百令拮抗環(huán)孢素A腎毒性

1、1百令拮抗環(huán)孢素A腎毒性的研究2概 述 隨著器官移植手術(shù)的成熟和新型免疫抑制劑的開發(fā)隨著器官移植手術(shù)的成熟和新型免疫抑制劑的開發(fā), ,器官移植的早期成功率得到明顯提高器官移植的早期成功率得到明顯提高。 CsACsA的應(yīng)用使器官移植的急性排斥發(fā)生率明顯降低的應(yīng)用使器官移植的急性排斥發(fā)生率明顯降低, ,然然而其毒性作用限制了它在慢性排斥中的長期應(yīng)用而其毒性作用限制了它在慢性排斥中的長期應(yīng)用, ,防防治治CsACsA毒性的藥物學(xué)研究具有重要意義毒性的藥物學(xué)研究具有重要意義。3Patient survival after first cadaver graft; all patients (repro

2、duced by permission of the European Renal Association)腎移植長期存活率腎移植長期存活率 第一次尸腎移植的第一次尸腎移植的1010年生存率年生存率歐洲腎病學(xué)會資料4腎移植長期存活率腎移植長期存活率活體供腎與尸腎活體供腎與尸腎5 5年生存率比較年生存率比較 1984-20001984-2000年共年共10671067例例, , 尸腎尸腎645645例例, ,活體腎活體腎422422例例, , 免疫抑制劑免疫抑制劑:1984-1997:1984-1997年為年為 CsACsA + P + ZAZ( + P + ZAZ(或無或無) )方案方案 19

3、97-20001997-2000年為年為 CsACsA + P + MMF. + P + MMF. 美國美國Massachusetts General HospitalMassachusetts General Hospital5 40% 27% 6% 3% 11% 5% 8%Causes of graft loss over 10 years in CsA-treated patients6缺缺 血血 排異反應(yīng)排異反應(yīng)CsA移植物損傷移植物損傷PDGFFGFATGF-1細(xì)胞外基質(zhì)聚積細(xì)胞外基質(zhì)聚積 組織纖維化組織纖維化細(xì)胞增殖細(xì)胞增殖 慢性排異慢性排異慢性移植性腎病慢性移植性腎病內(nèi)皮細(xì)胞損傷

4、內(nèi)皮細(xì)胞損傷凝血凝血高血壓高血壓血液動力血液動力學(xué)改變學(xué)改變CsACsA致慢性移植腎病的機(jī)制致慢性移植腎病的機(jī)制7* 腎臟及全身的血管收縮腎臟及全身的血管收縮* * 內(nèi)皮素的釋放增加內(nèi)皮素的釋放增加* * NO NO的產(chǎn)生減少的產(chǎn)生減少* * TGF-TGF- 的表達(dá)增加的表達(dá)增加環(huán)孢霉素腎毒性的主要機(jī)理環(huán)孢霉素腎毒性的主要機(jī)理8 是導(dǎo)致慢性環(huán)孢素中毒及間質(zhì)性纖維化的主要細(xì)胞因子是導(dǎo)致慢性環(huán)孢素中毒及間質(zhì)性纖維化的主要細(xì)胞因子 體內(nèi)及體外實驗均證實環(huán)孢霉素可以帶來體內(nèi)及體外實驗均證實環(huán)孢霉素可以帶來TGF-TGF- 1 1基因表基因表 達(dá)達(dá), ,環(huán)孢素的劑量與腎內(nèi)環(huán)孢素的劑量與腎內(nèi)TGF-TG

5、F- 增加的程度成正比。增加的程度成正比。 抗抗TGF-TGF- 1 1的抗體可以減輕或阻斷的抗體可以減輕或阻斷TGF-TGF- 1 1的致纖維化作用的致纖維化作用（KhannaKhanna 1999 1999） TGF-TGF- 拮抗劑（拮抗劑（PirfenidonePirfenidone ）可以保護(hù)腎臟免受環(huán)孢）可以保護(hù)腎臟免受環(huán)孢 素的毒性（素的毒性（Shihab2001Shihab2001）。）。TGF-TGF- 1 1的的mRNAmRNA可以明顯減少。可以明顯減少。 TGF- 1（Transforming growth factor 1）9以往的研究曾證實冬蟲夏草能防治環(huán)孢A的腎毒性

6、，促進(jìn)小管上皮細(xì)胞增生，提高肌酐清除率，減輕腎小管的萎縮及空泡變性。解放軍腎臟病研究所解放軍腎臟病研究所 南京大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院南京大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院J Nephrol DialyJ Nephrol Dialy Transplant 2003;9:322 Transplant 2003;9:32210一、體外試驗部分111.1.百令對體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞百令對體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞3 3H H摻入的影響；摻入的影響；2.2.環(huán)孢霉素與百令對體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞周期環(huán)孢霉素與百令對體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞周期的作用；的作用；3.3.環(huán)孢霉素對體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞環(huán)孢霉素對體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)

