乳酸細(xì)菌于干酪生產(chǎn)

1、第二節(jié) 乳酸細(xì)菌于干酪生產(chǎn)一、 乳酸細(xì)菌的肽酶（一） 乳酸細(xì)菌在干酪后熟中的作用 乳酸菌在乳品發(fā)酵中起著十分重要的作用，并對產(chǎn)品的質(zhì)量和保藏有很大的影響。乳酸菌最主要的作用是將乳糖轉(zhuǎn)化為乳酸，降低PH，并通過水解蛋白質(zhì)，釋放短肽和游離氨基酸，影響乳制品的風(fēng)味和品質(zhì)。 乳球菌是干酪生產(chǎn)中廣泛使用的發(fā)酵劑，與凝結(jié)劑、乳內(nèi)源酶一起參與酪蛋白的轉(zhuǎn)化。酪蛋白水解是干酪成熟過程中品質(zhì)和風(fēng)味形成的關(guān)鍵。未產(chǎn)生料號的風(fēng)味，干酪需要較長的成熟期。在干酪生產(chǎn)中除了作為發(fā)酵劑的乳酸菌外，還有一些非發(fā)酵劑乳酸菌（NSLAB），NSLAB能減少苦味，增加游離氨基酸含量，促進(jìn)干酪成熟，NSLAB產(chǎn)生的氨肽酶具有降解苦味肽

2、的能力，可降干酪苦味。目前添加高活性蛋白水解能力的乳桿菌已被用來增強(qiáng)風(fēng)味，縮短干酪成熟期。 一般而言，乳制品中游離氨基酸和小肽濃度較低，乳酸菌生長時(shí)難以達(dá)到較高菌體密度，但乳酸菌能依靠自身蛋白水解系統(tǒng)將乳蛋白降解為有利氨基酸以滿足生長需要。乳酸菌的蛋白水解系統(tǒng)包括蛋白酶、酶結(jié)合運(yùn)輸系統(tǒng)以及細(xì)胞質(zhì)肽酶，對形成干酪風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)非常重要。乳球菌和乳桿菌是干酪生產(chǎn)中廣泛使用的發(fā)酵劑，在乳酸菌中發(fā)現(xiàn)有10多種不同類型的肽酶，并從乳酸菌和乳桿菌中克隆到多個(gè)肽酶基因。瑞士乳桿菌（lactobacillus helveticus）中的大多數(shù)肽酶，在乳酸乳球菌中均有相同類型的對應(yīng)物。但瑞士乳桿菌的總蛋白水解活性要

3、比乳酸乳球菌高。因此在用其他發(fā)酵劑加工干酪時(shí)，常常加入瑞士乳桿菌作為風(fēng)味添加劑。有利氨基酸不僅與形成干酪基本風(fēng)味有關(guān)，二姐還是形成芳香物質(zhì)的前體。瑞士乳桿菌的蛋白質(zhì)水解酶不僅可縮短干酪成熟時(shí)間，還可用于生產(chǎn)新風(fēng)味的干酪，改善低脂干酪的品質(zhì)。 對肽酶在分子水平上的研究，使其在不同乳酸菌中異源表達(dá)成為可能。如將瑞士乳桿菌編碼氨肽酶N(PEPN)、氨肽酶C（PEOC）、X脯氨酰二肽氨基肽酶（PEPD）的基因分別克隆到乳酸乳球菌MG1363中，研究這些基因在乳酸乳球菌中的表達(dá)能力。Luoma（2001）將瑞士乳桿菌的肽酶基因科龍到乳酸乳球菌中，研究蛋白水解活性的變化。講工業(yè)用瑞士乳桿菌53/7中的肽酶

4、基因pepN、pepX、pepC、pepI、pepD和pepR分別克隆到乳酸乳球菌及其肽酶突變株中，構(gòu)建具有新型能的生產(chǎn)菌株。（二） 肽酶的作用 瑞士乳桿菌肽酶pepN和pepC的底物是L-賴氨酸對硝基苯胺，pepI的底物是L-脯氨酸對硝基苯胺，pepX的底物是L-甘氨酸-脯氨酸對硝基苯胺，pepD的底物是亮氨酸-亮氨酸，pepR的底物是脯氨酸-亮氨酸。通過酶和底物的作用，對肽酶進(jìn)行分析研究。 乳桿菌能水解酪蛋白，給菌體提夠生長必需的氨基酸，通過構(gòu)建單個(gè)和多個(gè)肽酶缺失突變體，可以了解肽酶對乳酸乳球菌生長的影響，由于突變體不能鳳姐酪蛋白，會導(dǎo)致菌體在乳中生長緩慢，這說明了太美的重要性。 在含葡萄

