常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用

1、分子生物學(xué)分子生物學(xué) MOLECULAR BIOLOGY常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology第一節(jié)第一節(jié)分子雜交與印跡技術(shù)分子雜交與印跡技術(shù)Molecular Hybridization and Blotting Technique一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理DNA變性：變性： 雙鏈雙鏈DNA在各種理化因素作用下變?yōu)閱捂湹倪^在各種理化因素作用下變?yōu)閱捂湹倪^程。程。 本質(zhì)是堿基對之間的氫鍵斷裂。

2、本質(zhì)是堿基對之間的氫鍵斷裂。DNA復(fù)性：復(fù)性： 去除變性條件，變性去除變性條件，變性DNA重新形成雙鏈的過程。重新形成雙鏈的過程。常用變性條件：常用變性條件： 加熱加熱分子雜交：分子雜交： 不同來源的單鏈核苷酸鏈根據(jù)堿基互補(bǔ)原則形成不同來源的單鏈核苷酸鏈根據(jù)堿基互補(bǔ)原則形成雜種雙鏈的過程。雜種雙鏈的過程。分子雜交的目的：分子雜交的目的： 檢測檢測DNA和和RNA 探針：探針： 分子雜交中和待測核苷酸鏈堿基互補(bǔ)的被標(biāo)記的分子雜交中和待測核苷酸鏈堿基互補(bǔ)的被標(biāo)記的核苷酸鏈。核苷酸鏈。堿基對間氫鍵堿基對間氫鍵探針探針待測待測DNA或或RNA增色效應(yīng)：增色效應(yīng)： DNA變性伴隨變性伴隨260nm吸收值

3、增高吸收值增高減色效應(yīng)：減色效應(yīng)： DNA復(fù)性伴隨復(fù)性伴隨260nm吸收值降低吸收值降低原因：原因： 鹼基中共軛雙鍵的暴露鹼基中共軛雙鍵的暴露Tm值值:分子雜交的方法分子雜交的方法 : （固（固液雜交）液雜交） 1. 斑點雜交：斑點雜交： 提取提取DNA或或RNA，直接點在硝酸纖維素膜上，和探針雜交，直接點在硝酸纖維素膜上，和探針雜交 檢查有沒有你所要的檢查有沒有你所要的DNA或或RNA硝酸纖維素膜硝酸纖維素膜待測待測DNA或或RNA 雜交液雜交液探針探針1234Slot blotDot blot反向斑點雜交反向斑點雜交 固相：多種探針序列固相：多種探針序列 液相：一種待測樣品液相：一種待測樣

4、品(標(biāo)記）標(biāo)記） DNA點陣：點陣： 將多種探針序列成排的點在硝酸纖維素膜上，檢測將多種探針序列成排的點在硝酸纖維素膜上，檢測DNA或或RNA和那一個探針雜交。和那一個探針雜交。 待檢樣品進(jìn)行標(biāo)記待檢樣品進(jìn)行標(biāo)記 一種樣品多種探針一種樣品多種探針多種探針序列多種探針序列標(biāo)記待測核酸標(biāo)記待測核酸基因芯片基因芯片： 將更多的探針排列在硅片上，借助計算機(jī)檢測將更多的探針排列在硅片上，借助計算機(jī)檢測未知的未知的DNA或或RNA和那一個探針雜交和那一個探針雜交2.原位雜交原位雜交 組織固定技術(shù)與分子雜交技術(shù)結(jié)合組織固定技術(shù)與分子雜交技術(shù)結(jié)合 組織切片或細(xì)胞涂片原位雜交：組織切片或細(xì)胞涂片原位雜交： 將將

5、DNA或或RNA在組織切片和細(xì)胞涂片中變性和固定，和在組織切片和細(xì)胞涂片中變性和固定，和探針雜交探針雜交 確定確定DNA或或RNA在組織和細(xì)胞中的定位。在組織和細(xì)胞中的定位。 菌落或噬菌斑原位雜交：菌落或噬菌斑原位雜交： 基因工程中篩選陽性克隆?；蚬こ讨泻Y選陽性克隆。 3.3.轉(zhuǎn)移印跡技術(shù)轉(zhuǎn)移印跡技術(shù)電泳技術(shù)與分子雜交技術(shù)結(jié)合電泳技術(shù)與分子雜交技術(shù)結(jié)合電泳結(jié)果從凝膠轉(zhuǎn)移到固相膜上，稱之為電泳結(jié)果從凝膠轉(zhuǎn)移到固相膜上，稱之為 blotting blotting 膜上樣品再與探針雜交膜上樣品再與探針雜交 樣品中哪一個是目標(biāo)或樣品中哪一個是目標(biāo)或轉(zhuǎn)移印跡實驗轉(zhuǎn)移印跡實驗放放射射自自顯顯影影照照片片

