實(shí)驗(yàn)四 植物DNA的提取

1、實(shí)驗(yàn)四 植物DNA的提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆誄TAB法從植物葉片提取DNA的原理和方法。采用CTAB法從植物葉片中提取基因組DNA，并進(jìn)行純度分析。二、實(shí)驗(yàn)原理1、核酸提取的基本原理 核酸是生物有機(jī)體中的重要成分，在生物體中核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分為脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)兩大類，在真核細(xì)胞中，前者主要存在于細(xì)胞核中，后者主要存在于細(xì)胞質(zhì)及核仁里。在制備核酸時(shí)，通過(guò)研磨破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使核蛋白被釋放出來(lái)。 在濃氯化鈉溶液(12 molL)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化鈉溶液(0.14 molL)中，DNA核蛋白的

2、溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同濃度的氯化鈉溶液將DNA核蛋白和RNA核蛋白從樣品中分別抽提出來(lái)。分離得到核蛋白后，需進(jìn)一步將蛋白等雜質(zhì)除去，常采用的去除蛋白的方法有3種：用含異戊醇的氯仿振蕩核蛋白溶液，使其乳化，然后離心除去變性蛋白質(zhì)，此時(shí)蛋白質(zhì)凝膠停留在水相和氯仿相中間，而DNA溶于上層水相。用兩倍體積的無(wú)水乙醇溶液將DNA鈉鹽沉淀出來(lái)。如果用酸性乙醇或冰乙酸來(lái)沉淀，得到的是游離的DNA。用十二烷基硫酸鈉(SDS)等去污劑使蛋白質(zhì)變性，與核酸分離，從而從材料中直接提取出DNA。用苯酚處理，然后離心分層，DNA溶于上層水相，蛋白變性后則停留在酚層內(nèi)。吸出上面水層，加兩倍

3、體積的無(wú)水乙醇溶液，得到白色纖維狀DNA沉淀。反復(fù)使用上述方法多次處理DNA核蛋白溶液，就能將蛋白等雜質(zhì)較徹底地除去，得到較純的DNA制品。為了徹底除去DNA制品中混雜的RNA，可用RNA酶處理。生物材料中含有的脂肪物質(zhì)和大部分的多糖，在用鹽溶液分離核蛋白和用乙醇或異丙醇分級(jí)沉淀時(shí)即被除去。在DNA提取、制備的過(guò)程中，核酸極不穩(wěn)定，許多因素可破壞其完整結(jié)構(gòu)：化學(xué)因素，核酸的結(jié)構(gòu)在pH值4.011.0間較穩(wěn)定，pH值在此范圍外就會(huì)使核酸變性降解，故制備過(guò)程應(yīng)避免過(guò)酸過(guò)堿。物理因素，DNA分子鏈很長(zhǎng)，是雙螺旋結(jié)構(gòu)，既有一定的柔性，又有一定的剛性，故強(qiáng)機(jī)械作用如劇烈攪拌會(huì)令DNA分子斷裂，不利于收集

4、，應(yīng)加以避免。酶的作用，細(xì)胞中普遍存在的核酸酶在細(xì)胞壁或膜遭到破壞時(shí)被釋放出來(lái)，它會(huì)降解DNA分子。故須用酶的變性劑、抑制劑使之失活。操作過(guò)程最好在低溫(0左右)下進(jìn)行。常用的酶抑制劑有檸檬酸鹽、氟化物、砷酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、(ETDA-Na)等。SDS和苯酚作為蛋白變性劑，同時(shí)可使核酸酶被破壞而失活。2、CTAB法和SDS法的提取原理 （1）CTAB法是一種快速簡(jiǎn)便的提取植物總DNA的方法.。CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）是一種陽(yáng)離子型去污劑，它不僅能使蛋白質(zhì)變性，而且還能與核酸形成特異的核酸-CTAB復(fù)合物，這種復(fù)合物溶于高鹽緩沖液（0.7M NaCl），降低鹽濃度，通過(guò)超速離心能選擇