5、糖的M17（GM17）培養(yǎng)基上，各個(gè)菌株的生長曲線無顯著差異。在牛乳中生長時(shí)，乳酸乳球菌肽酶突變株的數(shù)量減少。瑞士乳桿菌pepN（Pkth2172）能使肽酶突變株恢復(fù)或接近野生型君主的生長水平，這表明生長缺陷乳酸乳球菌太沒突變株可用相應(yīng)的瑞士乳桿菌基因補(bǔ)充。瑞士乳桿菌pepN能補(bǔ)充乳酸乳球菌的5種肽酶缺陷型，這與pepN廣譜的水解能力相一致。但瑞士乳桿菌的pepX或pepC不能使MG1363XTOCN突變菌在牛乳中正常生長。在含pepN、pepX、pepC、pepI的重組子的酶活增高，而含有pepD和pepR的重組子的酶活沒有變化。在GM17和牛乳中的兩種培養(yǎng)基中pepN的活性均約為1U/mg

6、蛋白。在低拷貝數(shù)數(shù)載體中，瑞士乳桿菌的肽酶基因（pepN）的表達(dá)水平最高，與野生型乳酸乳球菌相比，pepN的活性增加了25倍。 在GM17培養(yǎng)基中，重組子pepX的活性是宿主乳球菌pepX的5倍，而在牛乳中重組體活性顯著下降。在GM17和牛乳中重組體的pepC活性均是宿主菌株的2倍，而pepI在GM17和牛乳中的活性幾乎相同。 無論是在野生型還是在肽酶負(fù)突變株乳酸乳球菌中，瑞士乳桿菌pepN、pepX、pepC轉(zhuǎn)錄水平無顯著差異。pepN在乳酸乳球菌中的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是在瑞士乳桿菌中的10倍，而pepX、pepC在乳酸乳球菌中的轉(zhuǎn)錄水平比瑞士乳桿菌中低。不是所有來自瑞士乳桿菌肽酶的啟動子都能在乳酸乳

7、球菌中起作用，有些啟動子在乳酸乳球菌中不能識別，這與兩者的啟動子共有序列不同有關(guān)。對pepD和pepR在PnisA控制下的表達(dá)進(jìn)行研究，當(dāng)nisin濃度為5ng/ml時(shí)，重組體中肽酶活性最高，但nisin濃度繼續(xù)增加會導(dǎo)致生長受阻和太沒活性下降。Wegmann(1999)在PnisA控制下，成功地講德氏乳桿菌乳亞種的4個(gè)肽酶基因pepI、pepL、pepW、pepG在乳酸乳球菌中表達(dá)，這些基因在乳酸乳球菌中均無對應(yīng)物。這表明乳酸乳球菌的蛋白水解系統(tǒng)能用乳桿菌中肽酶基因調(diào)解。二、食品及重組體的肽酶活性 Joutsjoki等（2002）模擬干酪成熟過程的環(huán)境，對肽酶活性進(jìn)行了研究。以L-賴氨酸硝基

8、苯胺為第五測定pepN、pepC的活性，以L-甘氨酸-脯氨酸硝基苯胺為第五測定PepX的活性，以L-脯氨酸硝基苯胺為底物測定pepI的活性。pepN的反應(yīng)條件是50mmol/LMES，ph6.5,45；pepI的反應(yīng)條件是50mg/L Tris-HCL,ph7.5,37。在測定PepC時(shí)，用5mmol/L EDTA抑制PepN的活性。同時(shí)在模擬干酪成熟條件下（4%Nacl、125mmol/LCaCl2、pH5.2）測定肽酶的活性。 含有pepN、pepC、pepX和pepI積陰德轉(zhuǎn)化子乳酸乳球菌DN209在不含嘌呤的合成培養(yǎng)基17h后，菌體內(nèi)的肽酶活性顯著增加。含肽酶基因的乳酸乳球菌NM1在牛

9、乳培養(yǎng)基上盡管比乳酸乳球菌DN209的稍低，但其肽酶活性明顯增加。 在模擬切達(dá)干酪成熟的條件下（4%Nacl、125mmol/LCaCl2、pH5.2），分別測定pepN、pepX和pepI在重組體中的活性。在合適pH（6.57.5），不含Nacl或4%NaCl時(shí)，重組體中pepN的活性是不加Nacl時(shí)的一半，而在干酪成熟條件下，活性為最適pH的5%。與pepN、pepX不同的是pepI在有NaCl時(shí)活性增加，在干酪成熟條件下，其活性也比pepN、pepX高很多。由于pepC在重組體中活性很低，沒有進(jìn)行分析。 比較食品級重組體與非食品及重組體的肽酶活性，兩者的pepN活性很近，食品級重組體的p