6、濾紙濾紙凝膠凝膠硝酸纖維膜硝酸纖維膜印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用 Western Blotting常被用來檢測基因表達(dá)常被用來檢測基因表達(dá)1 2 3 41.正常細(xì)胞正常細(xì)胞2.正常細(xì)胞正常細(xì)胞/凋亡素凋亡素3.腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞4.腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞/凋亡素凋亡素細(xì)胞核內(nèi)的熱休克蛋白細(xì)胞核內(nèi)的熱休克蛋白70 1 2 3 4第二節(jié)第二節(jié)核酸序列分析核酸序列分析Nucleic Acid Sequence Analysisn核酸序列分析的基本原理：核酸序列分析的基本原理： 化學(xué)裂解法化學(xué)裂解法 (Maxam-Gillbert(Maxam-Gillbert法法) ) DNADNA鏈的末端合成終

7、止法鏈的末端合成終止法 (Sanger(Sanger法法) )Frederick Sanger蛋白質(zhì)測序技術(shù)獲年諾貝爾化學(xué)獎蛋白質(zhì)測序技術(shù)獲年諾貝爾化學(xué)獎測序技術(shù)獲年諾貝爾化學(xué)獎測序技術(shù)獲年諾貝爾化學(xué)獎一、一、DNADNA鏈末端合成終止法鏈末端合成終止法運用復(fù)制的原理運用復(fù)制的原理 底物中加入雙脫氧核糖核苷酸底物中加入雙脫氧核糖核苷酸合成引物用同位素標(biāo)記合成引物用同位素標(biāo)記n鏈末端合成終止法測定鏈末端合成終止法測定DNA序列的原理序列的原理負(fù)極負(fù)極53合成鏈合成鏈模板鏈模板鏈ddG ddA ddT ddCC GG CT AG CT AA TC GC GG CT AT A53正極正極二、二、DN

8、A自動測序自動測序采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實現(xiàn)采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實現(xiàn)DNADNA序列分序列分析自動化的基礎(chǔ)。析自動化的基礎(chǔ)。用不同顏色熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸用不同顏色熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸合成時分合成時分4 4管分別合成，電泳時管分別合成，電泳時4 4管產(chǎn)物混合一起管產(chǎn)物混合一起 電泳后，通過四種激光激發(fā)熒光分子使之發(fā)射出電泳后，通過四種激光激發(fā)熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長熒光，四種不同波長熒光，檢測器采集熒光信號，并依此確定檢測器采集熒光信號，并依此確定DNADNA堿基的排堿基的排列順序。列順序。 第三節(jié)第三節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)Polymerase Chai

9、n ReactionKary Banks Mullis19831983年年 2727歲發(fā)明歲發(fā)明PCRPCR技術(shù)技術(shù) 1993年獲諾貝爾獎年獲諾貝爾獎5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA一、一、PCR技術(shù)的工作原理技術(shù)的工作原理5 5 5 5 5 5 5 5 Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 252530 30 次循環(huán)后，模板次循環(huán)后，模板DNADNA的含量的含量可以擴(kuò)大可以擴(kuò)大100100萬倍以上萬倍以上。 模板模板DNADNA 特異性引物特異性引物 耐熱耐熱DNADN

10、A聚合酶聚合酶 dNTPsdNTPs MgMg2+2+n PCRPCR體系基本組成成分體系基本組成成分n PCR的基本反應(yīng)步驟的基本反應(yīng)步驟變性變性9595C C延伸延伸7272C C退火退火Tm-5Tm-5C CPCRPCR是體外是體外DNADNA復(fù)制過程，最原始的目的是擴(kuò)增復(fù)制過程，最原始的目的是擴(kuò)增DNA.DNA.RNARNA可以經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為可以經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為DNA,DNA,再用再用PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增（二）目的基因的克?。ǘ┠康幕虻目寺DNAcDNA文庫或基因組文庫中克隆基因文庫或基因組文庫中克隆基因真核基因在原核表達(dá)時用真核基因在原核表達(dá)時用RT-PCRRT-PCR擴(kuò)增擴(kuò)增mRNAm

