價化學

21、劑發(fā)生特異反應，引起蛋白質中個別氨基酸側鏈或功能團發(fā)生共價化學改變。改變。 Cys(SH)鹵化烷（如碘乙酸等）鹵化烷（如碘乙酸等） ：保護巰基，防止重新被氧化；：保護巰基，防止重新被氧化；2硝基苯甲酸：分光光度法定量測定巰基；硝基苯甲酸：分光光度法定量測定巰基；易被氧化成胱氨酸易被氧化成胱氨酸胱氨酸的氧化（產(chǎn)物：磺基丙氨酸。胱氨酸的氧化（產(chǎn)物：磺基丙氨酸。氧化劑：氧化劑：過甲酸）過甲酸）胱氨酸的還原（產(chǎn)物：半胱氨酸。胱氨酸的還原（產(chǎn)物：半胱氨酸。 還原劑：還原劑：巰基乙醇等）巰基乙醇等）七、氨基酸的旋光性和光譜性質七、氨基酸的旋光性和光譜性質（一）氨基酸的旋光性和立體化學（一）氨基酸的旋光性和

22、立體化學1.氨基酸的構型氨基酸的構型氨基酸構型：氨基酸構型：L型、型、D型型。除了蘇、異亮有除了蘇、異亮有四四種光學異構體種光學異構體,甘氨酸只為甘氨酸只為L型外，其余型外，其余17種氨基種氨基酸有酸有兩兩種光學異構體：種光學異構體：L型、型、D型。構成蛋白質的氨基酸均屬型。構成蛋白質的氨基酸均屬L-型。型。外消旋物：外消旋物：D-型和型和L-型的等摩爾混合物。型的等摩爾混合物。 L-蘇和蘇和D-蘇組成消旋物；蘇組成消旋物；L-別別-蘇和蘇和D-別別-蘇組成消旋物。蘇組成消旋物。2.氨基酸的旋光性氨基酸的旋光性氨基酸的旋光性（符號和大小）取決于它的氨基酸的旋光性（符號和大?。┤Q于它的R基的性

23、質，并與溶液基的性質，并與溶液的的pH值有關。比旋是值有關。比旋是氨基酸的物理常數(shù)之一，蛋白質中氨基酸的物理常數(shù)之一，蛋白質中L型氨型氨基酸的比旋光度見表基酸的比旋光度見表2-3。Gly無手性無手性C，無旋光性無旋光性; H2NCHCOOHH（二（二) )氨基酸的光譜性質氨基酸的光譜性質氨基酸的光吸收性氨基酸的光吸收性 20種基本氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，在紅外區(qū)和遠紫外區(qū)有種基本氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，在紅外區(qū)和遠紫外區(qū)有光吸收。在近紫外區(qū)（光吸收。在近紫外區(qū)（200-400nm）只有芳香族氨基酸（只有芳香族氨基酸（ Tyr、Phe、Trp的的R基含有共軛雙鍵）有光吸收?；泄曹?/p>

24、雙鍵）有光吸收。 （nm） Tyr 275 1.4103 Phe 257 2.0102 Trp 280 5.6103 蛋白質在蛋白質在280nm有最大紫外吸收光吸收，有最大紫外吸收光吸收， 分光光度法鑒定。分光光度法鑒定。 核磁共振（核磁共振（NMR）：）：在在aa和和Pro化學化學 表征方面起重要作用。表征方面起重要作用。知識鏈接知識鏈接 核磁共振核磁共振( (NMR)是電磁波（無線電波）與原子核自旋相互作用的一種基本物是電磁波（無線電波）與原子核自旋相互作用的一種基本物理現(xiàn)象。理現(xiàn)象。NMR 波譜學具有最高的頻率分辨率。近年來越來越多的化學家、波譜學具有最高的頻率分辨率。近年來越來越多的化

25、學家、生物學家和醫(yī)學家涉足其中。生物學家和醫(yī)學家涉足其中。 目前生物目前生物NMR波譜學研究的前沿領域包括：波譜學研究的前沿領域包括：1. 生物分子三維結構的生物分子三維結構的NMR測定方法和應用測定方法和應用2. 生物分子相互作用、動力學及其與功能的關系研究方法和應用生物分子相互作用、動力學及其與功能的關系研究方法和應用3. 基于基于NMR的代謝組學研究方法和應用的代謝組學研究方法和應用4. 4. 生物組織的高分辨生物組織的高分辨NMR分析方法和應用分析方法和應用 l中國科學技術大學生命科學學院核磁共振波譜實驗室中國科學技術大學生命科學學院核磁共振波譜實驗室：主要用多維核磁共振波譜及計算生物