10、epC活性只有非食品級重組體的一半，而pepX和pepI活性顯著高于非食品級重組體，這可能是食品級重組體中增量調(diào)節(jié)pepX和pepI活性所致。 調(diào)控乳球菌蛋白水解系統(tǒng)是獲得優(yōu)良生產(chǎn)菌種的有效途徑，如瑞士軟桿菌的肽酶基因克隆到乳酸乳球菌中，能顯著促進(jìn)干酪成熟過程中蛋白的水解。單把水解產(chǎn)生的氨基酸是芳香物質(zhì)的主要來源，所以改變不同類型氨基酸釋放代謝水平，對改善產(chǎn)品的風(fēng)味有著很大影響。第三節(jié) 活性物質(zhì)的合成與調(diào)控 一、葉酸（一）葉酸的性質(zhì)葉酸是含有蝶酰谷氨酸結(jié)構(gòu)的一類化合物的統(tǒng)稱，天然食品中的葉酸多以蝶酰多谷氨酸的新方式純在。也算是一種人體必需營養(yǎng)素，在體內(nèi)的活性形式是四氫葉酸，它是體內(nèi)重要生化過程

11、中碳單位的運(yùn)載體，元計(jì)算、嘌呤和嘧啶的合成有關(guān)。葉酸缺乏會導(dǎo)致生理失調(diào)，此外，葉酸還有抗心血管疾病和抗癌作用。葉酸缺乏是一個(gè)比較普遍的現(xiàn)象，成人每日也算推薦攝入量為400ug,孕婦推薦攝入量為600ug。許多植物、真菌和細(xì)菌都能合成葉酸，一些乳酸菌也能產(chǎn)生葉酸，因此發(fā)酵乳制品中葉酸的含量要高于非發(fā)酵乳制品。 代謝工程可通過是某些基因失活，或者所需基因的超量表達(dá)，已達(dá)到調(diào)控代謝的目的。NICE系統(tǒng)在調(diào)控乳酸乳球菌的異源或同源基因的表達(dá)十分有用。要設(shè)計(jì)合理的代謝工程途徑，首先需要了解相關(guān)的代謝途徑和基因。近年來報(bào)道了應(yīng)用代謝工程來產(chǎn)生代謝途徑復(fù)雜的胞外多糖和葉酸等產(chǎn)物。也算的合成包括糖酵解途徑、戊

12、糖磷酸途徑、生成對氨基酸苯甲酸的莽草酸途經(jīng)和生成鳥苷三磷酸的飄零代謝，在最終組裝葉酸和其衍生物還需要許多特異的酶反應(yīng)步驟。四氫葉酸生物合成途徑。 乳酸乳球菌能夠合成葉酸，主要以聚谷氨酰葉酸的形式積累在細(xì)胞內(nèi)，僅僅有少量葉酸釋放到胞外。乳酸乳球菌乳酸亞種IL1403基因組中有編碼葉酸生物合成圖景基因的葉酸基因簇。乳酸乳球菌乳酸亞種MG1363和乳酸乳球菌乳酸亞種IL1403在基因組水平上有很高的同源性，但并不完全相同。Sybesma(2003)研究了MG1363中的葉酸基因簇，并通過代謝工程來提高葉酸產(chǎn)量。（二） 葉酸基因簇及有關(guān)基因的克隆乳球菌治理pNZ8048是一個(gè)轉(zhuǎn)錄融合載體，可應(yīng)用于ni

13、sin調(diào)控的表達(dá)系統(tǒng)中。該載體含有一個(gè)nisA啟動子和一個(gè)NcoI克隆位點(diǎn)。用引物FolKE-F和FolKE-R從染色體DNA上擴(kuò)增到folKE基因，擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后克隆到pNZ8048上，得到pNZ7010。從染色體DNA上擴(kuò)增到folC基因，擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后克隆到pNZ7010 folKE的下游，得到pNZ7011.從染色體DNA上擴(kuò)增到folP基因，擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后克隆到pNZ7010 folKE的下游，得到pNZ7012.從染色體DNA上擴(kuò)增到folA基因，擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后克隆到pNZ8048 上，得到pNZ7013，在克隆folA的發(fā)表一RNA基因，得到質(zhì)粒pNZ7014，該質(zhì)粒含有一個(gè)組成