11、RNA二、二、PCR技術(shù)技術(shù)的主要用途的主要用途（一）微量（一）微量DNA和和RNA的擴(kuò)增的擴(kuò)增利用利用PCRPCR技術(shù)可以隨意設(shè)計引物在體外對目的技術(shù)可以隨意設(shè)計引物在體外對目的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點突變等改造。基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點突變等改造。 （三）基因突變（三）基因突變TGC將將PCRPCR技術(shù)引入技術(shù)引入DNADNA序列測定，使測序工序列測定，使測序工作大為簡化，也提高了測序的速度；作大為簡化，也提高了測序的速度；待測待測DNADNA片段既可克隆到特定的載體后進(jìn)片段既可克隆到特定的載體后進(jìn)行序列測定，也可直接測定。行序列測定，也可直接測定。PCRPCR與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大

12、提高基與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測的敏感性因突變檢測的敏感性 。（四）（四）DNA序列測定序列測定（五）基因突變分析（五）基因突變分析逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCRPCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)RT-PCR)是將是將RNARNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCRPCR反應(yīng)聯(lián)合反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。應(yīng)用的一種技術(shù)。RT-PCRRT-PCR是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因以及對已知序列的以及對已知序列的RNARNA進(jìn)行定性及半定量分析進(jìn)行定性及半定量分析的最有效方法。的

13、最有效方法。 （一）逆轉(zhuǎn)錄（一）逆轉(zhuǎn)錄PCRPCR技技術(shù)術(shù)三、幾種重要的三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)衍生技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄法逆轉(zhuǎn)錄法方案：方案：AAnATTnT 55mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA3TTnTAAnA核糖核糖核酸酶核酸酶H HTTnT3DNA poly IcDNA核酸酶核酸酶S1S1雙鏈雙鏈cDNAcDNA35 35 5加熱變性加熱變性加入特異性引物加入特異性引物DNADNA聚合酶聚合酶重復(fù)上述步驟重復(fù)上述步驟擴(kuò)增出大量的產(chǎn)物擴(kuò)增出大量的產(chǎn)物PCR用于檢測在用于檢測在mRNA 水平上的基因表達(dá)差異水平上的基因表達(dá)差異要防止擴(kuò)增效率不同產(chǎn)生的誤差要防止擴(kuò)增效率不同產(chǎn)生的誤差要管家

14、基因作內(nèi)對照要管家基因作內(nèi)對照原位原位PCR(in situ PCR)PCR(in situ PCR)是在組織切片或細(xì)胞涂是在組織切片或細(xì)胞涂片上的單個細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的片上的單個細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的PCRPCR反應(yīng)，然后用特異反應(yīng)，然后用特異性探針進(jìn)行原位雜交，即可檢出待測性探針進(jìn)行原位雜交，即可檢出待測DNADNA或或RNARNA是否在該組織或細(xì)胞中存在。是否在該組織或細(xì)胞中存在。原位原位PCRPCR方法彌補(bǔ)了方法彌補(bǔ)了PCRPCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)的技術(shù)和原位雜交技術(shù)的不足，是將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合的一不足，是將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合的一種最佳方法。種最佳方法。（二）原位（二）原位PCRPC

15、R技術(shù)技術(shù)固定組織或細(xì)胞固定組織或細(xì)胞蛋白酶蛋白酶K消化處理消化處理PCR擴(kuò)增擴(kuò)增原位雜交原位雜交顯微鏡觀察結(jié)果顯微鏡觀察結(jié)果基本方法基本方法（三）實時（三）實時PCRPCR技術(shù)技術(shù)實時實時PCR(real-time PCR)PCR(real-time PCR)又稱熒光定量又稱熒光定量PCRPCR，是指在是指在PCRPCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個信號積累實時監(jiān)測整個PCRPCR進(jìn)程，使每一個循環(huán)變得進(jìn)程，使每一個循環(huán)變得“可見可見”，最后通過外標(biāo)準(zhǔn)對樣品中的最后通過外標(biāo)準(zhǔn)對樣品中的DNA (or cDNA) DNA (or cDNA)

16、 的起的起始濃度進(jìn)行定量的方法。始濃度進(jìn)行定量的方法。5533d.NTPsThermal Stable DNA PolymerasePrimers5353535353535353Add Master Mix and SampleDenaturation535353535353AnnealingReaction TubeTaql53RQProbe53RQ定量定量PCRPCR示意圖示意圖535353RQExtension Step531. Strand DisplacementTaq3QR5533QTaqR52. Cleavage3. PolymerizationComplete53QTaqR35