7、胞TGF- mRNATGF- mRNA表達(dá)的影響。表達(dá)的影響。研究內(nèi)容研究內(nèi)容J Nephrol DialyJ Nephrol Dialy Transplant 2003;9:322 Transplant 2003;9:322解放軍腎臟病研究所解放軍腎臟病研究所 12 1. 3H摻入結(jié)果不同劑量（不同劑量（0.32200 g/ml )0.32200 g/ml )百令作用后百令作用后腎小管腎小管細(xì)胞細(xì)胞3 3H H摻入量摻入量各各組與對照組相比較組與對照組相比較 * *:P0.05;:P0.05;* * *:P0.01:P0.010 0500050001000010000150001500020

8、0002000025000250000 00.320.321.61.68 84040200200百令劑量（微克/毫升）百令劑量（微克/毫升）3H DPM3H DPM*13 經(jīng)過重復(fù)驗證，得到相同的結(jié)果經(jīng)過重復(fù)驗證，得到相同的結(jié)果: :百令百令200 g/ml200 g/ml劑量組有劑量組有非常顯著非常顯著的促進(jìn)腎小的促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞管上皮細(xì)胞3 3H H 摻入的作用摻入的作用; ;40g/ml40g/ml和和8g/ml8g/ml有有顯著顯著的促進(jìn)的促進(jìn)3 3H H 摻入的作用，摻入的作用， 表明百令具有促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞增殖的功能表明百令具有促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞增殖的功能。 1. 3H摻入結(jié)果

9、14 15 g/ml環(huán)孢霉素和不同劑量百令對環(huán)孢霉素和不同劑量百令對HKC細(xì)胞周期的作用細(xì)胞周期的作用 *:P0.05, *:P0.01 versus CsA組組組別G2+M期(%)S期(%)對照組18.6 2.1528.61.1615 g/mlCsA34.6 2.437.93 1.9615 g/mlCsA5 g/ml百令34.8 1.428.3 0.115 g/mlCsA10 g/ml百令34.0 2.128.87 0.4215 g/mlCsA50 g/ml百令30.4 3.75*15.2 4.76*15 g/mlCsA100 g/ml百令32.9 2.78*12.4 1.96*2.細(xì)胞周期

10、作用的結(jié)果15 15g/mlCsA15g/mlCsA作用作用2424小時對小時對HKCHKC細(xì)胞周期細(xì)胞周期有非常明有非常明顯的影響，顯的影響，與對照組相比與對照組相比G2/MG2/M期細(xì)胞比例明顯上期細(xì)胞比例明顯上升，升，S S期細(xì)胞顯著減少（期細(xì)胞顯著減少（t t檢驗檢驗P P值均值均0.01)0.01)。 15g/mlCsA15g/mlCsA50g/ml50g/ml百令組及百令組及15g/mlCsA15g/mlCsA100g/ml100g/ml百令組百令組作用作用2424小時與小時與CsACsA組相比較組相比較S S期期 細(xì)胞比例上升，細(xì)胞比例上升，G2/MG2/M期細(xì)胞比例下降期細(xì)胞比

11、例下降, ,差異顯著差異顯著。2. 細(xì)胞周期作用的結(jié)果163.環(huán)孢霉素對體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞TGF- mRNA表達(dá)的影響 大鼠動物模型研究發(fā)現(xiàn)，大鼠動物模型研究發(fā)現(xiàn)，CsACsA誘導(dǎo)的血管病變誘導(dǎo)的血管病變可能與可能與TGF- TGF- 的表達(dá)密切相關(guān)，在小動脈透的表達(dá)密切相關(guān)，在小動脈透明樣變的病變位置明樣變的病變位置TGF-TGF-表達(dá)特別高。表達(dá)特別高。 百令及其提取液能降低小血管透明樣變性的發(fā)百令及其提取液能降低小血管透明樣變性的發(fā)生率，同時抑制生率，同時抑制TGF- TGF- 在小血管的表達(dá)。在小血管的表達(dá)。17初步結(jié)果初步結(jié)果 不同劑量環(huán)孢霉素對不同劑量環(huán)孢霉素對體外培養(yǎng)的血管內(nèi)

12、皮體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞TGF- TGF- 表達(dá)的影響（以管家基因表達(dá)的影響（以管家基因GAPDHGAPDH校正）校正）環(huán)孢霉素劑量環(huán)孢霉素劑量CalibratedCalibratedTGF- ExpressionTGF- ExpressionFold differenceFold difference0 00 01 10.1 g/ml0.1 g/ml0.050.051.0351.0350.2 g/ml0.2 g/ml0.630.631.551.550.4 g/ml0.4 g/ml0.1750.1750.90.90.8 g/ml0.8 g/ml0.2750.2750.780.783.3.環(huán)