14、型啟動子和nisin誘導(dǎo)啟動子，兩者被一個(gè)終止子分開（pNZ8161）。具體方法是從染色體DNA上擴(kuò)增到pepV的終止子，擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后克隆到pNZ8048上，得到pNZ8160，然后擴(kuò)增得到pepN的組成啟動子，擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后克隆到pNZ8160上，得到pNZ8161。從染色體DNA上擴(kuò)增到folA基因，擴(kuò)增產(chǎn)物用SphI8161上，得到pNZ7017，folKE基因在pepN的組成啟動子調(diào)控之下。所有之力都分別轉(zhuǎn)化NZ9000中（三） 也算基因和葉酸合成的關(guān)系在葉酸基因簇中只有56個(gè)基因與葉酸生物合成有關(guān)，folA編碼二氫葉酸還原酶，folB可能編碼新喋呤醛縮酶，folK可能編碼2-氨基-

15、4-羥基-6-羥甲基二氫蝶呤焦磷酸激酶，folE可能編碼GTP環(huán)水解酶，folP可能編碼二氫蝶酸合成酶folC可能編碼葉酸合成酶或葉酰聚谷氨酸合成酶，cipX可能編碼ATP結(jié)合蛋白，dukB可能編碼脫氧核苷激酶，hom編碼高絲氨酸脫氫酶，ysxC和ylgG均編碼為脂蛋白。clpX、dukB、hom、ysxC和ylgG與葉酸生物合成無關(guān)。 GTP環(huán)水解酶I是葉酸生物合成途徑的第一個(gè)酶。與未誘導(dǎo)菌株相比，含pNZ7010的pNZ9000的菌株超量表達(dá)folKE引起細(xì)胞外液酸濃度增加1080ng/ml，產(chǎn)量增加10倍，而含pNZ8048的pNZ9000對照株在nisin誘導(dǎo)時(shí)胞外葉酸濃度沒有變化，細(xì)

16、胞內(nèi)也沒產(chǎn)生聚谷氨酰葉酸。同樣的誘導(dǎo)條件下，與對照菌株以及未誘導(dǎo)菌株相比，超量表達(dá)folKE基因只因其細(xì)胞內(nèi)葉酸少量增加，而超量表達(dá)folKE的乳酸乳球菌葉酸總量增加2倍。增加的葉酸主要以單谷氨酰葉酸、二谷氨酰葉酸和三谷氨酰葉酸的形式存在于細(xì)胞外，只是因?yàn)槌勘磉_(dá)folKE，葉酸合成酶或聚谷氨酰葉酸合成酶不能將杜宇的葉酸轉(zhuǎn)變成聚谷氨酰的形式。使用誘導(dǎo)啟動子系統(tǒng)可以研究葉酸生物合成酶的表達(dá)水平的作用，發(fā)酵菌株最好使用組成型啟動子，pepN組成新啟動子表達(dá)folKE與NICE系統(tǒng)的結(jié)果相同，表達(dá)組成新啟動子不僅可以表達(dá)葉酸合成的有關(guān)基因，而且可以提高葉酸含量。 細(xì)胞內(nèi)外的葉酸分布受單谷氨酰葉酸和聚

17、谷氨酰葉酸比例的調(diào)控，有folC編碼的聚谷氨酰葉酸合成酶負(fù)責(zé)合成聚谷氨酰葉酸。含pNZ7011的pNZ9000菌株同時(shí)超量表達(dá)folKE和folC，葉酸總量增加與單獨(dú)超量表達(dá)folKE相同，但兩者產(chǎn)生的葉酸分布不同。folKE和folC同時(shí)超量表達(dá)時(shí)增加的葉酸主要存在于胞內(nèi)，這是因?yàn)橥瑫r(shí)超量表達(dá)folKE和folC時(shí)，葉酸合成酶促進(jìn)了聚谷氨酰葉酸的形成并存在于胞內(nèi)，對胞內(nèi)葉酸進(jìn)行脫聚合處理，未見葉酸濃度增加，說明同時(shí)超量表達(dá)folKE和folC對3個(gè)以上谷氨酸殘基的聚谷氨酰葉酸的量沒有明顯影響。 誘導(dǎo)含有pNZ7011的pNZ9000菌株，超量表達(dá)folA，與對照菌株后為誘導(dǎo)的菌株相比，葉酸產(chǎn)