17、4. Detection533QTaqR5lR定量定量PCR示意圖示意圖反向反向PCRPCR逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄PCRPCR原位原位PCRPCR重組重組PCRPCR不對稱不對稱PCRPCR多重多重PCRPCRPCRPCR衍生技術(shù)衍生技術(shù)錨定錨定PCRPCR巢式巢式PCRPCR免疫免疫PCRPCR連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實時實時PCRPCR遞減遞減PCR PCR 第四節(jié)第四節(jié)基因文庫基因文庫Gene Library 基因組基因組DNADNA文庫文庫 (genomic DNA library)(genomic DNA library) cDNAcDNA文庫文庫(cDNA library)(cDNA l

18、ibrary) n基因文庫基因文庫( (gene library)是指一個包含了某一生物體全部是指一個包含了某一生物體全部DNADNA序列序列的克隆群體。的克隆群體。一、基因組一、基因組DNA文庫文庫基因組基因組DNADNA文庫是指生物的基因組文庫是指生物的基因組DNADNA的信的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNADNA片段片段形式貯存的克隆群體。形式貯存的克隆群體。 用于構(gòu)建基因組文庫的載體有用于構(gòu)建基因組文庫的載體有 噬菌體、噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。粘粒和酵母人工染色體等。cDNAcDNA文庫是包含某一組織細(xì)胞在一定條文庫是包含某一組織細(xì)胞

19、在一定條件下所表達(dá)的全部件下所表達(dá)的全部mRNAmRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的cDNAcDNA序列的克隆群體，它以序列的克隆群體，它以cDNAcDNA片段的形式片段的形式貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。 二、二、cDNA文庫文庫n基因組文庫和基因組文庫和cDNA文庫的構(gòu)建和篩選文庫的構(gòu)建和篩選第五節(jié)第五節(jié)生物芯片技術(shù)生物芯片技術(shù)Biological Chip Technique一、生物芯片的概念一、生物芯片的概念 指通過微電子、微加工技術(shù)在平方厘米指通過微電子、微加工技術(shù)在平方厘米大小的固相介質(zhì)表面構(gòu)建的微型分析系統(tǒng)，大小的固相介質(zhì)表面構(gòu)建的微型分析系

20、統(tǒng)， 以實現(xiàn)對組織細(xì)胞中以實現(xiàn)對組織細(xì)胞中DNADNA、蛋白質(zhì)及其、蛋白質(zhì)及其他生物組分的快速、高效、敏感地處理與分他生物組分的快速、高效、敏感地處理與分析。析。 生物芯片（生物芯片（biochipbiochip）信息芯片：信息芯片： 將與生命相關(guān)的信息分子高度集成，來實現(xiàn)對基因、蛋將與生命相關(guān)的信息分子高度集成，來實現(xiàn)對基因、蛋白等生物活性物質(zhì)進(jìn)行高通量的檢測與分析白等生物活性物質(zhì)進(jìn)行高通量的檢測與分析 基因芯片（基因芯片（ DNADNA芯片）芯片） 蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片 組織芯片組織芯片 細(xì)胞芯片細(xì)胞芯片 功能芯片（微流體芯片功能芯片（微流體芯片） 在芯片上完成生命科學(xué)研究中樣品的分離、擴(kuò)

21、增、生化在芯片上完成生命科學(xué)研究中樣品的分離、擴(kuò)增、生化反應(yīng)等功能反應(yīng)等功能 生物樣品制備芯片生物樣品制備芯片 核酸擴(kuò)增芯片核酸擴(kuò)增芯片 毛細(xì)管電泳芯片毛細(xì)管電泳芯片 將許多特定的將許多特定的DNADNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上的支持物上與待測的熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交與待測的熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交用熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進(jìn)行掃描，通過計算機(jī)系統(tǒng)對每用熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進(jìn)行掃描，通過計算機(jī)系統(tǒng)對每一位點的熒光信號做出檢測、比較和分析，從而迅速得出定性一位點的熒光信號做出檢測、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作該

22、技術(shù)亦被稱作DNADNA微陣列微陣列(DNA microarray(DNA microarray)。 一、基因芯片一、基因芯片n基因芯片基因芯片(gene chip)n基因芯片工作流程示意圖基因芯片工作流程示意圖生物戰(zhàn)劑檢測生物戰(zhàn)劑檢測 臨床疾病的臨床疾病的 基因診斷基因診斷法醫(yī)學(xué)鑒定法醫(yī)學(xué)鑒定藥物研究開發(fā)藥物研究開發(fā)動植物檢疫動植物檢疫 基因組研究基因組研究后基因組計劃后基因組計劃生物信息學(xué)生物信息學(xué)基因芯片基因芯片基因芯片技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域基因芯片技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⒏叨让芗帕械牡鞍追肿幼鳛樘结橖c陣固定在將高度密集排列的蛋白分子作為探針點陣固定在固相支持物上，固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白樣品反應(yīng)時