26、學研究與重大疾病或重要生理功能相關的蛋白質結構,動力學與功能關系,以及蛋白質相互作用。 蛋白質因含有這些氨基酸，所以也有紫外吸收蛋白質因含有這些氨基酸，所以也有紫外吸收能力，一般在能力，一般在280nm波長波長處有最大光吸收，因此處有最大光吸收，因此能利用紫外吸收法鑒定并測定樣品中蛋白質的能利用紫外吸收法鑒定并測定樣品中蛋白質的含量。含量。八、氨基酸混合物的分離和分析八、氨基酸混合物的分離和分析 層析法也稱色譜法，是層析法也稱色譜法，是19031903年俄國植物學家年俄國植物學家Michael Michael TswettTswett發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過裝填有吸發(fā)現(xiàn)并命名的。他

27、將植物葉子的色素通過裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開，由此得名為帶而被分開，由此得名為“色譜法色譜法”（Chromatography) Chromatography) 。 后來無色物質也可利用吸附柱層析分離。后來無色物質也可利用吸附柱層析分離。 19441944年出現(xiàn)紙層析。年出現(xiàn)紙層析。 以后層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)氣相層析、高壓液相層析、以后層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)氣相層析、高壓液相層析、薄層層析、親和層析、凝膠層析等。薄層層析、親和層析、凝膠層析等。層析法的基本原理l層析法是利用混合物中各組分物理化學性

28、質的差異層析法是利用混合物中各組分物理化學性質的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流動相）中的分固定相；另一相流過固定相，稱為流動相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動而達布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動而達到分離的目的。到分離的目的。（一）基于分配系數(shù)差異的分離方法（一）基于分配系數(shù)差異的分離方法分配層析法分配層析法 分配系數(shù)分配系數(shù)Kd=CACBCA：一種物質在：一種物質在A相（流動相）中的濃度相

29、（流動相）中的濃度CB：一種物質在：一種物質在B相（固定相）中的濃度相（固定相）中的濃度 原理：主要根據(jù)被分析的樣品（如原理：主要根據(jù)被分析的樣品（如aaaa混合物）在兩種互混合物）在兩種互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同而達到分離的目的。不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同而達到分離的目的。 固定相和流動相固定相和流動相 混合物在層析系統(tǒng)中的分離決定于該混合物的組分在混合物在層析系統(tǒng)中的分離決定于該混合物的組分在兩相中的分配情況。兩相中的分配情況。1 1、柱層析、柱層析 層析柱中的填充劑或支持劑表面附著一層結合水作為固定相，沿固定相流過的與它互不相溶的溶劑是流動相。當用洗脫劑洗脫時，柱上端的氨基酸混合物

30、在兩相之間會按不同的分配系數(shù)以不同的速度向下移動。分步收集層析柱下端的洗脫液，然后分別用茚三酮顯色定量，以氨基酸量對洗脫液體積作圖得洗脫曲線，曲線中的每個峰相當于某一種氨基酸。加洗脫劑氨基酸樣品支持劑層析柱分部收集1.00.50.1光吸收值 20 40 60 80 100 120 流出液（毫升）2、紙層析、紙層析 固定相：固定相：濾紙纖維素上吸附的水 流動相：流動相：展層用的溶劑層析時，混合氨基酸在這兩相中不斷分配，使它們分布在濾紙的不同位置上?；静襟E：點樣、展層、顯色、定性（定量）基本步驟：點樣、展層、顯色、定性（定量） 層析時，將樣品點在濾紙的一個角上，稱為原點。然后將其放入一個密閉的容

31、器中，用一種溶劑系統(tǒng)進行展層，當溶劑展層至距濾紙上沿1cm時（約要40分鐘），取出濾紙，作好前沿位置標記后，烘干濾紙（1分鐘） 。向濾紙上噴茚三酮顯色液至顯色，就會在濾紙上出現(xiàn)各種氨基酸的斑點。丁醇-醋酸 氨基酸的濾紙層析圖譜 由于各種氨基酸具有不同的遷移率（由于各種氨基酸具有不同的遷移率（ Rf ），因此它們就會彼此分開。），因此它們就會彼此分開。將各顯色斑點的將各顯色斑點的Rf值與標準氨基酸的值與標準氨基酸的Rf值比較，可得知該斑點的成分值比較，可得知該斑點的成分 。溶劑前沿氨基酸顯色點濾紙原點XY濾紙層析中的Rf值，Rf =X/Y 斑點到原點（點樣處）的距離斑點到原點（點樣處）的距離 Rf = - 溶劑前沿到原點之間的距離溶劑前沿到原點之間的距離3、薄層層析（thin-layer chromatography)：基本步驟：基本步驟： 鋪板、點樣、展