13、孢霉素對體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞環(huán)孢霉素對體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞TGF- mRNATGF- mRNA表達(dá)的影響表達(dá)的影響 18小 結(jié) 體外研究結(jié)果表明體外研究結(jié)果表明: : 百令能促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞增殖，逆轉(zhuǎn)百令能促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞增殖，逆轉(zhuǎn)CsACsA引起引起的腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯，可能是百令的腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯，可能是百令防治防治CsACsA腎毒性作用的機(jī)制之一。腎毒性作用的機(jī)制之一。 初步研究還發(fā)現(xiàn)，相當(dāng)于體內(nèi)藥物濃度的環(huán)孢初步研究還發(fā)現(xiàn)，相當(dāng)于體內(nèi)藥物濃度的環(huán)孢霉素可促進(jìn)體外培養(yǎng)的霉素可促進(jìn)體外培養(yǎng)的HUVECHUVEC細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞表達(dá)TGF- TGF- mRNA mRNA

14、 ，為進(jìn)一步的研究提供了依據(jù)。，為進(jìn)一步的研究提供了依據(jù)。19二、大鼠體內(nèi)試驗部分20模型制作：模型制作： CsACsA 25mg/kg.d 25mg/kg.d 皮下注射皮下注射 4 4周周百令治療：百令治療：百令百令1.5g/ 1.5g/ kg.d ,kg.d ,口服口服4 4周周 百令提取液百令提取液1.5g/ 1.5g/ kg.dkg.d口服口服4 4周周觀察時間：觀察時間：4 4周周21表表 4 4 百令及其抽提液給藥后對環(huán)孢素百令及其抽提液給藥后對環(huán)孢素A A 腎毒性大鼠尿腎毒性大鼠尿NAGNAG酶酶(U/g.Cr)(U/g.Cr)的影響的影響 正常對照組正常對照組（n8）環(huán)孢素環(huán)孢

15、素A毒性毒性組（組（n8）百令治療組百令治療組（n8）百令抽提液治百令抽提液治療組（療組（n8） 1 周周21.2 7.740 16.6 #25.4 13.9 23.3 9.1* 2 周周17.6 4.544 13.6 #30.2 7 # * 34.9 9.2 # 4 周周19.3 540 12.1 #34.3 7.1 # 31.3 6.3 # #P0.05 vsP0.05 vs 正常對照組；正常對照組；# # P0.01 vsP0.01 vs 正常對照組正常對照組; ; * *P0.05 vsP0.05 vs 環(huán)孢素環(huán)孢素A A毒性組毒性組模型組尿NAG酶水平高于對照組,且呈持續(xù)性;治療組在

16、2周后尿NAG酶水平低于模型組,各組間比較有明顯差別.22表表6 6 百令及其抽提液給藥后對環(huán)孢素百令及其抽提液給藥后對環(huán)孢素A A 腎毒性大鼠尿鈉排泄（腎毒性大鼠尿鈉排泄（mmolmmol/L/L）的影響）的影響 正常對照組正常對照組（n8）環(huán)孢素環(huán)孢素A毒性毒性組（組（n8）百令治療組百令治療組（n8）百令抽提液治百令抽提液治療組（療組（n8） 1 周周 17.4 4.9 23.1 4.5 # 21.1 3.5 21.4 4.7 2 周周 18.1 4.9 24.9 5.6 # 19.3 3.9 * 21.6 6.4 4 周周 17.6 5.7 24.3 5.5 # 20.3 3.4 18

17、.1 5.8# #P0.05 vsP0.05 vs 正常對照組；正常對照組； * *P0.05 vsP0.05 vs 環(huán)孢素環(huán)孢素A A毒性組毒性組模型組尿鈉水平高于對照組,且呈持續(xù)性;治療組尿鈉略低于模型組,但無統(tǒng)計學(xué)差異.23表表7 7 百令及其抽提液給藥后對環(huán)孢素百令及其抽提液給藥后對環(huán)孢素A A腎毒性大鼠血清肌酐水平腎毒性大鼠血清肌酐水平( ( mol/Lmol/L) )的影響。的影響。 正常對照組正常對照組（n8）環(huán)孢素環(huán)孢素A毒性毒性組（組（n8）百令治療組百令治療組（n8）百令抽提液治療百令抽提液治療組（組（n8） 1 周周 59.4 4.4 68.1 7.2 #59.1 2.8