23、，可捕獲樣品中的靶蛋當(dāng)與待測蛋白樣品反應(yīng)時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)n蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片(protein chip)n蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片作用原理作用原理第六節(jié)第六節(jié)生物大分子相互作用研究技術(shù)生物大分子相互作用研究技術(shù) The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù) 酵母雙雜交酵母雙雜交 各

24、種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等）各種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等）n常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實驗是基于親和色譜原理的、標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實驗是基于親和色譜原理的、分析分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用蛋白質(zhì)體外直接相互作用的方法。的方法。（一）標(biāo)簽蛋白沉淀（一）標(biāo)簽蛋白沉淀標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實驗主要用于證明兩種蛋白分標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實驗主要用于證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結(jié)合子是否存在直接物理結(jié)合分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位篩選細(xì)胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子。篩選細(xì)胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子。 標(biāo)簽融

25、合標(biāo)簽融合蛋白沉淀蛋白沉淀實驗流程實驗流程示意圖示意圖(二）酵母雙雜交技術(shù)的基本原理和用途 酵母雙雜交系統(tǒng)的建立基于對真核生物轉(zhuǎn)錄激酵母雙雜交系統(tǒng)的建立基于對真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)構(gòu)與功能的認(rèn)識活因子結(jié)構(gòu)與功能的認(rèn)識 真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子DNADNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域BDAD組件式：結(jié)構(gòu)可互相分開組件式：結(jié)構(gòu)可互相分開 功能互相獨立功能互相獨立 空間較近時表現(xiàn)活性空間較近時表現(xiàn)活性 中間序列對活性無影響中間序列對活性無影響報告基因報告基因 在在GAL4GAL4結(jié)合的順式作用元件下游需連接報告基因結(jié)合的順式作用元件下游需連接報告基因。 目前應(yīng)用最

26、多的報告基因是目前應(yīng)用最多的報告基因是LacZLacZ基因，表達(dá)后能基因，表達(dá)后能在在X-GalX-Gal培養(yǎng)基上產(chǎn)生藍(lán)色菌落。培養(yǎng)基上產(chǎn)生藍(lán)色菌落。 其次是其次是HisHis基因，表達(dá)后能使酵母菌在缺少組氨基因，表達(dá)后能使酵母菌在缺少組氨酸的培養(yǎng)基中生長。酸的培養(yǎng)基中生長。 現(xiàn)在多提倡兩種報告基因同時應(yīng)用，顏色篩選和現(xiàn)在多提倡兩種報告基因同時應(yīng)用，顏色篩選和營養(yǎng)缺陷篩選同時進(jìn)行，以降低假陽性的出現(xiàn)營養(yǎng)缺陷篩選同時進(jìn)行，以降低假陽性的出現(xiàn) 表達(dá)表達(dá)電泳遷移率變動測定電泳遷移率變動測定(EMSA)(EMSA)或稱凝膠遷移變動實或稱凝膠遷移變動實驗驗(gel shift assay)(gel sh

27、ift assay)用于研究用于研究DNADNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)結(jié)合蛋白與相應(yīng)DNADNA序列間的相互作序列間的相互作用用可用于定性和定量分析，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究可用于定性和定量分析，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法的經(jīng)典方法也被用于研究也被用于研究RNARNA結(jié)合蛋白和特定結(jié)合蛋白和特定RNARNA序列間的相序列間的相互作用。互作用。二、二、DNA-蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù)蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù)（一）電泳遷移率變動測定（一）電泳遷移率變動測定放放射射自自顯顯影影未結(jié)合探針未結(jié)合探針結(jié)合有蛋白的探針結(jié)合有蛋白的探針標(biāo)記探針標(biāo)記探針1X1X1X1X核蛋白提取物核蛋白提取物1X10X10X未標(biāo)

