生物物理技術的PPT

1、 鄒晶露 121601背景背景目的目的各種檢測方法各種檢測方法展望展望1234隨著科技的快速發(fā)展，納米材料因其特殊物理化學特性而被廣泛應用于化妝品、電學器件、染料、涂料及醫(yī)藥診斷等各個領域，尤其在生物醫(yī)藥領域的作用及其顯著，因此而備受關注，而人們對于納米材料對環(huán)境安全和人體健康所潛在的影響卻知之甚少。納米毒理學應運而生。 納米毒理學是專門研究納米顆?；虿牧隙拘缘膶W科, 運用一系列方法來分析納米材料在體內(nèi)和體外所產(chǎn)生的影響。本文就如何檢測這些毒性作用導致出現(xiàn)的特征對磁性納米顆粒的毒性檢測方法作一簡要綜述, 以供大家對納米材料的細胞毒性進行評價時作為參考。磁性納米顆粒對細胞產(chǎn)生毒性影響導致細胞的變

2、化有：炎癥、凋亡小體的產(chǎn)生、線粒體功能障礙、膜破裂導致乳酸脫氫酶的泄露、活性氧的產(chǎn)生、DNA損傷、染色體的濃縮等。圖1. 細胞毒性的反應1.1.針對線粒體功能障礙的檢測針對線粒體功能障礙的檢測1.1 MTT1.1 MTT法法原理：活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性 的藍紫色結晶甲臜(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。優(yōu)缺點： 靈敏度高，簡單，快速又簡單。 產(chǎn)生的甲臜產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。生成的甲瓚不易 充分溶解。測試后的細胞不能

3、繼續(xù)培養(yǎng)。 圖3. Morteza等用此法檢測到不同濃度SPIONs處理下心臟細胞，腦細胞，腎細胞數(shù)量的變化圖2.MTT處理后的顯微圖像2 CCK-82 CCK-8試劑盒法試劑盒法原理： WST-8是一種類似MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體的脫氫酶還原成橙黃色的formazan，用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，不需要裂解細胞，可直接進行比色。細胞毒性越大，則顏色越淺。顏色的深淺和細胞數(shù)目呈線性關系。優(yōu)點： 產(chǎn)生的formazan都是水溶性的，可以省去后續(xù)的溶解步驟CCK一8法檢測后細胞可重復利用，將細胞用生理鹽水洗2遍，加入培養(yǎng)液可繼續(xù)培養(yǎng)進行傳代，還

4、可進行染色和組化實驗等。3 3 Alamar Blue Alamar Blue 法法原理： 此試劑的主要成分是一種氧化還原指示劑其在氧化狀態(tài)下呈現(xiàn)紫藍色無熒光性，而在還原狀態(tài)下，轉變?yōu)槌史奂t或紅色熒光的還原產(chǎn)物，其吸收峰為530560nm。在細胞增殖過程中，細胞內(nèi)NADPH/NADP、 FADH/FAD、 FMNH/FMN和NADH/NAD的比值升高，處于還原環(huán)境。攝入細胞內(nèi)的染料被這些線粒體酶還原后釋放到細胞外并溶于培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基從無熒光的靛青藍變成有熒光的粉紅色。最后用普通分光光度計或熒光光度計進行檢測，吸光度和熒光強度與活性細胞數(shù)成正比。優(yōu)點： Alamar blue 法對細胞的毒性

5、小，對樣品破壞小、試劑用量少、操作簡單，特異性高、靈敏度高、重復性好。圖4.2. 2. 針對乳酸脫氫酶泄露的檢測（針對乳酸脫氫酶泄露的檢測（LDHLDH法）法）原理： LDH（乳酸脫氫酶）是一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，存在于正常細胞的胞質(zhì)中，正常情況下，LDH不能透過細胞膜，一旦細胞膜受損，LDH即被釋放到細胞外。此時培養(yǎng)液中 LDH 活性與細 胞死亡數(shù)目成正比。LDH 可使乳酸脫氫，進而使NAD還原成NADH，后者再經(jīng)遞氫體吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）還原碘硝基氯化四氮唑（INT），INT 接受H被還原成紫紅色甲臜類化合物。在酶標儀上用490nm比色測定。優(yōu)缺點： 此法測定迅速, 并且能夠進行定量分析。