18、* 56.3 4.1* 2 周周 56.6 4 62.4 5.6 #55.8 2.9* 56.5 3.9* 4 周周 42.1 4.1 53.3 5.7 #47.5 2.9 #* 45.4 3*# # P0.05 vs P0.05 vs 正常對照組；正常對照組；# P0.01 vs P0.01 vs 正常對照組正常對照組; ; P0.05 vsP0.05 vs 環(huán)孢素環(huán)孢素A A毒性組毒性組, , * * * P0.01 vs P0.01 vs 環(huán)孢素環(huán)孢素A A毒性組毒性組模型組SCr水平與對照組比較均明顯增高,百令治療2組SCr水平明顯低于模型組,表明其預(yù)防SCr升高作用 24表表8 8

19、百令及其抽提液給藥后對環(huán)孢素百令及其抽提液給藥后對環(huán)孢素A A腎腎毒性大鼠血清膽固醇水平（毒性大鼠血清膽固醇水平（mmolmmol/L/L）的影響）的影響 正常對照組正常對照組（n8）環(huán)孢素環(huán)孢素A毒性毒性組（組（n8）百令治療組百令治療組（n8）百令抽提液治療百令抽提液治療組（組（n8） 1 周1.5690.3751.8490.1271.9550.0982.0420.258 2 周2.1460.2572.9710.214 #2.7540.3342.8430.211 4 周2.1140.3222.7730.486 #1.6310.346*1.4260.404*# P0.05 vs P0.05

20、vs 正常對照組正常對照組; ; * *P0.05 vsP0.05 vs 環(huán)孢素環(huán)孢素A A毒性組。毒性組。治療治療4 4周時周時CholChol明顯降低明顯降低25百令對百令對CsACsA誘導(dǎo)入球小動脈誘導(dǎo)入球小動脈TGFbetaTGFbeta表達(dá)的影響表達(dá)的影響 A A：正常對照組：正常對照組26百令對百令對CsACsA誘導(dǎo)入球小動脈誘導(dǎo)入球小動脈TGFbetaTGFbeta表達(dá)的影響表達(dá)的影響B(tài) B：CsACsA用藥組用藥組血管壁纖維素沉積27百令對百令對CsACsA誘導(dǎo)入球小動脈誘導(dǎo)入球小動脈TGFbetaTGFbeta表達(dá)的影響表達(dá)的影響C：百令保護(hù)組：百令保護(hù)組28百令對百令對Cs

21、ACsA誘導(dǎo)球囊壁誘導(dǎo)球囊壁FNFN表達(dá)的影響表達(dá)的影響A A：正常對照組：正常對照組29百令對百令對CsA誘導(dǎo)球囊壁誘導(dǎo)球囊壁FN表達(dá)的影響表達(dá)的影響B(tài) B：CsACsA用藥組用藥組30百令對CsA誘導(dǎo)球囊壁FN表達(dá)的影響C C：百令保護(hù)組：百令保護(hù)組31CsACsA誘導(dǎo)的小管空泡變性誘導(dǎo)的小管空泡變性32 CsACsA誘導(dǎo)的血管壞死誘導(dǎo)的血管壞死33百令百令用藥后小管病變改善用藥后小管病變改善( (再生再生) )34百令用藥后小管出現(xiàn)再生現(xiàn)象和血管病變改善百令用藥后小管出現(xiàn)再生現(xiàn)象和血管病變改善35結(jié) 論體內(nèi)及體外試驗均證明體內(nèi)及體外試驗均證明: :百令能有效減輕環(huán)孢霉素的腎毒性，其作用包

22、括：百令能有效減輕環(huán)孢霉素的腎毒性，其作用包括：1.1.促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的增殖、修復(fù)促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的增殖、修復(fù)2.2.逆轉(zhuǎn)環(huán)孢素引起的腎小管上皮細(xì)胞生長抑制逆轉(zhuǎn)環(huán)孢素引起的腎小管上皮細(xì)胞生長抑制3.3.防止環(huán)孢素用藥后引起的血清肌酐升高防止環(huán)孢素用藥后引起的血清肌酐升高4.4.減少環(huán)孢素中毒引起的腎小管細(xì)胞空泡變性和減少環(huán)孢素中毒引起的腎小管細(xì)胞空泡變性和 細(xì)胞壞死，減少間質(zhì)炎癥及纖維化。細(xì)胞壞死，減少間質(zhì)炎癥及纖維化。5.5.抑制環(huán)孢中毒后引起的抑制環(huán)孢中毒后引起的TGF-TGF- 表達(dá)增加，減少表達(dá)增加，減少 纖維連接蛋白在球囊壁和血管的沉積。纖維連接蛋白在球囊壁和血管的沉積。36冬蟲夏草拮抗細(xì)胞外基質(zhì)