28、記探針未標(biāo)記探針10Xn凝膠遷移實驗結(jié)果示意圖凝膠遷移實驗結(jié)果示意圖染 色 質(zhì) 免 疫 沉 淀 技 術(shù)染 色 質(zhì) 免 疫 沉 淀 技 術(shù)( c h r o m a t i n ( c h r o m a t i n immunoprecipitation assay, ChIP)immunoprecipitation assay, ChIP)是目前可以研究體是目前可以研究體內(nèi)內(nèi)DNADNA與蛋白質(zhì)相互作用的主要方法。與蛋白質(zhì)相互作用的主要方法。（二）染色質(zhì)免疫沉淀法（二）染色質(zhì)免疫沉淀法n染色質(zhì)免疫沉淀實驗流程及結(jié)果示意圖染色質(zhì)免疫沉淀實驗流程及結(jié)果示意圖遺傳修飾動物模型的建立及應(yīng)用遺傳修飾動

29、物模型的建立及應(yīng)用The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model 第七節(jié)第七節(jié)n轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使目的基因整合入受精采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使目的基因整合入受精卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，然后將細(xì)胞導(dǎo)入動物子卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，然后將細(xì)胞導(dǎo)入動物子宮，使之發(fā)育成個體。宮，使之發(fā)育成個體。 轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因被導(dǎo)入的目的基因被導(dǎo)入的目的基因轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因動物(transgenic animal)(transgenic animal)目的基因的受體動物目的基因的受體動物一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)n核轉(zhuǎn)移技術(shù)核

30、轉(zhuǎn)移技術(shù) 即動物整體克隆技術(shù)，將動物的一即動物整體克隆技術(shù)，將動物的一個體細(xì)胞核全部導(dǎo)入另一個體的去胞核個體細(xì)胞核全部導(dǎo)入另一個體的去胞核的的激活的卵細(xì)胞內(nèi)，使之發(fā)育成個體，的的激活的卵細(xì)胞內(nèi)，使之發(fā)育成個體，即克隆即克隆(clone)(clone)。二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)n基因剔除技術(shù)基因剔除技術(shù)( (gene knock out) 也稱基因靶向也稱基因靶向(gene targeting)(gene targeting)滅活，滅活，有目的去除動物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。有目的去除動物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。三、基因剔除技術(shù)三、基因剔除技術(shù) 基因剔除操作過程與機(jī)制基因剔除操作過程與機(jī)制1. 1.

31、 構(gòu)建基因打靶載體構(gòu)建基因打靶載體 2. 2. 將重組載體轉(zhuǎn)入小鼠胚胎干細(xì)胞將重組載體轉(zhuǎn)入小鼠胚胎干細(xì)胞 將重組載體轉(zhuǎn)入小鼠胚胎干細(xì)胞中靶的將重組載體轉(zhuǎn)入小鼠胚胎干細(xì)胞中靶的ESES細(xì)胞移入胚泡，胚泡植入子宮，篩選嵌合體小細(xì)胞移入胚泡，胚泡植入子宮，篩選嵌合體小鼠鼠 n建立動物模型建立動物模型 單基因決定疾病模型單基因決定疾病模型 基因剔除基因剔除獲得性突變獲得性突變(gain-of-function mutation)(gain-of-function mutation) 多基因決定疾病模型多基因決定疾病模型四、基因轉(zhuǎn)移和基因剔除在醫(yī)學(xué)四、基因轉(zhuǎn)移和基因剔除在醫(yī)學(xué)發(fā)展中的作用發(fā)展中的作用第八

32、節(jié)第八節(jié)疾病相關(guān)基因的克隆與鑒定疾病相關(guān)基因的克隆與鑒定Cloning and Identification of Disease Relative Genes克隆疾病相關(guān)基因的策略克隆疾病相關(guān)基因的策略（一）功能性克?。ㄒ唬┕δ苄钥寺? (functional cloning) )（二）定位克?。ǘ┒ㄎ豢寺?positional cloning)（三）非定位候選基因克隆策略（三）非定位候選基因克隆策略(position- independent candidate gene approaches)（四）定位候選基因克隆策略（四）定位候選基因克隆策略(positional candidate

33、 gene approaches )n定義定義 通過對一種致病基因功能的了解來克隆該致通過對一種致病基因功能的了解來克隆該致病基因。病基因。（一）功能克?。ㄒ唬┕δ芸寺應(yīng)用應(yīng)用 生化機(jī)制已明確、基因表達(dá)產(chǎn)物較易得到純化生化機(jī)制已明確、基因表達(dá)產(chǎn)物較易得到純化的遺傳性疾病的遺傳性疾病。利用蛋白質(zhì)的表達(dá)及功能信利用蛋白質(zhì)的表達(dá)及功能信息息抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)提純蛋白質(zhì)提純蛋白質(zhì)制備抗體制備抗體建立建立 cDNA文庫文庫陽性克隆陽性克隆提取重組體提取重組體篩選篩選測序測序氨基酸序列信息：氨基酸序列信息：氨基酸序列氨基酸序列設(shè)計寡核苷酸探針設(shè)計寡核苷酸探針（簡并密碼）（簡并密碼）cDNA文庫文庫