5、性地沉淀核酸，并與多糖等可溶性雜質(zhì)分開，CTAB-核酸復(fù)合物再用70-75%乙醇浸泡可脫掉CTAB。提取時(shí)先將新鮮的葉片在液氮中研磨，破碎其細(xì)胞，然后加入CTAB分離緩沖液，將DNA溶解出來(lái)，再經(jīng)氯仿異戊醇抽提除去蛋白質(zhì)，最后通過(guò)異丙醇沉淀或低鹽離心得到DNA。（2）SDS法也是提取植物DNA的常用方法。先將新鮮的葉片在液氮中研磨以機(jī)械力破本碎細(xì)胞壁，然后加入SDS使細(xì)胞膜破裂，并同時(shí)將蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)與核酸分開。加入KAc可使SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式，使沉淀更加完全。3、DNA的濃度測(cè)定和純度分析（1）定磷法：是對(duì)樣品中核酸（DNA和RNA）含量的準(zhǔn)確定量。將樣品中的核

6、酸用強(qiáng)酸（硫酸或高氯酸）消化成無(wú)機(jī)磷，然后用定磷試劑對(duì)生成的無(wú)機(jī)磷酸進(jìn)行滴定。定磷試劑是酸性鉬酸銨溶液，鉬酸銨能與無(wú)機(jī)磷酸定量結(jié)合成磷鉬酸絡(luò)合物，該絡(luò)合物能被抗壞血酸等還原劑還原成蘭色的鉬藍(lán)，在660nm處有最大光吸收。（2）紫外光吸收法：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。1ug/mL的DNA溶液A260=0.020，1ug/mL的RNA溶液或單鏈DNA的A260=0.0220.024。1個(gè)A260相當(dāng)于50ug/mL的DNA、40ug/mL的RNA。蛋白質(zhì)的最大吸收在280nm，多糖的最大吸收在230nm。純的DNA的A260/A280在1.8左右，純的RNA的A260/A280在2

7、.0左右。三、試劑和器材：(1) 1M Tris-cl（pH8.0）：Tris l21.1g溶于蒸餾水，用濃HCl調(diào)至pH8.0以蒸餾水定容至1000ml (2) CTAB分離緩沖液： 2g CTAB，8.18g NaCL，0.74g EDTA.Na2.2H2O，10mL 1mol/L的Tris-HCL(pH8.0)，0.2mL巰基乙醇，加水定容到100mL。(3) 洗滌緩沖液（70%乙醇，10mmol/L乙酸銨）：70mL無(wú)水乙醇，0.077g乙酸銨，加水到100mL。(4) TE緩沖液：10mmol/L Tris-HCL（pH7.4），1mmol/L EDTA(5) 氯仿:異戊醇=24:1

8、(6) 液氮(7) 研缽，恒溫水浴（37100），離心機(jī)，離心管。四、操作方法：(1) 將10mlCTAB分離緩沖液加入50ml離心管中，置于65水浴中預(yù)熱。(2) 稱取1.5g葉片，置于預(yù)冷的研缽中，倒入液氮，盡快將葉片研碎。(3) 取1g粉末直接加入預(yù)熱的CTAB分離緩沖液中，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)使之混勻。(4) 樣品于65保溫30分鐘，每510分鐘混勻一次。(5) 加等體積（10ml）的氯仿異戊醇，輕輕顛倒混勻。(6) 室溫下4000r/min離心10分鐘。(7) 用膠頭滴管將上層水相吸入另一干凈的離心管中（注意不要吸動(dòng)懸浮的細(xì)胞碎片和中間白色的蛋白質(zhì)層），向離心管中加入2/3體積的異丙醇，輕輕混勻

9、，使DNA析出。（有些情況下，這一步可以產(chǎn)生云霧狀的DNA析出，如果看不到云霧狀的DNA，樣品則可以在冰浴中放置數(shù)小時(shí)甚至過(guò)夜）。(8) 用下述方法收集DNA：如果呈云霧狀的DNA析出，則用玻璃棒在云霧狀的DNA中輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，纏起DNA，然后將玻璃棒轉(zhuǎn)移至20mL洗滌緩沖液中浸泡洗滌10分鐘（不要將DNA沉淀從玻璃棒上弄掉）。如果看不到云霧狀的DNA，可將離心管在4000r/min離心5分鐘，小心地倒掉上清液，在松散的沉淀上加20mL洗滌緩沖液，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，洗滌核酸沉淀10分鐘，然后離心，小心地倒掉上清液，讓DNA沉淀自然干燥20分鐘。(9) 用玻璃棒纏出DNA，在室溫下使DNA自然干燥20分鐘。(10) 將自然干燥的DNA溶于1mLTE緩沖液中，20保存?zhèn)溆谩?11) 取100uL稀釋20倍，測(cè)定A260，A280，A230，或作出吸收波譜200400nm并計(jì)算濃度