6、但是乳酸脫氫酶是大分子, 只有靶細胞膜完全被破壞后才能釋放出來，不能較早的反映細胞的存活狀況。影響因素較多, 例如, 培養(yǎng)基、測定環(huán)境的溫度、pH、反應時間等。圖5.Soenen等用此法檢測了超順磁性納米顆粒等不同納米顆粒對PC 12細胞后細胞活力的變化。3. 針對細胞凋亡的檢測（形態(tài)學觀察）針對細胞凋亡的檢測（形態(tài)學觀察）在熒光顯微鏡下，吖啶橙染色后，活細胞核染色質(zhì)呈現(xiàn)均勻分布的黃綠色熒光, 胞質(zhì)呈橘紅色熒光，而凋亡細胞核染色質(zhì)的黃綠色熒光濃聚在核膜內(nèi)側。圖6.凋亡細胞的熒光顯微圖像4. 針對細胞壞死的檢測（細胞膜不完整）針對細胞壞死的檢測（細胞膜不完整）4.1 中性紅染色中性紅染色原理：

7、中性紅不帶電荷，可以被活細胞所攝入，并在溶酶體中積累。在細胞增殖加快時，細胞數(shù)量增多，可以攝入的中性紅的量就會增加。在細胞受到損傷時，中性紅的攝入能力會下降。這樣通過對于中性紅攝入量的不同就可以確定細胞的增殖或毒性情況，它在540nm出有較高的吸收值。4.2 臺盼藍染色臺盼藍染色原理： 臺盼藍是帶電荷的分子，不能進入正常的胞膜結構完整的活細胞；而喪失活性或細胞膜不完整的細胞，胞膜的通透性增加，臺盼藍就會進入細胞，將細胞染成藍色，并且在605 nm 波長處有較強的吸收。通過顯微鏡下直接計數(shù)或顯微鏡下拍照后計數(shù)，就可以對細胞存活率進行比較精確的定量。優(yōu)點： 借助臺盼藍染色可以非常簡便、快速地區(qū)分活

8、細胞和死細胞。用此方法檢測細胞毒性，可重復性好。圖7.臺盼藍染色后的顯微圖像4.3 乙酰氧甲基鈣黃綠素和溴化乙錠乙酰氧甲基鈣黃綠素和溴化乙錠原理： 乙酰氧甲基鈣黃綠素，是電中性的酯分子，可以通過擴散進入細胞，一旦進入細胞就會被酯酶轉化為帶綠色熒光的鈣黃綠素分子。相反，若細胞損壞或死亡，本身不能滲透進入細胞的溴化乙錠與核酸結合，可激發(fā)發(fā)紅色熒光，在495nm出激發(fā)，乙酰氧甲基鈣黃綠素和溴化乙錠分別在515nm、635nm熒光信號最明顯。圖8.熒光顯微圖像5. 針對針對DNA損傷的檢測（彗星電泳法）損傷的檢測（彗星電泳法）原理： 將單個細胞懸浮于瓊脂糖凝膠中，經(jīng)裂解、堿化處理后，再在電場中進行短時間的電泳，并用熒光染料染色，凋亡細胞中形成的DNA降解片段，在電場中泳動速度較快，使細胞核呈現(xiàn)出一種彗星式的圖案。 正常的無DNA斷裂的核在泳動時保持圓球形，彗星尾部即為遷移出類核的DNA片段。圖9.熒光顯微圖像大量研究表明，多種納米顆粒顯示其細胞生物毒性效應，因而納米材料的細胞生物毒性效應研究工作廣泛開展，但是其細胞毒性評價方法仍有缺陷，對于納