34、陽性克隆陽性克隆序列分析序列分析篩選篩選提取重組體提取重組體利用酵母系統(tǒng)從功能學(xué)角度鑒定致病基因。利用酵母系統(tǒng)從功能學(xué)角度鑒定致病基因。用不同人的用不同人的DNADNA片段轉(zhuǎn)化與人類遺傳疾病具有類似表型的片段轉(zhuǎn)化與人類遺傳疾病具有類似表型的突變酵母突變酵母可以恢復(fù)可以恢復(fù)(rescue)(rescue)正常表型的片段正常表型的片段中所含有的基因中所含有的基因即可即可能為致病基因能為致病基因這 種 實 驗 稱 為這 種 實 驗 稱 為 功 能 互 補(bǔ) 試 驗功 能 互 補(bǔ) 試 驗 ( f u n c t i o n a l ( f u n c t i o n a l complementatio

35、n assay)complementation assay)。表型與人類疾病相似的酵母突變株表型與人類疾病相似的酵母突變株表型恢復(fù)正常表型恢復(fù)正常人類正常基因人類正?；颍ǘ┒ㄎ豢寺。ǘ┒ㄎ豢寺定義定義從一種致病基因的染色體定位出發(fā)逐步縮小范圍，從一種致病基因的染色體定位出發(fā)逐步縮小范圍，最后克隆該基因。最后克隆該基因。n系統(tǒng)的定位克隆工作系統(tǒng)的定位克隆工作 遺傳學(xué)分析遺傳學(xué)分析( (確定致病基因染色體定位確定致病基因染色體定位) )交換分析、連鎖不平衡分析交換分析、連鎖不平衡分析 分子生物學(xué)分析分子生物學(xué)分析 將病人的將病人的DNADNA和正常人的和正常人的DNA DNA 進(jìn)行雜交，進(jìn)

36、行雜交，去除相同部分，剩余部分既是致病基因去除相同部分，剩余部分既是致病基因利用基因在染色體位置的利用基因在染色體位置的信息信息杜氏肌營養(yǎng)不良致病基因的定位克?。憾攀霞I養(yǎng)不良致病基因的定位克?。?遺傳學(xué)家族連鎖分析將致病基因定位于遺傳學(xué)家族連鎖分析將致病基因定位于Xp21 病人染色體和正常人病人染色體和正常人X染色體雜交，染色體雜交， 去除能雜交的片段去除能雜交的片段 正常染色體上不能雜交的片段既是致病基因正常染色體上不能雜交的片段既是致病基因（三）非定位候選基因克隆策略（三）非定位候選基因克隆策略 由于基因組作圖的完成和分子病理學(xué)的發(fā)展，可由于基因組作圖的完成和分子病理學(xué)的發(fā)展，可以不依靠

37、染色體定位，直接根據(jù)病理學(xué)變化和對各種以不依靠染色體定位，直接根據(jù)病理學(xué)變化和對各種基因產(chǎn)物功能的了解，預(yù)測出候選致病基因?；虍a(chǎn)物功能的了解，預(yù)測出候選致病基因。根據(jù)致病基因的可能功能，檢測因特網(wǎng)基因庫中根據(jù)致病基因的可能功能，檢測因特網(wǎng)基因庫中的基因功能區(qū)將含有接近功能域的基因用于致病的改的基因功能區(qū)將含有接近功能域的基因用于致病的改變檢測。變檢測。（四）定位候選基因克隆策略（四）定位候選基因克隆策略當(dāng)致病基因的染色體定位確認(rèn)后，人們可當(dāng)致病基因的染色體定位確認(rèn)后，人們可以利用因特網(wǎng)上的基因網(wǎng)站所提供基因序列數(shù)以利用因特網(wǎng)上的基因網(wǎng)站所提供基因序列數(shù)據(jù)，鑒定出候選致病基因。據(jù)，鑒定出候選致