18、量降低2倍，表明葉酸在生物合成時(shí)有反饋抑制作用。胞內(nèi)葉酸的分布和聚谷氨酰葉酸的量均沒有變化。未了解folA反義RNA超量表達(dá)對葉酸產(chǎn)量的影響，將folA編碼鏈的互補(bǔ)序列克隆到pNZ8048上，5端開始于folA終止密碼子的互補(bǔ)序列，3端終止于folA起始密碼子的互補(bǔ)序列，得到pNZ7014，并轉(zhuǎn)化到pNZ9000中。在誘導(dǎo)條件下，與對照菌株相比，葉酸總量增加20%。含pNZ7014的pNZ9000菌株細(xì)胞提取物Hong二氫葉酸還原酶活性降低2倍，而超量表達(dá)folA的乳酸乳球菌的二氫葉酸還原酶活性比對照菌株增加1000倍。因此，通過選擇性調(diào)控葉酸合成有關(guān)酶的表達(dá)，可以獲得產(chǎn)葉酸水平較高的乳酸菌，

19、不僅可以用于葉酸的發(fā)酵生產(chǎn)。二、共軛亞油酸（一） 共軛亞油酸的結(jié)構(gòu)和性質(zhì) 共軛亞油酸是指一組位置和幾何異構(gòu)體的十八碳共軛二烯酸的統(tǒng)稱。自然界中，CLA主要傳在于瘤胃動物的肉和乳中，其中主要是9c，11t異構(gòu)體，以及t10，c12異構(gòu)體。CLA可利用微生物生物合成，也可用化學(xué)方法合成，但得到的都是幾種異構(gòu)體的混合物?；瘜W(xué)合成的CLA異構(gòu)體的組成更加復(fù)雜。 1987年P(guān)ariza等發(fā)現(xiàn)牛肉提取物具有抑制誘變劑作用的活性，進(jìn)一步證實(shí)這種活性物質(zhì)就是CLA。此后的研究表明CLA具有多種生物活性：抗癌抗突變；免疫調(diào)節(jié)；改變身體組成，如減少脂肪，增加肌肉；康動脈粥樣硬化和型糖尿病，以及減肥、促進(jìn)骨組織代謝

20、等。 CLA可抑制苯芘誘導(dǎo)小鼠前胃癌，其可能的抗癌機(jī)制是通過原位防御作用來防止膜收到自由基的攻擊。對1,2-二甲基肼處理過的大鼠飼喂CLA，可顯著降低結(jié)腸癌發(fā)病率，CLA抑制DMH誘導(dǎo)的結(jié)腸的機(jī)制可能和促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。 動物實(shí)驗(yàn)表明CLA有減肥作用，分別研究9c，11t-CLA和t10，12c-CLA對小鼠身體成分的影響，發(fā)現(xiàn)CLA的減肥作用與t10，12c-CLA有關(guān)。用PPARa失活的雄性小鼠與野生型小鼠進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)CLA能提高編碼脂質(zhì)代謝和線粒體解偶聯(lián)蛋白mRNA的水平，這可能是CLA調(diào)控脂質(zhì)體內(nèi)平衡的主要機(jī)制（二） 乳酸細(xì)菌與共軛亞油酸的生產(chǎn)已從乳酸菌種篩選到一些能形成共軛亞油酸的

21、菌株。Pariza等從飼喂亞油酸的老鼠腸道菌群中篩選到一株路氏乳桿菌能將亞油酸異構(gòu)化成9c，11t-CLA，但不生成10t，12t-CLA。Ham等從健康嬰兒糞便中分離到一株產(chǎn)生較高CLA的發(fā)酵乳桿菌。Kishino發(fā)現(xiàn)一株能將亞油酸轉(zhuǎn)化成CLA的植物乳桿菌AKU1009a，在含12%（m/M）亞油酸的反應(yīng)液中反映108h，CLA的產(chǎn)率為33%，其異構(gòu)體有2種組成，9c，11-CLA（或9t，11c-CLA）占38%，9t，11c-CLA占62%；在含2.6%（m/M）亞油酸的反應(yīng)液中反映96h，CLA的產(chǎn)率為80%，9c，11t-CLA(或9t，11c-CLA）占2%，9t，11t-CLA占98%。 研究了14株乳酸菌的發(fā)酵條件，發(fā)現(xiàn)乳酸乳球菌在添加劑葵花籽油的全脂乳培養(yǎng)基上形成CLA的能力最強(qiáng)，最適葵花籽油添加量為0.1g/L，CLA的形成受菌體量、培養(yǎng)時(shí)間、第五濃度、pH等因素影響。（三） 乳酸細(xì)菌中亞油酸異構(gòu)酶的性質(zhì)和基因克隆 對嗜酸乳桿菌和費(fèi)氏丙酸桿菌中亞