38、病基因?；蛟\斷和基因治療基因診斷和基因治療第九節(jié)第九節(jié)Gene Diagnosis and Gene Therapy基因變異致病類型基因變異致病類型內(nèi)源基因的變異內(nèi)源基因的變異基因結(jié)構(gòu)突變基因結(jié)構(gòu)突變基因表達(dá)異常基因表達(dá)異常外源基因的入侵外源基因的入侵特點特點針對性強(qiáng)針對性強(qiáng) 特異性強(qiáng)特異性強(qiáng)靈敏度高靈敏度高 適應(yīng)性強(qiáng)適應(yīng)性強(qiáng)基因診斷的概念和特點基因診斷的概念和特點定義定義利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)和方法，直接檢測術(shù)和方法，直接檢測基因結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)及其及其表達(dá)水平表達(dá)水平是否正常，從而對疾病作出診斷的方法。是否正常，從而對疾病作出診斷的方法?；蛟\

39、斷常用技術(shù)方法基因診斷常用技術(shù)方法（二）聚合酶鏈反應(yīng)（二）聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)（三）基因測序（三）基因測序（四）基因芯片（四）基因芯片（五）連鎖分析（五）連鎖分析（一）核酸分子雜交技術(shù)（一）核酸分子雜交技術(shù)疾病相關(guān)遺傳標(biāo)志的連鎖分析疾病相關(guān)遺傳標(biāo)志的連鎖分析連鎖：連鎖：同一條染色體上位置相鄰的基因被一起遺傳同一條染色體上位置相鄰的基因被一起遺傳而沒有發(fā)生重組。而沒有發(fā)生重組。連鎖分析連鎖分析：利用與致病基因相連的某些基因作為遺利用與致病基因相連的某些基因作為遺傳標(biāo)志，通過鑒定遺傳標(biāo)志的存在判斷個體是否傳標(biāo)志，通過鑒定遺傳標(biāo)志的存在判斷個體是否帶有致病基因。帶有致病基因。連鎖分析連鎖分析無需

40、了解致病基因的結(jié)構(gòu)和分子機(jī)制，適無需了解致病基因的結(jié)構(gòu)和分子機(jī)制，適用于由未知基因缺陷引起的遺傳性疾病用于由未知基因缺陷引起的遺傳性疾病間接診斷：沒有直接檢測致病基因間接診斷：沒有直接檢測致病基因無重組無重組發(fā)生重組發(fā)生重組用于連鎖分析的遺傳標(biāo)志用于連鎖分析的遺傳標(biāo)志 1.不同個體之間存在高度的多態(tài)性不同個體之間存在高度的多態(tài)性 多態(tài)性：在一個特定的基因座位上存在兩個以多態(tài)性：在一個特定的基因座位上存在兩個以上的等位基因，其中的任何一個等位基因在群體上的等位基因，其中的任何一個等位基因在群體中的頻率大于中的頻率大于1%。2.需要獲得足夠的家系成員樣本。需要獲得足夠的家系成員樣本。3.致病基因和

41、標(biāo)志基因連鎖，兩個基因的距離越近致病基因和標(biāo)志基因連鎖，兩個基因的距離越近越好。越好。限制性片段長度多態(tài)性限制性片段長度多態(tài)性 限制性內(nèi)切酶識別特定限制性內(nèi)切酶識別特定DNA序列并在此序列內(nèi)序列并在此序列內(nèi)切斷切斷DNA 單個鹼基突變可丟失或獲得限制性內(nèi)切酶的切單個鹼基突變可丟失或獲得限制性內(nèi)切酶的切點點 切割片段長度不同，電泳分開切割片段長度不同，電泳分開 限制性片段長度多態(tài)性與致病的基因連鎖分析限制性片段長度多態(tài)性與致病的基因連鎖分析GAATTCCTTAAGGAATTTCTTAAARLFPRLFP分析法分析法Mst酶切位點酶切位點(GCTNAGG)5 3 正?；蛘；? 3 突變基因突

42、變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突變攜帶者突變攜帶者患者患者鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析PCR/PCR/單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(single strand conformation (single strand conformation polymorphism, SSCP)polymorphism, SSCP)PCRPCR產(chǎn)物變性后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，產(chǎn)物變性后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，正?；蚝妥儺惢虻倪w移位置不同，借此正常基因和變異基因的遷移位置不同，借此可分析確定致病基因的存在?？煞治龃_定致病基因的存在。 正常人正常人純合突變純合突變雜合突變雜合突變Leber 病患者病患者 PCR/SSCP分析分析+短串聯(lián)重復(fù)序列（短串聯(lián)重復(fù)序列（STR） 人類基因組人類基因組25% 為重復(fù)序列為重復(fù)序列 衛(wèi)星衛(wèi)星DNA